Методическая статья

Использование MALDI-TOF масс-спектрометрии и пользовательскую базу данных для характеристики бактерий из числа коренных народов уникального пещерного окружающей среды (Kartchner Пещеры, AZ, США)

DOI:

10.3791/52064

⸱

2 января 2015 г.

 ,  ,  , 
1School of Mathematical and Natural Sciences, Arizona State University, 2Applied Maths NV

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой работе подробно описаны процедуры быстрой идентификации бактерий с помощью MALDI-TOF MS. Процедуры идентификации включают в себя получение спектра, построение базы данных и последующий анализ. Представлены два метода идентификации: на основе коэффициента подобия и на основе биомаркеров.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Было показано, что масс-спектрометрия

MALDI-TOF является быстрым и надежным инструментом для идентификации бактерий на уровне рода и вида, а в некоторых случаях и штамма. Для облегчения идентификации были разработаны коммерчески доступные программные инструменты с открытым исходным кодом; Тем не менее, в литературе не описан универсальный/стандартизированный конвейер анализа данных. В этой статье мы предоставляем всестороннюю и подробную демонстрацию процедур идентификации бактерий с помощью масс-спектрометра MALDI-TOF. Масс-спектры были собраны у 15 разнообразных бактерий, выделенных из пещер Картчнера, штат Аризона, США, и идентифицированы с помощью секвенирования 16S рДНК. Базы данных были построены в BioNumerics 7.1. Был проведен последующий анализ масс-спектров, включая кластерный анализ, сопоставление пиков и статистический анализ. Идентификация проводилась с использованием слепо кодированных образцов, случайно выбранных из этих 15 бактерий. Представлены два метода идентификации: на основе коэффициента подобия и метод, основанный на биомаркерах. Результаты показывают, что оба метода идентификации могут идентифицировать бактерии на видовом уровне.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Матричная лазерная десорбция/ионизация времяпролетной масс-спектрометрии (МС) показала себя быстрым и надежным инструментом для идентификации бактерий на уровнях рода, вида и, в некоторых случаях, штамма1-4. MALDI-TOF MS ионизирует биологические молекулы (обычно белки), которые происходят с поверхности клеток, внутриклеточных мембран и рибосомы из цельных бактериальных клеток или белковых экстрактов1,5. Образующиеся пики образуют характерные узоры или «отпечатки пальцев» анализируемых бактерий1. Идентификация бактерий основана на этих «отпечатках пальцев».

Две наиболее часто используемые стратегии идентификации — это стратегии, основанные на библиотеках, и стратегии, основанные на биоинформатике1. Подходы, основанные на библиотеках, включают в себя сравнение масс-спектров неизвестных с ранее собранными масс-спектрами известных бактерий в базах данных/библиотеках для идентификации. Коммерчески доступное программное обеспечение, такое как пакеты программного обеспечения BioNumerics, Biotyper и SARAMIS, а также программные инструменты с открытым исходным кодом, такие как SpectraBank6, доступны для облегчения сравнения и количественной оценки сходства между масс-спектрами неизвестных и эталонных бактерий. Подходы, основанные на биоинформатике, обычно опираются на полностью секвенированные геномы бактерий для идентификации. В отличие от подходов, основанных на библиотеках, которые не предполагают идентификации биологической природы конкретных пиков, подходы, основанные на биоинформатике,включают идентификацию белков.

Большинство недавних исследований на основе отпечатков пальцев MALDI использовали библиотечные подходы для идентификации бактерий1. Библиотечные подходы требуют построения баз данных и сравнения сходства между масс-спектрами. Исследования показывают, что многие экспериментальные методики, такие как среда3,7, время культивирования8, метод подготовки образцов3 и используемая матрица9, влияют на получаемые масс-спектры. Кроме того, некоторые близкородственные виды и штаммы генерируют спектры с незначительными различиями. Таким образом, подходы, основанные на библиотеках, требуют строго стандартизированных процедур для получения высоковоспроизводимых масс-спектров между репликациями. Незначительные вариации в протоколах могут поставить под угрозу эффективность идентификации, особенно на уровнях подвида и штамма1,3,10. Однако ни справочные базы данных, предоставленные производителем, ни специализированные базы данных не содержат визуально задокументированных процедур для создания базы данных и/или применения конвейера анализа данных. По этой причине целью данной работы была разработка, применение и демонстрация всеобъемлющей и подробной процедуры идентификации бактерий на основе библиотеки с использованием MALDI-TOF MS.

