Методическая статья

Использование plusTipTracker Программное обеспечение для измерения микротрубочек Динамика в Xenopus Хепориз Шишки роста

DOI:

10.3791/52138

⸱

7 сентября 2014 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Boston College

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MATLAB, открытой пакет программного обеспечения источник, plusTipTracker, может быть использована для анализа ряд изображений флуо- меченных + Советы для количественной динамики микротрубочек.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микротрубочек (МТ) плюс-конец-отслеживания белки (+ чаевые) локализуются в растущих плюс-концов МТ и регулировать MT динамику 1,2. Один из самых известных и широко-используемых + советов для анализа динамики MT является конец-связывающий белок, EB1, который связывает все растущие MT плюс-эндов, и, таким образом, является маркером MT полимеризации 1. Многие исследования поведения EB1 в роста конусов использовали времени и предвзятые с помощью компьютера, методы ручной слежения для анализа индивидуального МТС 1-3. Наш подход заключается в количественном глобальные параметры МТ динамики с использованием программного пакета, plusTipTracker 4, следующие приобретения высокого разрешения, живых образов меткой EB1 в культивируемых эмбриональных роста конусов 5. Это программное обеспечение является MATLAB основе, с открытым исходным кодом, удобный пакет, который сочетает в себе автоматическую обнаружения, сопровождения, визуализацию и анализ для фильмов флуоресцентно помечены + чаевые. Здесь мы представляем протокол для использования plusTipTRacker для анализа флуоресцентно меченных комет чаевые + в культивируемых Xenopus роста Хепориз конусов. Тем не менее, это программное обеспечение может также использоваться, чтобы характеризовать динамику МТ в различных типах клеток 6-8.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цель этого метода является получение количественной информации о микротрубочки (MT) плюс-конец-отслеживания белка (+ чаевые) динамику в живых конусы роста. MT + чаевые группа белков, которые локализуются в плюс-концов МТ 9,10. Они выполняют широкий спектр функций по регулированию параметров MT динамической неустойчивости 11, в том числе темпы полимеризации, катастрофы, и спасения. Одним из хорошо использовать метод анализа динамики МТ, чтобы отслеживать поведение наконечника EB1 +, который специфически связывается с растущей МТ плюс-концы 1,12. EB1 известно завербовать несколько других белков в растущей МТ плюс-концы 13,14, и недавно был создан как фактор MT созревания 15, содействия как рост МТ и катастроф частоту 15,16.

Многие исследования МТ динамики внутри роста конусов использовали методы ручной слежения для измерения изменений в динамике EB1-GFP с течением времени 1-3, как EB1 localizatiна МТ плюс-концы могут быть использованы в качестве маркера для полимеризации MT. Ключевым преимуществом для изучения EB1-GFP комет в качестве прокси для роста МТ является то, что MT динамика может быть измерена даже в регионах значительного MT перекрытия. В то время как метод ручной отслеживания EB1-GFP комет предоставил полезную информацию в МТ поведений 1-3, это отнимает много времени и может быть предвзятым. Кроме того, как аномальным ростом конусные поведения, скорее всего, результатом минутных сдвигов в цитоскелета динамики, анализа лишь небольшую группу МТС (обычно необходимо, когда рука-слежение) может пропустить важную информацию.

Таким образом, мы измеряем глобальные параметры динамики MT с помощью пакета программного обеспечения, plusTipTracker 4, после приобретения высокого разрешения, живых образов меткой EB1 в культивируемых эмбриональных роста конусов 5. Это программное обеспечение, разработан в Danuser Lab, был использован в ряде исследований, характеризующих MT динамику в различных типах клеток 6-8. Это с открытым исходным кодом, намэ с детьми, MATLAB на основе пакет, который включает в себя автоматизированное обнаружение, отслеживание, визуализацию и анализ для фильмов флуоресцентно помечены + чаевые. Длинный список конкретные параметры МТ динамики рассчитываются по этим программным обеспечением (см Reference 4 для деталей), но для анализа МТ динамики в конусы роста, наиболее полезные параметры MT скорость дорожки рост (в мкм / мин), трек рост жизни (в секундах), и длина трека рост (в микронах). Программное обеспечение можно загрузить непосредственно с сайта Danuser Lab (под "Software"). В то время как Danuser Лаборатория в настоящее время поддерживает более новый интерфейс для + анализа отслеживания TIP, который включен в пакет программного обеспечения под названием U-трека 2.0, оригинальная, автономные программное обеспечение будет оставаться доступны. Лежащие в основе алгоритмов между двумя программами одинаковы (по крайней мере, по состоянию на 2014 г.), только с разницей в интерфейсных и анализа результатов. Для начинающего пользователя с небольшим MATLAB и / или вычислительной анализа экспериментовENCE, plusTipTracker имеет больше удобных функций, в том числе автоматизированных выходов статистических параметров.

