Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Флуоресценции тушение липосомальной инкапсулированный в ближней инфракрасной области флуорофорные как инструмент для В Vivo Оптических изображений

15.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52136

⸱

5 января 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Experimental Radiology, Institute of Diagnostic and Interventional Radiology I, Jena University Hospital, 2Department of Pharmaceutical Technology, Friedrich-Schiller-University Jena, 3Center for Electron Microscopy, Jena University Hospital

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Использование флуорофоров для визуализации in vivo может быть сильно ограничено опсонизацией, быстрым клиренсом, низкой чувствительностью обнаружения и цитотоксическим воздействием на хозяина. Инкапсуляция флуорофоров в липосомах путем гидратации и экструзии пленки приводит к гашению флуоресценции и защите, что позволяет получать изображения in vivo с высокой чувствительностью обнаружения.

Аннотация

Оптическая визуализация предлагает широкий спектр диагностических методов и вызвала большой интерес как инструмент для биомедицинской визуализации. Несмотря на огромное количество доступных в настоящее время методов визуализации и прогресс в области приборостроения, по-прежнему существует потребность в высокочувствительных зондах, пригодных для визуализации in vivo. Одной из типичных проблем имеющихся доклинических флуоресцентных зондов является их быстрый клиренс in vivo, что снижает их чувствительность визуализации. Для обхода быстрого клиренса, увеличения количества молекул красителя в целевом участке и тем самым снижения фоновой автофлуоресценции была проведена инкапсуляция флуоресцентного красителя ближнего инфракрасного диапазона DY-676-COOH в липосомах и проверка его потенциала для визуализации воспаления in vivo. DY-676 известен своей способностью к самогашению при высоких концентрациях. Сначала мы определили концентрацию, пригодную для самогашения, а затем инкапсулировали эту гасящую концентрацию в водную внутреннюю часть ПЭГилированных липосом. Для обоснования потенциала гашения и активации липосом мы используем жесткий метод замораживания, который приводит к повреждению липосомальных мембран без воздействия на инкапсулированный краситель. Липосомы, характеризующиеся высоким уровнем гашения флуоресценции, были названы Lip-Q. Эксперименты с различными клеточными линиями показали, что поглощение Lip-Q происходит преимущественно путем фагоцитоза, что, в свою очередь, позволило охарактеризовать его потенциал в качестве инструмента для визуализации воспаления in vivo на мышиных моделях. Кроме того, мы используем модель индуцированного зимозаном отека у мышей для обоснования потенциала Lip-Q в оптической визуализации воспаления in vivo. Учитывая возможное поглощение из-за вызванного воспалением эффекта повышенной проницаемости и удержания (ЭПР), постоянно включенный липосомный состав с низкой, негасимой концентрацией DY-676-COOH (называемого Lip-dQ) и свободным DY-676-COOH сравнивали с Lip-Q в испытаниях на животных.

Введение

Липосомы интенсивно исследовали и служить в качестве одного из наиболее биосовместимых биомедицинских систем доставки лекарственных средств для клинического применения 1,2. Они, в основном, состоит из фосфолипидов и холестерина, оба из которых являются биосовместимыми соединения, имитирующие части природных клеточных мембран. В то время как гидрофильные вещества могут быть заключены в водном внутреннем пространстве, липофильные агенты могут быть включены в липосомальной фосфолипидный бислой 3. Инкапсуляция веществ в водном внутреннем пространстве липосом предоставляет защиту от деградации в естественных, а также предотвращает хост-системы от токсических эффектов цитотоксических лекарственных средств, используемых для лечения заболеваний, например химиотерапевтических направленных на разрушение опухолевых клеток. Модификация липосомной поверхности полимеров, таких как полиэтиленгликоль (ПЭГилирование) дополнительно увеличивает время циркуляции крови в липосомальной естественных вследствие стерических стабилизации 4. Moreovэр, липосомы могут улавливания высокие концентрации различных веществ, таких как белки 5,6, гидрофильных веществ и ферментов 7,8 9. Таким образом, они служат в качестве надежного клинического лечебно-диагностические инструменты, которые заслуживают свое согласие на поставку цитотоксических препаратов, таких как доксорубицин для лечения рака 4. Благодаря своей гибкости, липосомы также могут быть загружены с флуорохромами для диагностических и графических наведением хирургических целей.