В этой демонстрации были собраны масс-спектры 15 бактерий, выделенных из карстовой среды (пещера Картчнера, AZ, США) и импортированы в программное обеспечение для создания модельной базы данных. Обработка данных и конвейер анализа были детализированы с использованием базы данных модели. Наконец, масс-спектры слепо кодированных бактерий, которые были случайно выбраны из этих 15 бактерий, были снова собраны и сравнены с референсными спектрами в модельной базе данных для идентификации. Результаты показывают, что бактерии могут быть правильно идентифицированы либо на основе коэффициентов сходства, либо на основе потенциальных биомаркеров/пиковых классов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внимание: Неизвестные бактерии из любой среды может быть патогенным и должны быть обработаны с осторожностью, используя соответствующие протоколы биобезопасности. Работа с живыми культурами должны быть выполнены в корпусе класса II биобезопасности с помощью биологической безопасности уровня 2 (BSL-2) процедуры. Более подробная информация о BSL-2 процедур доступен в руководстве CDC / NIH под названием "биобезопасности в микробиологических и биомедицинских лабораториях," страниц 33-38. Документ доступен в Интернете по адресу http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf . Соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), в том числе халатах / платья, защитные очки и нитрильных или латексные перчатки, должны носить. Стандартные микробиологические методы и меры предосторожности должны быть соблюдены, и биологически опасные отходы должны быть уничтожены соответственно.

Бактерии, используемые в этой демонстрации были выделены из Kartchner пещеры,AZ, USA, один из четырех сред, в том числе сухой Натёчные образования, расход камня, влажной Натёчные образования и сталактитов капельно (таблица 1). Все изоляты были идентифицированы 16S рДНК последовательности и выдерживают при -80 ° С в 25% глицерин-R 2 B среде. Все эксперименты были выполнены при комнатной температуре.

Примечание: Мы рекомендуем использовать тот же метод подготовки пробы приобрести масс-спектры для строительства базы данных и масс-спектров неизвестных. Пример способ получения, как было показано ранее, чтобы повлиять на качество спектра и воспроизводимость 3. Использование другого метода подготовки образца может привести к неправильной идентификации неизвестных, особенно при более высоких таксономических разрешение (например, на уровне деформации) желательно.

1. Нанесение на MALDI мишени

Внимание: несколько протоколов, чтобы получить белковые экстракты требуют использования кислот и органических растворителей, которые должны быть использованы в соответствии с GUIDelines и информация, содержащиеся в соответствующих листов по безопасности применения материалов (MSDS). Соответствующие средства индивидуальной защиты должны носить и будет варьироваться в зависимости от типа и объема используемых химикатов (например, халатах / платья, перчатки, защитные очки и средства защиты органов дыхания должны быть использованы при работе со значительными количествами токсичных, легковоспламеняющихся растворителей, таких как ацетонитрил, и коррозионные кислоты, такие как муравьиная и трифторуксусной кислоты).

  1. Депозит 1 мкл белкового экстракта, не содержащего жизнеспособные клетки (полученные с использованием соответствующих, описанных ранее протоколов 11-13) на нержавеющей стали MALDI целевой пластины и дайте ему высохнуть. Наложение сухого экстракта белка с раствором матрицы 1 мкл (α-циано-4-гидрокси-коричной кислотный раствор), и дайте ему высохнуть.
  2. Для каждого биологического репликации, место соответствующее количество технических повторов (от 5 до 20 технические Копировщиков). Здесь, место 10 технических повторов для каждого биологического репликации и 3 биологических повторяет Wпрежде чем подготовлены.
    Примечание: Мы рекомендуем использовать полированную MALDI стали мишень при использовании метода пробоподготовки экстракции белка. Использование шлифованной стали целевые пластины может привести к распространению и непреднамеренное смешение различных проб за пределами отдельных образцов скважин.
  3. Депозит 1 мкл калибрующего стандарт на целевой пластине и дайте ему высохнуть. Наложение с матричным раствором 1 мкл и дайте ему высохнуть.
  4. Депозит 2 мкл раствора матрицы на целевой пластине в качестве отрицательного контроля.