Здесь мы опишем шаги для анализа снимков динамики EB1-GFP в культивируемых Xenopus роста Хепориз конусов. Этот протокол был использован в недавней работе экзаменационной MT динамику 17. Смотрите также Лоури и соавт. 2012 5 Подробные инструкции относительно роста культивирование конусов, выражающих EB1-GFP. Хотя этот документ в первую очередь сосредоточены на изучении динамики EB1-GFP в роста конусов, тот же протокол может быть использован для других типов клеток 17. Для всех типов клеток, интервал времени между кадрами должна быть в пределах 0,5-2 сек для оптимального отслеживания + TIP. Временной интервал до 4 секунд между кадрами можно, но это увеличение интервала времени приводит к дополнительных ошибок трекинга.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол и видео призваны служить в качестве дополнения к оригинальной статье, описывающей пакет программного обеспечения более подробно 4, а также технический отчет, который поставляется с программное обеспечение для скачивания на сайте Danuser Lab. Читателям предлагается рассмотреть эти документы тщательно, если есть дополнительные вопросы, касающиеся использования программного обеспечения.

1 До анализу изображений

  1. Преобразование каждой покадровой фильм в последовательность TIFF (Tagged Image формат файла) графических файлов. Если имеется несколько конусов роста / клетки в данном фильме, первый урожай каждый конус роста / сотовый создать собственную последовательность изображений.
    Примечание: В этом нет необходимости, так как могут быть выбраны отдельные регионы-из-интерес (ROI) в plusTipTracker. Тем не менее, используя меньшие размеры изображения увеличивает скорость вычислительной обработки, так что этот шаг рекомендуется, если существует значительный пробел в изображении.
  2. Сохранить каждую серию TIFF в своей собственнойПапка называется "образы" в пути, что MATLAB установлен на доступ (обратите внимание, что "изображения" с учетом регистра). Чтобы добавить новый путь, перехода к соответствующему файловой директории в окне "Текущая папка", щелкните правой кнопкой мыши по значку каталога, и выберите "Добавить путь - Избранных папок и вложенных папок". Важно, что программное обеспечение папки plusTipTracker быть добавлен к пути, а также.

2. plusTipGetTracks

Примечание: Первый шаг в анализе изображений является обнаружить EB1-GFP комет, связать комет на дорожки, и определить параметры динамики микротрубочек. Это получается с командой "plusTipGetTracks" 4.

  1. Для начала анализа, открытое заявление MATLAB и введите "plusTipGetTracks" в окне командной строки. Это вызовет диалоговое окно Новый появляться.
  2. Нажмите на кнопку "Установить новые проекты" и выберите один (или море) предыдущего TIFF серии изображений, выбрав соответствующую «образы» папку (или каталогов, содержащих «образы» папки). После завершения этого этапа, каталог файлов (roi_1) будет создана (в той же папке, которая содержит «образы»), который будет содержать будущих файлов данных. Примечание: "создать новые проекты" шаг может быть завершена раньше срока, в течение отдельной сессии.
  3. Появится новое окно: "Выберите многоугольник, щелкните правой кнопкой мыши на последней точке, и нажмите на кнопку" Создать маску ». Нажмите на кнопку "ОК". Будет показан первый образ выбранной серии изображений. Используйте мышь, чтобы создать полигон, который охватывает всю совокупность конуса роста. Дважды щелкните мышью, чтобы закрыть полигон.
  4. После того, как полигон был закрыт, появится диалоговое окно: "Вы хотите, чтобы выбрать другой ROI?" Если изображение имеет другой конус роста для анализа, выберите "Да"; в противном случае SИзбранный "Нет".
  5. Выберите проекты, которые будут немедленно проанализированы. Нажмите на кнопку "Выбрать Проекты" и выберите папку (roi_X) для анализа.
  6. Появится экран listSelectGUI. Выберите проект (ы) с левой стороны экрана и переместить их в правой части экрана. Нажмите на кнопку "ОК". Выберите место для сохранения список проектов, и нажмите "Сохранить".
  7. Выберите "Detection", "Tracking", и "пост-обработка". После того, как эти выборы были сделаны, с правой стороны диалогового окна станет настраивается. Настройте каждый параметр.
    1. Эти параметры используются для связи обнаруженных комет в МТ треков. Подробная информация для выбора этих параметров управления для отслеживания включены на страницах 9-10 из технического отчета PDF, которая сопровождает программное обеспечение загрузку пакета; прочитав этот доклад Осторожно В случае возникновения проблем. Для целей отслеживания EB1-GFP комет в Xenopнам Laevis конусы роста, использовать следующие параметры отслеживания: Поиск Радиус Диапазон (пикселей) 5-12, Минимальная длина Sub-Track (фреймы) 3; Макс Gap Длина (кадров) 8; Макс усадка фактор 0,8, Макс угол Нападающий 50, Максимальный угол назад 10, Колебание Радиус 2.5. Эти настройки показаны на рисунке 1.