Флуоресцентной томографии обеспечивает экономически эффективный и неинвазивный в естественных условиях диагностического инструмента, которые, однако, требует некоторых основных требований. Это может быть продемонстрировано, что флуорохромы, которые подходят лучше для визуализации в естественных условиях имеют характеристическое поглощение и максимумов излучения в диапазоне, где дисперсия света и рассеяния, а также ткани аутофлюоресценция, происходящих из воды и гемоглобина является низким. Таким образом, такие датчики имеют свою абс / EM максимумов между 650 и 900 нм 10. Кроме того, стабильность флуорохромов в пробирке и в естественных условиях имеет решающее значение, так как опсонизация и быстрое оформление может значительно ограничить их применение для естественных изображений в 11. Другие эффекты, такие как плохой стабильностью и низкой чувствительности или цитотоксических эффектов на органы-мишени, как видно с индоцианина зеленого (ICG) 12-16, являются нежелательными и должны быть приняты во внимание при разработке зондов для визуализации в естественных условиях. Эти наблюдения привели к активному развитию нескольких доклинических NIR флуорохромии наночастиц, а также новых методов для визуализации в естественных условиях воспалительных процессов, рака и для имиджа наведением хирургии 17-20. Несмотря на стабильность большинства доклинических NIRF (ближней инфракрасной флуоресценции) красителей в пробирке, их быстрое перфузии и оформление через печень и почки препятствовать их использование в в естественных условиях оптической визуализации заболеваний и воспалительных процессов.

ntent "> Поэтому мы приводим протокол для инкапсуляции флуорохромами, таких как хорошо охарактеризованы в ближней инфракрасной области флуоресцентным красителем DY-676-COOH, известный своей склонностью к себе закалки при относительно высоких концентрациях 21 в липосомы. При высоких концентрациях Н димеров и / или пи-укладки взаимодействия между молекулами флуорофора, расположенных в пределах Ферстер результате друг друга радиуса в Ферстер резонанс переноса энергии (FRET) между флуорохромом молекул. При малой концентрации пространство между увеличением молекул флуорофорные, тем самым предотвращая пи-укладки взаимодействия и Н-димеров и приводит к высокой эмиссии флуоресценции. переключение между высокой и низкой концентрации и прилагаемых тушение флуоресценции и активации является многообещающей стратегией, которая может быть использована для оптического изображения 22. В этом отношении, инкапсуляция высоких концентраций красителя NIRF DY-676-COOH в водном внутреннем липосом является более FAvorable для визуализации в естественных условиях, чем свободного красителя. Задача метода заключается в первую очередь в правильном инкапсуляции и, во-вторых, в проверке преимущества, вытекающие из инкапсуляции высокие концентрации красителя. Сравнивая свойства изображений закаленных липосом с этим свободного красителя, а также с не останавливают липосомной композиции с низким содержанием красителя не обойтись. Покажем на простом, но очень эффективном фильм гидратации и экструзии протокола в сочетании с альтернативными замораживания и оттаивания, что инкапсуляция тушения концентрации DY-676-COOH в липосомы возможно. Другие способы, используемые для получения липосом, такие как метод с обращенной фазой испарения 23, а также методом впрыска этанола 24 включить липосомного препарата с высокой эффективностью инкапсуляции для многих гидрофильных веществ. Однако природа вещества, которое необходимо инкапсулировать может влиять на эффективность инкапсуляции. В действительности,Фильм гидратации и экструзии протокол, представленные здесь показал высокую эффективность для инкапсуляции DY-676-COOH. Чтобы проиллюстрировать преимущества липосомальной инкапсуляции DY-676-COOH, в зимозаном-индуцированного отека модели, которая позволяет изучать воспалительных процессов в течение нескольких часов, был использован. Здесь показано, что липосомы с высокой концентрацией инкапсулированного DY-676-COOH являются более подходящими для всего тела в естественных условиях оптической визуализации воспалительных процессов, чем свободного красителя или не-гасили липосомной композиции с концентрацией низких красителей. Таким образом, основной протокол обеспечивает простой и быстрый способ получения закаленных люминесцентные липосомы и проверку их активации и визуализации потенциала как в пробирке и в естественных условиях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры утверждаются областным комитетом животных и в соответствии с международными стандартами по этическим использования животных.