2. Масс-спектр Приобретение

  1. Используйте масс-спектрометра MALDI-TOF оснащен лазерным азота (λ = 337 нм) и управляется с помощью программного обеспечения Bruker Flexcontrol.
  2. Соберите каждый масс-спектр в положительном линейном режиме накоплением 500 лазерных выстрелов в 100 с шагом выстрел. Установите напряжение источника ионов 1 до 20 кВ; ионный источник 2 напряжения 18,15 кВ; и объектив напряжения 9,05 кВ. Обратите внимание, что эти параметры являются инструментом, удельнаяFIC и может потребовать корректировки на другие инструменты для получения оптимальных результатов.
  3. Установите диапазон массы к заряду для автоматизированного оценки спектра от 2 до 20 кДа на одной зарядке. Используйте центра тяжести алгоритм пик обнаружения. Установите минимальное разрешение порог в 100 Da. Установите сигнал-шум (S: N) порога, при 2. Установите порог минимальной интенсивностью 100.

3. База данных Строительство

  1. Проектирование базы данных
    1. Создать новую базу данных в BioNumerics 7,1 с помощью «Мастера нового базы данных".
    2. Создать спектра типа эксперимента, например, MALDI, с помощью команд "Типы эксперимент" панели.
    3. Создавайте уровни с помощью "проектирования баз данных панели". Добавить новые уровни с помощью «уровня> Добавить новый уровень ..." в меню "База данных". Здесь, создавать «видов» уровне, уровне «Биологические REPLICATE" "и" Технические REPLICATE "Level respectivЭли.
  2. Импорт и предварительной обработки спектров сырой массы
    1. Экспорт сырой масс-спектры, как .txt файлов с помощью FlexAnalysis, нажав на команду "Экспорт> Масс-спектр" в меню "Файл".
    2. Импорт сырой масс-спектры (файлы с расширением .txt) в базе данных по уровню технических повторяет.
    3. Предварительная обработка спектров сырой массы.
      1. Импорт и частоты дискретизации (используя квадратичную алгоритм подбора).
      2. Выполнение базового вычитание (с прокатки диска с размером 50 пунктов).
      3. Вычислить шум [Непрерывный вейвлет-преобразования (CWT)], гладкая (Kaiser окно с размером окна 20 пунктов и бета 10 очков), а также выполнять второй Вычитание (прокат диск с размером 200 точек).
      4. Обнаружение пиков [CWT с минимальным отношением сигнала к шуму (S: N) из 10].
    4. После предварительной обработки, сохранения характерные модели каждого масс-спектра, такие как пик списков, содержащих пикразмеры, пик интенсивности, S: N, и т.д., в базе данных.
  3. Создание составного масс-спектров
    1. Создать составной спектры от предварительно обработаных спектров с помощью команды "подвести итог ..." в меню "Анализ". Выберите «Биологический копировщика" как целевого уровня.
    2. Здесь, объединить масс-спектры 10 технических повторов одного и того же колонии для получения композитного масс-спектр для этого колонии, в результате чего три композитных масс-спектров для этого изолята на уровне «Биологические реплик".
    3. Здесь приводится краткое описание трех композитный спектры для создания одного составного спектра для этой изолировать на уровне «видов».
      Примечание: композитный спектр средняя точка за точкой технических повторяет. Репликация с подобия (корреляции Пирсона) в среднем ниже, чем 95% (значение по умолчанию) исключены из композита. Пики на спектрах композитного только вызывается, если они присутствуют в 75% (настройка по умолчанию) включенных повторов. Для биологических повторностей, эти параметры были 90 и 60%, соответственно.

