Для анализа профилей экспрессии генов сердечных во данио развития сердца, общей РНК должны быть извлечены из изолированных сердцах. Здесь мы приводим протокол для сбора функционал / бьющееся сердце быстрым ручной вскрытия из эмбрионов данио рерио, чтобы получить сердечно-специфической мРНК.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Крупномасштабные данио рерио эмбриональных Сердце Вскрытие для транскрипционных анализа
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Данио рерио эмбриональных сердце состоит только из нескольких сотен клеток, что составляет лишь небольшую часть всей эмбриона. Поэтому, чтобы предотвратить сердечный транскриптом от маскируется глобальной эмбрионального транскриптома, необходимо собрать достаточное количество сердец для дальнейшего анализа. Кроме того, как данио сердца развитие протекает быстро, сбор сердца и методы экстракции РНК должны быть быстрым, чтобы обеспечить однородность образцов. Здесь мы представляем быстрый ручной протокол вскрытия для сбора функционал / бьющееся сердце из эмбрионов данио рерио. Это является необходимым условием для последующего извлечения сердца РНК с определения сердечно-определенные уровни экспрессии генов с транскриптомный анализы, такие как количественное ПЦР в реальном времени (RT-КПЦР). Метод основан на дифференциальных адгезивных свойств данио эмбрионального сердца по сравнению с другими тканями; Это позволяет быстро PHYSical разделение сердечной ткани от экстракардиальной сочетанием текучей нарушения силы сдвига, ступенчатой фильтрации и ручного сбора трансгенных флуоресцентно меченных сердца.
Введение
Данио рерио (Danio rerio) широко используется в биологии развития для изучения органогенеза в естественных условиях из-за его быстрого, прозрачного и внематочной эмбрионального развития, в сочетании с малым размером и наличием трансгенных репортеров линий с тканевой экспрессией флуоресцентных белков. Этот небольшой позвоночных особенно хорошо подходит для изучения развития сердца, потому что оксигенации начале данио эмбриона не зависит от сердечного ритма и потока крови; Эти особенности позволили охарактеризовать большого числа сердечно-сосудистых мутантов 1,2 и данио сейчас широко признается модельным организмом для изучения сердечных за....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Этот протокол следует руководству по уходу за животными немецкой и Берлин государственного права; Данио обработки контролировали местные органы власти для защиты животных (LaGeSo, Берлин-Бранденбург).
1. Получение эмбрионов данио для сердца Добыча
- Кросс сердечной репортер данио, такие как Tg (myl7: EGFP) трансгенной линии twu34 9 с целью получения эмбрионов с сердечной-специфической экспрессии GFP.
- Поддерживать эмбрионов в яйце воды на 28,5 ° С до желаемой эмбриональной стадии 10,11. Убедитесь, что собрали население эмбрион является однородным как генетически, так и стадии разви....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Здесь мы опишем представительство сердце рассечение эксперимент с использованием данио TG (myl7: GFP) twu34 трансгенной линии 9, в котором выражается зеленый флуоресцентный белок (GFP) исключительно в миокарде (рис 1).. Мы собрали оба расчлененный сердца и эмбрионы, из которых они были получены, чтобы оценить чистоту образца сердца. Вкратце, гомозиготные Tg (myl7: GFP), twu34 данио 9 были ауткроссной дикого типа, так что все эмбриональные сердца GFP с меткой........
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот протокол позволяет быстрое обогащение данио эмбриональных тканей сердца для экспрессии гена анализа. Количество и качество сердечно-конкретного образца РНК во многом зависит от нескольких важных этапов: во-первых, количество образца значительно улучшено, если потеря сердца предотвращается на каждом шагу протокола, так как очистка РНК будет работать только с достаточно исходного материала. Во-вторых, чистота образца, который полностью зависит от экспериментатора, определяется сортировки и сбора сердца в чашку Петри,.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить К. Бернса, К. МакРэя за изложение основного принципа этого протокола очистки, и Ф. Приллера за первоначальную реализацию этого метода в нашей лаборатории. С.А.-С. поддерживается профессорской диссертацией Гейзенберга в Немецком научно-исследовательском институте (DFG). Эта работа была поддержана грантом DFG SE2016/7-1.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Оборудование для выращивания рыбы и сбора икры | подробности см. в книге «Данио<рыбки данио>11 | ||
| Флуоресцентный стереомикроскоп | |||
| Охлаждаемая микроцентрифуга | |||
| УФ-спектрофотометр | например Thermo Scientific Nanodrop 2000 | ||
| Камера | |||
| для электрофореза нуклеиновых кислотЧашки Петри 4 см Ø, покрытые 1% агарозой в среде E3 Микропипетки | |||
| и наконечники (P20, P100, P1000) | |||
| 1,5 мл центрифужные пробирки | |||
| 15 мл и 50 мл центрифугирующие пробирки | |||
| Пара щипцов | |||
| Dumont #5ExactaCruz™ Круглые насадки для загрузки геля в стерильном штативе, 1-200μ l | Санта-Крус | sc-201732 | |
| 100 μ m фильтр (BD Falcon 100 mm Cell Sither) | BD Biosciences | 352360 | |
| 30 μ м (фильтры предварительной сепарации-30 и микро; m) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Гель с фазовой блокировкой, тяжелый, пробирки 1,5 мл | Prime | 2302810 | |
| Яичная водная среда | 60 мкм; г/мл растворимых морских солей океана в ddH2O, 0,00001% (мас./об.) Метиленовый синий | ||
| E3 среда | 5 мМ NaCl, 0,17 мМ KCl, 0,33 мМ CaCl<суб>2, 0,33 мМ MgSO<суб>4 | ||
| трикаин (3-аминобензойный кислотэтилэфир) | Sigma-Aldrich | A-5040 | 4 мг/мл стоковый раствор трикейна, pH |
| 7 1% агароза (в среде Е3) | |||
| 1% агарозный гель (в буфере | |||
| Leibovitz´ с Л-15 средний | Gibco | 21083-027 | |
| FBS (фетальная бычья сыворотка) | Sigma | F4135 | |
| RNAlater | Ambion | AM7020 | |
| Trizol | Ambion | 1559606 | |
| гликогеном | Инвитроген | 10814-010 | 20 & микро; g/µ l в воде без РНКазы |
| хлороформ | |||
| изопропанол | |||
| 75% этанол (в DEPC-ddH2O) | |||
| Вода без нуклеазы или стерилизованный обработанный DEPC ddH2O | |||
| Буфер | |||
| TBE (Tris/Borate/EDTA) для электрофореза |
Ссылки
- Stainier, D. Y., et al. Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo. Development. 123, 285-292 (1996).
- Chen, J. N., et al. Mutations affecting the cardiovascular ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