1. Подготовка материалов и инструментов

  1. Подготовка спонтанно образуется пузырек дисперсии (SFV)
    1. Растворить и подготовить исходные растворы следующих фосфолипидов: 214 мг / мл яичного фосфатидилхолина (ЕРС), 134 мг / мл холестерина, 122 мг / мл 1,2-distearoyl- Sn глицеро-3-phosphoethanolamine- N - [метокси (полиэтиленгликоль гликоль) -2000] (соль аммония) (MPEG 2000 -DSPE) и 2 мг / мл 1,2-dioleoyl- SN глицеро-3-phosphoethanolamine- N - (7-нитро-2-1,3-benzoxadiazol-4 ил) (соль аммония) (NBD-DOPE) в хлороформе и в магазине в стеклянных флаконах.
    2. Отделка примерно 3 мл хлороформа в круглодонную колбу и передавать соответствующий объем раствора фосфолипида в круглодонную колбу, чтобы подготовить липосомы, состоящие из ЕРС: Чхор: MPEG 2000 -DSPE в молярном соотношении 6,5: 3: 0,5. Для двойной флуоресценции маркировки липосом добавить 0,3 моль% НБД-DOPE в липидной раствора.
    3. Упаривают хлороформ из органического раствора фосфолипида при пониженном давлении (300 мбар) при 55 ° С с помощью роторного испарителя.
    4. После однородный фосфолипид пленка образуется, уменьшить давление до 10 мбар в течение 1-2 ч, чтобы удалить остаточный депозит хлороформом.
    5. В то время как хлороформ выпариванием, растворяют DY-676-COOH (6,181 мкМ) в 10 мМ Трис-буфера, рН 7,4, и заполнить сосуд Дьюара с жидким азотом. Переключатель на ультразвуковой бане и установлен на 50 ° C.
    6. Передача соответствующий объем (0,5-1 мл) DY-676-COOH (6,181 мкМ) раствора в круглодонную колбу дл гидратации сухого фосфолипидов пленки и вихрь энергично, пока спонтанно формируется пузырек (SFV) дисперсии форм. Убедитесь, что все фосфолипиды диспергированы, чтобы избежать потери липидов.
    7. Тщательно траnsfer круглодонную колбу, содержащую дисперсию SFV в жидкий азот и заморозить дисперсию в течение 3-5 мин. Поместите круглодонную колбу в ультразвуковой бане при 50 ° С, чтобы растопить дисперсию затем вихрь дисперсию энергично в течение 1-2 мин. Повторите эту процедуру шесть раз, делая в общей сложности семь замораживания и оттаивания.
  2. Экструзия SFV, чтобы сформировать однородные липосом пузырьки
    1. Передача дисперсии SFV в 1 мл шприца (шприц-а), и прессовать дисперсии через поликарбонатную мембрану 100 нм с использованием LiposoFast-Базовая экструдера в шприц-B.
    2. Выдавите дисперсии от шприца-б, обратно в шприц-а, затем повторите цикл десять раз. Благодаря экструзии, раствор в шприц из изменений в туманной внешнему виду четкой дисперсии во времени. После десяти циклов (двадцать отдельные шаги в профиле) удалить шприц-б от устройства и выдавите дисперсию в течение последнего времени от шприца непосредственно в стерильный1,5 мл реакционной трубки.
  3. Очистка липосомальных инкапсулированные DY-676-СООН от свободного красителя
    1. Приготовьте на колонке с силикагелем, используя шарики G25 смоченные в 10 мМ Трис-буфер рН 7,4 (колонка длиной 28 см, диаметр 0,8 см).
    2. Передача 0,5 мл экструдированного дисперсии пузырьков на кровать гель и пусть слива пробы в гелевой матрице.
    3. Элюируйте липосом с 10 мМ трис-буфера, рН 7,4 (фиг.1А) и не промывки колонки до тех пор, канализацию свободного красителя полностью из колонны. Если это будет необходимо, собирать и перерабатывать бесплатный красителя, обессоливания и обезвоживания в соответствии с инструкциями изготовителя.
    4. Концентрат элюированной липосом с помощью ультрацентрифугирования (200000 х г, 2 ч при 8 ° С), а затем диспергировать их в надлежащем объеме стерильной 10 мМ Трис буфера, рН 7,4,.
  4. Количественное инкапсулированного концентрации DY-676-COOH
    1. Подготовка калибровочной кривой путем растворения DY-676-COOH (0, 82, 124,247, 494, 988 нМ) в 10 мМ трис-буфера, рН 7,4, содержащем 0,1% Triton X100.
    2. Растворить 2 мкл (100 нмоль окончательного липида из 50 ммоль / л наличии) липосом в течение 5 мин при комнатной температуре в 100 мкл трис-буфера, содержащего 1% Triton X100, чтобы разрушить пузырьки и освободить инкапсулированный краситель. Затем разбавленные образцы с 10 мМ трис-буфера, рН 7,4 до конечной концентрации Тритон-X100 0,1% (об / об), что делает общий объем 1 мл. Подготовка всех образцов в двух экземплярах.
    3. Измерьте поглощение и испускание всех образцов (бесплатно DY-676-СООН и Тритон-X100 лечение липосомы) на возбуждение λ = 645 нм и эмиссии λ = 700 нм. Создание и использование калибровочной кривой свободного красителя для определения концентрации инкапсулированного красителя.
  5. Липосомы характеристика
    1. Определить размеры и дзета-потенциал липосом динамического рассеяния света. Развести образцы липосомальных с фильтром стерилизованного (0,2 мкм) 10 мМ Трис-буфер рН 7,4 в переменного токаoncentration 100-300 мкм (липидов). Передача разбавленных образцов в низких объемов располагаемых кювету и измеряют образец в соответствии с инструкциями изготовителя.
    2. Определение характеристик липосом с помощью электронного микроскопа, чтобы подтвердить размер, целостность и однородность липосомальных везикул в соответствии со стандартными протоколами.