Анализ 4. Массовая спектральных данных

  1. Выберите записи в базе данных и создать сравнение, нажав на команду «Создать новый сравнение" в "Сравнения" панели.
  2. Вот, используйте масс-спектры в разделе "Технические репликации" и / или "Биологическое повторных" уровней, чтобы показать сравнения и анализа.
  3. Сходство на основе кластерного анализа и многомерное шкалирование (MDS)
    1. Создание групп с цветами. Выберите биологических спектров двух композитных масс и нажмите кнопку "Создать новую группу из выделения" команды в меню "Группы", чтобы создать группу для соответствующего изолята. Назначить цвет автоматически, используемые для этих трех масс-спектров.
    2. Кроме того, определить состояний поля с соответствующими цветов с помощью команды в "База данных записей "панели, таких, что любая группировка на основе этого определенного поля используется тот же цвет, определенный для этой группы.
    3. Выполните кластерный анализ. Выберите команду "Вычислить кластерный анализ" в меню "кластеризации". На настроек сравнения Страница 1, выберите "корреляции Пирсона" и оставить другие параметры по умолчанию. На странице 2, выберите "UPGMA". Затем нажмите кнопку "Готово".
    4. Получить участок MDS, используя "многомерного шкалирования ..." в меню "Статистика".
  4. Пик соответствия
    1. Щелкните на типе спектра "MALDI" в "Опыты" панели. Затем выберите "Макет> Показать изображение". Спектры показаны как гель полос.
    2. Выполните пик соответствия, используя команду "Do пик соответствия" в меню "Spectra".
  5. Идентификация пиков классов
    1. Выполните анализ главных компонент (PCA). Выделите "MALDI "типа эксперимент в" экспериментальной "панели и использовать" Основные компоненты Анализ ... "в меню" Статистическом "для выполнения СПС.
    2. Выполните двустороннюю кластеризацию. Нажмите "Статистика> Горно-матрицы" ... в окне "Сравнение". Интенсивность пиков подобранных к пиковым классов представлены с использованием различных цветов (тепловая карта).

5. Бактерии Идентификация с пользовательской базы данных

  1. Сходство коэффициентный метод на основе
    1. Создать сравнение и генерировать дендрограмму на основе масс-спектров на уровне "Технические реплик», как описано в шаге 4.3.3. Сохраните дендрограмму для сравнения сходства.
    2. Выберите неизвестный масс-спектр, и нажмите кнопку "Анализ> Определить выбранные записи". Появится диалоговое окно идентификации.
    3. Выберите "Сравнение на основе" тип классификатору (или хранимой объявлМЭО) и нажмите "Далее". На следующей странице выберите сохраненный дендрограмму в качестве эталонного сравнения, а затем нажмите "Далее".
    4. Выберите "принципиальное сходство" как метод идентификации и нажмите кнопку "Далее".
    5. Выберите "Максимальная сходство» как метод скоринга. Введите соответствующие пороговые значения и минимальные значения разности для каждого параметра, а затем нажмите "Далее".
    6. После того, как расчеты завершены, появляется окно идентификации. В «Результаты» панели, члены базе данных, которая наилучшим образом соответствуют неизвестное перечислены.
    7. Сохранить в определение проекта и проверки идентификации, используя команду "Перекрестная проверка анализа" в "Идентификация проекта" панели.
  2. Потенциал метод биомаркеров на основе
    1. Определить пиковые классы. В окне "Матрица Mining", выбрать группы пиков, имеющих общие характеристики и определить эти пики как SPECIFIC пик классы (потенциальные биомаркеры) с использованием "Spectra> Управление типами пик класса ..." в окне "Сравнение".
    2. Здесь определяют пиковые классы, специфичные для каждого изолята для всех 15 изолятов.
    3. Выбор масс-спектры неизвестных и соответствуют вершины этих спектров с определенными классами пик, как описано выше.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Базы данных, построенные в этой демонстрации было четыре уровня, от самого высокого до самого низкого уровня, в том числе "всех уровнях", "вид", "биологическом репликации" и "Технические репликации", соответственно (рис 1А). "Технические реплику" уровень содержится вся предобработанных спектры технических повторяет. "Биологическая реплику" и "вид" уровни содержится композитный (резюме) спектров. "Все уровни" содержатся все технические спектры REPLICATE, а также все композитный спектры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта демонстрация показала, подробные процедуры характеризации и идентификации бактерий с использованием MALDI-TOF MS и пользовательскую базу данных. По сравнению с традиционными методами молекулярной, например, методы, отпечатков пальцев последовательности рДНК 16S, MALDI-TOF MS на основе способствовать более быструю идентификацию различных бактерий. Из-за своей надежности, этот метод широко используется для характеристики бактерий, вирусов, грибков и дрожжей из окружающей среды и в клинических условиях 1,14-16.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы Вранкс и Янссенс являются сотрудниками компании Applied Maths NV, производителя программного обеспечения для анализа данных, используемого в этом видео. Applied Maths NV предоставила избранные программные модули, выделенные в этом видео, а также часть расходов на публикацию, связанных с этим видео.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Новым колледжем междисциплинарных искусств и наук при Университете штата Аризона, Applied Maths NV, и Национальным научным фондом (ROA Supplement to Award No. MCB0604300). Любые мнения, выводы, выводы или рекомендации, выраженные в этом материале, принадлежат автору (авторам) и не обязательно отражают точку зрения Национального научного фонда.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
α-циано-4-гидроксикоричная кислотаACROS Organics163440050≥ 97%, CAS 28168-41-8
Программное обеспечение Bruker FlexControlBruker Daltonicsверсия 3.0
Программное обеспечение Bruker FlexAnalysis BrukerDaltonicsверсия 3.0
Программное обеспечение BionumericsПрикладная математикаверсия 7.1