    Примечание: Максимальная усадка фактор установлен, чтобы уменьшить количество "обратных" пробелов, обнаруженных, как "обратных пробелов" не являются полезными для анализа в контексте роста конусов, учитывая переполненность и возможные ошибки в легкой связей. Кроме того, как угол Максимальный пропускной а также Колебание Радиус устанавливаются относительно высоким, как конус роста МЦ проявляют небольшие частые транслокаций в дополнение к наростов и усадки, и увеличение этих параметров управления позволяет для этого увеличения движения во время стадии связей.
    1. Заполните постобработки Настройки в зависимости от желаемых конкретных условиях получения изображений.
  8. После того, как настройки были настроены, нажмите кнопку "Пуск". Программное обеспечение будет работать в зависимости от того настройки были выбраны. Это может занять несколько минут до нескольких часов, в зависимости от количества выбранных проектов и их размеров. Командное окно отображает время, оставшееся для каждой функции. Когда шаг plusTipGetTracks завершен, Command Window будет отображаться "Готово!"
    Примечание: Длинный список конкретные параметры МТ динамики в настоящее время рассчитывается по этим программным обеспечением (см Reference 4 для деталей), но для анализа МТ динамики в конусы роста, наиболее полезные параметры, чтобы изучить являются MT скорость дорожки рост (в микронах / мин), срок службы дорожки роста (в секундах), а длина трека роста (в микронах).

3. plusTipSeeTracks

Примечание: Теперь, когда микротрубочки треки были определены, функция "plustipSeeTracks" используется для трека визуализации 4. Эта функцияможет иметь несколько выходов для визуализации, включая карты динамики пространственных MT и скоростных фильмов, но здесь, в центре внимания исключительно на использовании "Track Movies", чтобы отобразить MT треки накладываются на конус роста изображений. В то время как plusTipGetTracks может анализировать несколько фильмов, в то время, plusTipSeeTracks может только анализировать один фильм за раз.

  1. Введите "plusTipSeeTracks" в окне командной строки.
  2. После диалоговых нагрузок коробки, нажмите на кнопку "Выбрать проекта". Выберите родительский каталог, содержащий проект для визуализации и нажмите "Выбрать папку". Появится новое окно: "Выберите проект, который вы хотите увидеть". Выберите файл для визуализации, и нажмите "OK".
  3. Далее, нажмите на кнопку "Выбрать Сохраненные ROI". Перейдите в той же папке roi_X как один, выбранный в предыдущем шаге и выберите файл с именем "roiYX".
  4. Нажмите на кнопку "Выбрать Output Directory" для обозначения жздесь MATLAB будет сохранять файлы трек визуализации. Примечание: Мы рекомендуем использовать ту же папку, содержащую остальные данные.
  5. Выберите "Сделать дорожку фильма" и появится экран отображения все дорожки plusTipGetTracks рассчитанных от кончика комет +. Этот шаг сохраняет гусеничный временной ряд в формате фильма, в файле "allTracks_X_X_X". Существует вариант для сохранения видеофильма в качестве AVI, иначе формат по умолчанию в виде файла Quicktime.mov.

4 plusTipGroupAnalysis

Примечание: Эта последняя функция используется для создания группы фильмов для анализа и сравнения их МТ параметров треков.

  1. Введите "plusTipGroupAnalysis" в окне командной строки. Чтобы вручную выбрать группы для сравнения, первая отключите опцию "Auto группу из иерархии". Затем нажмите на "Выбор проектов». Перейдите в родительских каталогах, содержащих все папки roi_Xпроанализировать.
  2. Появится экран listSelectGUI. Выбрать все проекты, чтобы включить в группах с левой стороны экрана и переместить их в правой стороне экрана. Нажмите на кнопку "ОК". Выберите место для сохранения список проектов, и нажмите "Сохранить".
  3. Появится окно: "Пожалуйста, выберите первую группу из списка". Нажмите на кнопку "ОК". Окно listSelectGUI покажет снова. На этот раз, выбрать только те файлы, которые соответствуют первой группе, которые должны быть объединены вместе. Нажмите на кнопку "ОК".
  4. Затем введите имя группы, и нажмите "OK". Появится окно: "выберите другую группу?" Ответ соответственно и продолжить выбор групп. Появится окно: "Выберите место для сохранения списка групп". Перейдите в папку, и нажмите на кнопку "Сохранить".
  5. Нажмите на кнопку "Выбрать Output Directory", чтобы выбрать, где выходные папки будутсохраняются.
  6. Выберите тип группового анализа проводить - нужно ли создавать пул MT треков для каждой группы или одного анализа клеток должны быть выполнены. Рекомендуемые статистические тесты уже обозначены. Чтобы включить все треки в анализе, отменить выбор "Удалить следы на начало / конец фильма". В противном случае, имея этот флажок, выбранный удаляет любые следы роста МТ, которые находятся в процессе, как фильм начинается или заканчивается.
  7. После выбора Анализ Группа сделан, выберите "Сравнить групп".