2. Проверка флуоресценции закалки и активация готовых липосом

  1. Физико-химический анализ флуоресценции закалки и активации
    1. Приготовьте два 1,5 мл трубы для губ-Q и 2 трубы для свободного DY-676-COOH. Передача 100 нмоль общих липидов (2,38 мкл 42 ммоль / л для губ-Q маточного раствора, содержащие 138 мкг / мл инкапсулированного DY-676-COOH) в соответствующих трубах. Трансфер бесплатный DY-676-СООН эквивалент к содержимому красителя для губ-Q (0,38 мкг, что приводит, например, от 138 мкг / 1000 мкл х 2,38 мкл Лип-Q используется). Выдержите одна ваннае каждого зонда при 4 ° С и заморозить второй трубки при температуре -80 ° С в течение ночи (16 ч).
    2. Нагревают нагревательный блок до 30 ° С. Заполните охлаждающей коробку с колотым льдом и уравновешивают аликвоту 10 мМ трис-буфера с рН 7,4 при комнатной температуре.
    3. Удалить зонды из 4 ° С и уравновешивают при комнатной температуре (заворачивали в алюминиевую фольгу для защиты от света) и быстро оттаивают зондов от -80 ° С при 30 ° С в течение 5 мин. Холод талой зондов на льду в течение 1 мин перед передачей их до комнатной температуры (также заворачивали в алюминиевую фольгу для защиты от света).
    4. Добавить 10 мМ трис-буфера (рН 7,4) для каждого из зондов к 100 мкл конечного объема, и равновесие все зонды при комнатной температуре в течение 10 мин.
    5. Внесите 80 мкл каждого зонда в стеклянной кювете малого объема и измерения поглощения каждого зонда от 400-900 нм на спектрометре. Вернуться зонд для соответствующих труб.
    6. Передача 80 мкл каждого зонда в подходящую стеклянную кюветуи измерить излучение флуоресценции на спектрофлуорометра, возбуждая датчиков на 674 нм и измерения флуоресценции от 694-800 нм.
  2. Клеточного поглощения и активация флуоресценции
    1. Получить и культура следующие клеточные линии в их соответствующей культуральной среде в соответствии со стандартными условиями (37 ° С, 5% СО 2 и 95% увлажненной атмосфере). Здесь используют мышиные линии клеток макрофагов J774A.1 (Дульбекко модифицированной среде Игла, дополненной 10% (об / об) фетальной сыворотки теленка), линии клеток глиобластомы человек, U-118MG (MEM, содержащей необходимые витамины и 10% (об / V) эмбриональной телячьей сыворотки) и линии клеток человека фибросаркомы, HT-1080 (RPMI с 5% FCS).
    2. Пальто 8-а камера скользит с поли-L-лизина (добавить 100 мкл 0,001% поли-L-лизин в каждую лунку и инкубировать при 37 ° С в течение 10 мин. Решение набирая и пусть камерные слайды высохнуть в течение по крайней мере 4 ч при комнатной температуре на стерильной верстаке. Промойте камеры слайды 3раза забуференным солевым раствором 200 мкл Хэнка затем запечатать их парафином и алюминиевой фольги и хранят при температуре 4 ° С до необходимости.
    3. В то время как камера скользит иссякают, фильтр-стерилизации липосом и раствор красителя и хранить при 4 ° С до необходимости.
    4. Для поглощения зонд анализа со всем телом в естественных условиях NIR системы флуоресцентной томографии, подготовить 5 небольших флаконах для культуры для каждой из линий 3 тестовых клеток (15 колбы в общей сложности). Семена 2 × 10 6 J774A.1, U-118MG и HT-1080 клеток на колбу культуры с 5 мл соответствующей культуральной среды (в пятерок) и расти в течение 16-24 ч. Параллельно с колбы с культурой, семена 30000 клеток каждой клеточной линии (J774A.1 и HT-1080) или 20000 клеток (U-118MG) 2 лунки камеры слайд, соответственно, и расти в 500 мкл культуральной среды в течение 16-24 часов ,
    5. На следующий день, добавить 100 нмоль (окончательная сумма липидов) губы-Q 2 колбы на клеточной линии и одну лунку каждой клеточной линии на камеру слайда.Сразу передачи 1 колбу на одну клеточную линию до 4 ° С и вторую колбу обратно в инкубатор.
      Примечание: объем зондов добавляют в колбы и камера скользит те же, что делает концентрацию на камере слайдов 10 раз выше (5 мл до 500 мкл культуральной среды). Это необходимо потому, что Микроскопическое исследование является менее чувствительным, чем система визуализации флуоресценции NIR, где сотовые таблетки из колб в образ.
    6. Добавьте бесплатный DY-676-COOH в концентрации, эквивалентной к содержанию красителя для губ-Q к клеткам в 2 колбы на клеточной линии и одну лунку каждой клеточной линии на камеру слайд, а затем немедленно передать 1 флакон на одну клеточную линию 4 ° C (истощение энергии), а другой колбу вместе с камерой скользить назад в инкубатор. Инкубируйте все клетки в течение 24 ч при соответствующих условиях. Клетки в колбе без зонда служат в качестве необработанного контроля.
  3. NIRF изображений и полуколичественный анализ
    1. После 24 продолжительности инкубационного ч, урожай клеток в колбах промывкой клеток 2-го раза Хенкса раствор соли (HBSS), то скрести клеток в 500 мкл HBSS и осадок центрифугированием (5 мин при 200 мкг) в 500 мкл трубки.
    2. Место труб с клеточного осадка (и ССРХ) в тепловизора NIRF и изображения с помощью фильтров для возбуждения (615-665 нм) и эмиссии (CUT IN> 700 нм).
    3. Минус аутофлуоресценцию и оценить интенсивность цели по сравнению с автофлуоресценции соответствии с инструкциями производителя. Это даст полуколичественного уровней интенсивности флуоресценции как среднего сигнала (в пересчете имп / сек), который представляет уровнях насчитывается после масштабирования для времени экспозиции, увеличение камеры, биннинга и битовой глубины, так что измерения сопоставимы друг с другом.
  4. Конфокальной микроскопический анализ
    1. После 24 ч инкубации сбора клеток на камерных промыванием слайдов 2 раза с 500 мкл HBSS.
    2. Закрепите CEзаполняет с 200 мкл HBSS, содержащего 3,7% (об / об) формальдегида в течение 30 мин при комнатной температуре.
    3. В то время как фиксация происходит, разбавить пятно ДНК, Hoechst-33258 1:50 с монтажной решения.
    4. После фиксации промыть клетки 2 раза ССРХ затем отделить камер от стеклянных слайдов. Добавить 50 мкл раствора, содержащего монтажную ДНК-пятно на каждой точке, соответствующей лунки камеры слайдов. Обложка клетки с покровные стекла, печать края с прозрачным лаком для ногтей и воздушно-сухой в течение 10 мин при комнатной температуре (темный).
    5. Клетки изображение на подходящем флуоресцентного микроскопа или конфокальной микроскопии. Используйте следующие параметры возбуждения и эмиссии для визуализации соответствующих компонентов: ядра (Hoechst-33258: возбуждение 405 нм, эмиссия 420-480 нм). НБД-DOPE (липосомальной липид: возбуждение 488 нм, излучение 530 нм). DY-676-COOH (NIR флуоресцентный краситель: возбуждение 633-645 нм, эмиссия 650-700 нм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что флуоресцентный микроскопмодели шириной оснащен соответствующих фильтров, которые позволяют возбуждение и эмиссию длин волн выше, чем 630 нм.