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review. Mass Spectrom Rev. 32 (3), 188-217 (2013).
  2. Siegrist, T. J., et al. Discrimination and characterization of environmental strains of Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). J Microbiol Meth. 68 (3), 554-562 (2007).
  3. Goldstein, J. E., Zhang, L., Borror, C. M., Rago, J. V., Sandrin, T. R. Culture conditions and sample preparation methods affect spectrum quality and reproducibility during profiling of Staphylococcus aureus with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Lett Appl Microbiol. 57 (2), 144-150 (2013).
  4. Benagli, C., et al. A rapid MALDI-TOF MS identification database at genospecies level for clinical and environmental Aeromonas strains. Plos One. 7 (10), (2012).
  5. Sauer, S., Kliem, M. Mass spectrometry tools for the classification and identification of bacteria. Nat Rev Microbiol. 8 (1), 74-82 (2010).
  6. Bohme, K., et al. SpectraBank: An open access tool for rapid microbial identification by MALDI-TOF MS fingerprinting. Electrophoresis. 33 (14), 2138-2142 (2012).
  7. Walker, J., Fox, A. J., Edwards-Jones, V., Gordon, D. B. Intact cell mass spectrometry (ICMS) used to type methicillin-resistant Staphylococcus aureus: media effects and inter-laboratory reproducibility. J Microbiol Meth. 48 (2-3), 117-126 (2002).
  8. Ruelle, V., El Moualij, B., Zorzi, W., Ledent, P., De Pauw, E. Rapid identification of environmental bacterial strains by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun Mass Sp. 18 (18), 2013-2019 (2004).
  9. Sedo, O., Sedlacek, I., Zdrahal, Z. Sample Preparation Methods for Maldi-MS Profiling of Bacteria. Mass Spectrom Rev. 30 (3), 417-434 (2011).
  10. Swatkoski, S., Russell, S., Edwards, N., Fenselau, C. Analysis of a model virus using residue-specific chemical cleavage and MALDI-TOF mass spectrometry. Anal Chem. 79 (2), 654-658 (2007).
  11. Freiwald, A., Sauer, S. Phylogenetic classification and identification of bacteria by mass spectrometry. Nat Protoc. 4 (5), 732-742 (2009).
  12. Drevinek, M., Dresler, J., Klimentova, J., Pisa, L., Hubalek, M. Evaluation of sample preparation methods for MALDI-TOF MS identification of highly dangerous bacteria. Lett Appl Microbiol. 55 (1), 40-46 (2012).
  13. Lasch, P., et al. MALDI-TOF mass spectrometry compatible inactivation method for highly pathogenic microbial cells and spores. Anal Chem. 80 (6), 2026-2034 (2008).
  14. Usbeck, J. C., Kern, C. C., Vogel, R. F., Behr, J. Optimization of experimental and modelling parameters for the differentiation of beverage spoiling yeasts by Matrix-Assisted-Laser-Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) in response to varying growth conditions. Food Microbiol. 36 (2), 379-387 (2013).
  15. Del Chierico, F., et al. MALDI-TOF MS proteomic phenotyping of filamentous and other fungi from clinical origin. J Proteomics. 75 (11), 3314-3330 (2012).
  16. Vitale, R., Roine, E., Bamford, D. H., Corcelli, A. Lipid fingerprints of intact viruses by MALDI-TOF/mass spectrometry. Bba-Mol Cell Biol L. 1831 (4), 872-879 (2013).
  17. Zhang, L., Borror, C. M., Sandrin, T. R. A designed experiments approach to optimization of automated data acquisition during characterization of bacteria with MALDI-TOF mass spectrometry. Plos One. 9 (3), (2014).
  18. Christner, M., Rohde, H., Wolters, M., Sobottka, I., Wegscheider, K., Aepfelbacher, M. Rapid identification of bacteria from positive blood culture bottles by use of matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry fingerprinting. J ClinMicrobiol. 48 (5), 1584-1591 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

BioNumerics 7 1

Похожие статьи