3. на основе липосом in vivo с флуоресцентной визуализации воспаления

  1. Получение животных и материалов
    1. Дом 8-12-недельных самцов мышей NMRI весом примерно 36 г в стандартных условиях с пищей и водой вволю.
    2. Через семь дней до начала экспериментов, дают все мыши низкую феофорбид диету, чтобы уменьшить ткани аутофлюоресценция.
    3. Через двадцать четыре часа до начала каждого эксперимента, брить мышей в желаемой области (например, всю заднюю область, если изображения отека задней ноги желательно).
    4. Взвешивание животных и рассчитать количество зонда, который будет введен на мышь (Lip-Q и Lip-DQ на 10 мкмоль (концентрации липидов) на кг массы и свободного DY-676-COOH (эквивалент для окрашивания содержание губ-Q используется) ,
    5. Изображение животных вВсе тело NIR флуоресценции тепловизор с теми же настройками, используемыми для сотовых гранул. Это измерение обеспечивает аутофлюоресценция животных.
    6. Растворите 10 мг зимозаном-A в 1 мл изотонического солевого раствора и хранить в течение ночи при 4 ° С.
  2. Индукция воспаления и в естественных NIRF изображений
    1. Подготовьте 3 шприцы на мышь, содержащие следующие решения. Заполните один шприц с 50 мкл зимозаном раствора (10 мг / мл), а второй шприц с 50 мкл изотонического солевого раствора. Заполните третий шприц с зондами, в результате чего Lip-Q и Lip-DQ (10 мкмоль / кг массы (липидный)) предназначены для подопытных животных и бесплатным DY-676-COOH (концентрации, как в Лип-Q) для контрольных животных. Убедитесь, что зонды разбавляют стерильной HBSS до 150 мкл конечного объема.
    2. Нанесите крем для глаз на глазах животных, чтобы избежать сухости и обезболить животных с 2% изофлуран пока они глубоко спит и не реагируют при прикосновении на лапах (Это займет около 2 мин).
    3. Наведите на теплой коврик (еще под наркозом) и ввести зимозаном решение подкожно на правой задней ноги и солевой раствор на левой задней ноге. Сразу вводят зонд внутривенно и изображение животного после затем рекордное время впрыска / измерения (как Т = 0 ч). Сохраните полученные изображения как изображение кубиков и повторите эти шаги для всех других животных и соответствующих датчиков.
    4. Image животные каждые 2 ч в течение после инъекции 10 ч, а затем в 24 ч после инъекции, убедившись, что этап измерительной камере тепло (например, путем размещения теплый коврик под) для того, чтобы избежать переохлаждения. После каждого измерения, установите животных в клетке с пищей и водой вволю и поместить клетку в умеренном камеры животных. Усыпить животных от первого обезболивающие с 2% изофлуран до животные больше не реагируют на ощупь, то усыпить углекислым газом в течение 5-10 мин, что делаетУбедитесь, что животные полностью остановить дыхание и трупное окоченение происходит.
    5. Проанализируйте мышей в соответствии со стандартными протоколами, которые могут быть использованы для определения в Интернете (http://www.freebookez.com/mouse-dissection-lab-report/) и изображение органов.
    6. Оценка результатов измерений в соответствии с инструкциями изготовителя сначала вычитанием общего флуоресценции животных (расслоение), то назначая регионах, представляющих интерес для флуоресценции (левой задней лапы с физиологическим раствором) и целевой флуоресценции воспаленной области (правой задней лапы зимозаном-A).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Инкапсуляция высоких концентраций флуоресцентных красителей, таких как NIRF красителя DY676-COOH используемых здесь, в водном внутреннем пространстве липосом приводит к высоким уровнем тушения флуоресценции. Шение флуоресценции, явление видели со многими флуорофорами в высокой концентрации, может быть использована в нескольких в естественных условиях и обработки изображений, где высокая чувствительность и надежность обнаружения целевой области востребованы. Использование липосом также обеспечивает защиту красит...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Поскольку липосомы могут также служить в качестве систем доставки для флуоресцентных красителей, они дают возможность визуализации целевых заболеваний. Инкапсуляция высоких концентраций флуоресцентных красителей, таких как краски, NIRF DY676-COOH используемых здесь, приводит к высокому уровню флуоресценции закалки захваченного красителя. Шение флуоресценции, явление видели со многими флуорофорами при высокой концентрации может быть использована в нескольких в естественных изображений приложениях, где высокая чу...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Немецкое исследовательское общество HI-698 / 10-1 и RU-1652 / 1-1. Мы благодарим Дорин мая за отличную техническую помощь и компании DYOMICS GmbH, Йена их поддержку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Материалы и оборудование для оценки липосом и оптической визуализации
Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Материалы и оборудование для получения липосом
egg фоспахтидилхолинAvanti Polar Lipids840051PРастворить в хлороформе и хранить в стеклянных флаконах (214 мг/мл)
холестеринSigmaC8667Растворить в хлороформе и хранить в стеклянных флаконах (134 мг/мл)
1,2-дистеароил-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000] (соль аммония)AvantiPolar Lipids880120PРастворить в хлороформе и хранить в стеклянных флаконах (122 мг/мл)
1,2-диолеол-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1, 3-бензоксадиазол-4-ил) (соль аммония)Avanti Polar Lipids810145PРастворить в хлороформе и хранить в стеклянных флаконах (2 мг/мл)
Sartorius MC1 (d = 0,01 мг)Sartorius AGResearch RC 210 Pиспользуется для взвешивания фосфолипидов
RotavaporBü chi Labortechnik AGR-114используется для гидратации фосфолипидной пленки
Водяная баняBü chi Labortechnik AGR-481используется для гидратации фосфолипидной пленки
Vacuum ControllerBü chi Labortechnik AGB-720используется для гидратации фосфолипидной пленки
VacoboxBü chi Labortechnik AGB-177используется для гидратации фосфолипидной пленки
Циркуляционный чиллерLAUDA DR. R. WOBSER
GMBH & CO. KG		WKL 230используется для гидратации фосфолипидной пленки
DY-676-COOHDyomics GmbH676-00Растворить в 10 мМ Трис и хранить на складе при -20°°; C Трис
-(Гидроксиметил)-аминометанApplichemA1086буфер 10 мМ, pH 7,4
ТрихлорметанCarl Roth GmbH + Co. KGY015.2используется для получения липосома
SonicatorMerck Eurolab GmbHUSR 170 Hиспользуется для получения липосома
Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No 146-3011-00)Scientific Industries Inc.SI-0256используется для получения липосомального препарата
Sephadex G25 medium GE Healthcare Europe GmbH17-0033-01используется для очистки липосом
Triton X100Ferak Berlin GmbH505002используется для разрушения липосом   для количественного определения красителя
LiposoFast-BasicAvestin Inc.используется для экструзии липосом
Поликарбонатная фильтрующая мембрана, 100 нм (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U)VWRиспользуется для экструзии липосом с помощью LiposoFast-Basic
Fluostar OptimaBMG Labtechиспользуется для количественного определения красителя
Zetasizer Nano ZSMalvernиспользуется для определения размера липосом и зетапотенциала
Ультрацентрифуги Beckmann Coulter GmbHXL 80для концентрирования образцов
RotorBeckmann Coulter GmbHSW 55 TIдля концентрирования образцов<
Zymosan-A из Saccharomyces cereviciaeSigmaZ4250-250MGиспользуется для индукции воспаления
Изотонический физиологический раствор (0,9%)Fresenius GmbHPZN-2159621используется для разведения Zymosan-A
Isoflurane vaporizerOhmeda Isotec 4используется для обезболивания животных
IsofluraneActavis GmbH PZN-7253744анестезиологический
коврик Thermo Mat Pro 20 ВтLucky Reptile61202-HTP-20используется для согревания животных во время анестезии
Omnican-F (1 мл инъекции) BraunPZN-3115465используется для подкожного и внутривенного введения зондов
Пантенол крем для глазJenapharmPZN-3524531используется для профилактики сухости глаз животных во время анестезии
Hanks буферизованный физиологический растворPAA Laboratories / Biochrom AGL2045без Mg2+, Ca2+ и фенола красного. Для разведения зондов и для промывки клеток
8-луночными камерными предметными стекламиBD Biosciences354108использовать для культивирования клеток с последующей микроскопией 
Колбы для клеточных культурGreiner BioOne
Клеточные питательные средыGibco (life technologies GmbH)
nbsp;Инвитроген
раствор поли-L-лизина (0,01%, 50  ml)SigmaP4832используется для покрытия камерных стекол для клеточных культур
Mountant PermafluorThermoScientific S21022-3Монтажный раствор для микроскопии
Hoechst-33258AppliChemДНК-краситель для микроскопии
Hera-SafeHeraeus Instrumentsстерильный верстак, используемый для клеточной культуры
HERA cellHeraeus InstrumentsИнкубатор для клеточной культуры
LSM510-MetaZeissиспользуется для конфокальной микроскопии
Maestro-TM система флуоресцентной визуализации in vivoCRi, Woburnиспользуется для флуоресцентной визуализации всего тела мелких животных
Спектрофотометр (Ultrospec 4300 pro UV)GE Healthcareиспользуется для измерения абсорбции
Спектрофлуориметр (Jasco FP-6200)Jascoиспользуется для измерения флуоресцентного излучения
Animals
Мыши МРТ (8-12 недель, самцы)Elevage Janvier, Францияиспользуемые для испытаний воспаления
td colspan="4">Фетальная сыворотка теленка&,

Ссылки

  1. Buse, J., El-Aneed, A. Properties, engineering and applications of lipid-based nanoparticle drug-delivery systems: current research and advances. Nanomedicine (Lond). 5, 1237-1260 (2010).
  2. Lim, S. B., Banerjee, A., Onyuksel, H. Improvement of drug safety by the use of lipid-based nanocarriers). Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 163, 34-45 (2012).
  3. Cabanes, A., et al. Enhancement of antitumor activity of polyethylene glycol-coated liposomal doxorubicin with soluble and liposomal interleukin 2. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 5, 687-693 (1999).
  4. Gabizon, A., Shmeeda, H., Grenader, T. Pharmacological basis of pegylated liposomal doxorubicin: impact on cancer therapy. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 45, 388-398 (2012).
  5. Balasubramanian, S. V., Bruenn, J., Straubinger, R. M. Liposomes as formulation excipients for protein pharmaceuticals: a model protein study. Pharmaceutical research. 17, 344-350 (2000).
  6. Meyer, J., Whitcomb, L., Collins, D. Efficient encapsulation of proteins within liposomes for slow release in vivo. Biochemical and biophysical research communications. 199, 433-438 (1994).
  7. Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et biophysica acta. 858, 161-168 (1986).
  8. Mayer, L. D., Bally, M. B., Hope, M. J., Cullis, P. R. Techniques for encapsulating bioactive agents into liposomes. Chemistry and physics of lipids. 40, 333-345 (1986).
  9. Walde, P., Ichikawa, S. Enzymes inside lipid vesicles: preparation, reactivity and applications. Biomolecular engineering. 18, 143-177 (2001).
  10. Weissleder, R., Ntziachristos, V. Shedding light onto live molecular targets. Nature medicine. 9, 123-128 (2003).
  11. Licha, K., Riefke, B., Ebert, B., Grotzinger, C. Cyanine dyes as contrast agents in biomedical optical imaging. Academic radiology. 9 Suppl 2, S320-S322 (2002).
  12. Pauli, J., et al. Novel fluorophores as building blocks for optical probes for in vivo near infrared fluorescence (NIRF) imaging. Journal of fluorescence. 20, 681-693 (2010).
  13. Holzer, W., et al. Photostability and thermal stability of indocyanine green. Journal of photochemistry and photobiology. B, Biology. 47, 155-164 (1998).
  14. Gandorfer, A., Haritoglou, C., Kampik, A. Retinal damage from indocyanine green in experimental macular surgery. Investigative ophthalmology & visual science. 44, 316-323 (2003).
  15. Saxena, V., Sadoqi, M., Shao, J. Degradation kinetics of indocyanine green in aqueous solution. Journal of pharmaceutical. 92, 2090-2097 (2003).
  16. Kodjikian, L., et al. Toxic effects of indocyanine green, infracyanine green, and trypan blue on the human retinal pigmented epithelium. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 243, 917-925 (2005).
  17. Sevick-Muraca, E. M., Houston, J. P., Gurfinkel, M. Fluorescence-enhanced, near infrared diagnostic imaging with contrast agents. Current opinion in chemical biology. 6, 642-650 (2002).
  18. Bremer, C., Ntziachristos, V., Weissleder, R. Optical-based molecular imaging: contrast agents and potential medical applications. European radiology. 13, 231-243 (2003).
  19. Hilderbrand, S. A., Kelly, K. A., Weissleder, R., Tung, C. H. Monofunctional near-infrared fluorochromes for imaging applications. Bioconjugate chemistry. 16, 1275-1281 (2005).
  20. Langhals, H., et al. Cyanine dyes as optical contrast agents for ophthalmological surgery. Journal of medicinal chemistry. 54, 3903-3925 (2011).
  21. Pauli, J., et al. An in vitro characterization study of new near infrared dyes for molecular imaging. European journal of medicinal chemistry. 44, 3496-3503 (2009).
  22. Ogawa, M., Kosaka, N., Choyke, P. L., Kobayashi, H. H-type dimer formation of fluorophores: a mechanism for activatable, in vivo optical molecular imaging. ACS chemical biology. 4, 535-546 (2009).
  23. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 75, 4194-4198 (1978).
  24. Batzri, S., Korn, E. D. Single bilayer liposomes prepared without sonication. Biochimica et biophysica acta. 298, 1015-1019 (1973).
  25. Fahr, A., van Hoogevest, P., May, S., Bergstrand, N., ML, S. L. Transfer of lipophilic drugs between liposomal membranes and biological interfaces: consequences for drug delivery. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 26, 251-265 (2005).
  26. New, R. R. C. Liposomes a practical approach. , IRL Press at Oxford University Press. (1990).
  27. Barenholz, Y., et al. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Biochemistry. 16, 2806-2810 (1977).
  28. Schwendener, R. A. The preparation of large volumes of homogeneous, sterile liposomes containing various lipophilic cytostatic drugs by the use of a capillary dialyzer. Cancer drug delivery. 3, 123-129 (1986).
  29. Pauli, J., et al. Suitable labels for molecular imaging--influence of dye structure and hydrophilicity on the spectroscopic properties of IgG conjugates. Bioconjugate chemistry. 22, 1298-1308 (2011).
  30. Wu, P., Brand, L. Resonance energy transfer: methods and applications. Analytical biochemistry. 218, 1-13 (1994).
  31. Stark, B., Pabst, G., Prassl, R. Long-term stability of sterically stabilized liposomes by freezing and freeze-drying: Effects of cryoprotectants on structure. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 41, 546-555 (2010).
  32. Tansi, F. L., et al. Liposomal encapsulation of a near-infrared fluorophore enhances fluorescence quenching and reliable whole body optical imaging upon activation in vivo. Small. 9, 3659-3669 (2013).
  33. Chen, R. F., Knutson, J. R. Mechanism of fluorescence concentration quenching of carboxyfluorescein in liposomes: energy transfer to nonfluorescent dimers. Analytical biochemistry. 172, 61-77 (1988).
  34. Windler-Hart, S. L., Chen, K. Y., Chenn, A. A cell behavior screen: identification, sorting, and enrichment of cells based on motility. BMC cell biology. 6, 14(2005).
  35. Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
  36. Erdo, F., Torok, K., Aranyi, P., Szekely, J. I. A new assay for antiphlogistic activity: zymosan-induced mouse ear inflammation. Agents and actions. 39, 137-142 (1993).
  37. Ajuebor, M. N., et al. Endogenous monocyte chemoattractant protein-1 recruits monocytes in the zymosan peritonitis model. Journal of leukocyte biology. 63, 108-116 (1998).
  38. Ajuebor, M. N., Das, A. M., Virag, L., Szabo, C., Perretti, M. Regulation of macrophage inflammatory protein-1 alpha expression and function by endogenous interleukin-10 in a model of acute inflammation. Biochemical and biophysical research communications. 255, 279-282 (1999).
  39. Ajuebor, M. N., et al. Role of resident peritoneal macrophages and mast cells in chemokine production and neutrophil migration in acute inflammation: evidence for an inhibitory loop involving endogenous IL-10. J Immunol. 162, 1685-1691 (1999).
  40. Binstadt, B. A., et al. Particularities of the vasculature can promote the organ specificity of autoimmune attack. Nature. 7, 284-292 (2006).
  41. Ishida, T., Harashima, H., Kiwada, H. Liposome clearance. Bioscience reports. 22, 197-224 (2002).
  42. Dobrovolskaia, M. A., McNeil, S. E. Understanding the correlation between in vitro and in vivo immunotoxicity tests for nanomedicines. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 172, 456-466 (2013).
  43. Szebeni, J., et al. Prevention of infusion reactions to PEGylated liposomal doxorubicin via tachyphylaxis induction by placebo vesicles: a porcine model. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 160, 382-387 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Липосомальное инкапсулированиеближняя инфракрасная флуоресценциявизуализация in vivoфагоцитарный захватгидратация липидной пленкиочистка путем экструзииспектрометрические измерениявызванный зимозаном отекПЭГилированные липосомы
Флуоресценции тушение липосомальной инкапсулированный в ближней инфракрасной области флуорофорные как инструмент для В Vivo Оптических изображений
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.