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Используя это программное обеспечение, как описано здесь будет предоставлять несколько файлов информации которые количественно динамику + чаевые в живых клетках.

Функциональные plusTipGetTracks идентифицирует треки (используя примеры настройки, показанные на рисунке 1), а затем предоставляет параметры относительно кончика треков +. Чтобы просмотреть информацию о том, что программное обеспечение, полученное, перейдите в каталог roi_X, который был создан на шаге 2.2. Папка "по...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PlusTipTracker предоставляет простой графический пользовательский интерфейс для быстрого и автоматического обнаружения практически все видимые EB1-GFP комет в клеточной или роста конуса, связать комет на дорожки, и рассчитывать параметры МТ. В других публикациях сообщается дизайн подобных типов программного обеспечения (например, Маркс и соавт. Также используется количественный анализ меченых динамики EB1 в роста конусов 18). Но, это программное обеспечение, кажется, уникальный в своем простоты досту...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим доктора Гауденца Дануса и членов его лаборатории за создание программного обеспечения plusTipTracker и за полезное обсуждение использования программного обеспечения, в частности Марию Багонис и Себастьяна Бессона. Мы особенно благодарны Медиацентру Бостонского колледжа за помощь и поддержку в создании и монтаже видео. Мы также благодарим членов Лаборатории Лоури за полезные обсуждения и конструктивную критику, а также Эбигейл Антуан за корректуру рукописи. Эта работа была профинансирована премией NIH R00 MH095768 компании LAL.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
программное обеспечение plusTipTrackerDanuser Labhttp://lccb.hms.harvard.edu/software.htmlЭто программное обеспечение может быть размещено на другом веб-сайте в будущем.  Если сайт в списке не существует, выполните поиск по запросу «Danuser Lab Software» в поисковой системе Интернета, чтобы найти сайт.
Программное обеспечение MATLABMathworkshttp://www.mathworks.com/products/matlab/

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 2655-2664 (2003).
  2. Lee, H., et al. The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance. Neuron. , 913-926 (2004).
  3. Purro, S. A., et al. Wnt regulates axon behavior through changes in microtubule growth directionality: a new role for adenomatous polyposis coli. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 8644-8654 (2008).
  4. Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of structural biology. 176, 168-184 (2011).
  5. Lowery, L. A., Faris, A. E., Stout, A., Van Vactor, D. Neural Explant Cultures from Xenopus laevis. Journal of visualized experiments : JoVE. (68), e4232(2012).
  6. Long, J. B., et al. Multiparametric analysis of CLASP-interacting protein functions during interphase microtubule dynamics. Molecular and cellular biology. 33, 1528-1545 (2013).
  7. Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis. The Journal of cell biology. 192, 321-334 (2011).
  8. Nishimura, Y., Applegate, K., Davidson, M. W., Danuser, G., Waterman, C. M. Automated screening of microtubule growth dynamics identifies MARK2 as a regulator of leading edge microtubules downstream of Rac1 in migrating cells. PLoS One. 7, e41413(2012).
  9. Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 309-322 (2008).
  10. Schuyler, S. C., Pellman, D. Microtubule 'plus-end-tracking proteins': The end is just the beginning. Cell. 105, 421-424 (2001).
  11. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312, 237-242 (1984).
  12. Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules. Current biology : CB. 10, 865-868 (2000).
  13. Dixit, R., et al. Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 492-497 (2009).
  14. Li, W., et al. EB1 promotes microtubule dynamics by recruiting Sentin in Drosophila cells. The Journal of cell biology. 193, 973-983 (2011).
  15. Maurer, S. P., et al. EB1 accelerates two conformational transitions important for microtubule maturation and dynamics. Current biology : CB. 24, 372-384 (2014).
  16. Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels. Nature cell biology. 15, 688-693 (2013).
  17. Lowery, L. A., et al. Growth cone-specific functions of XMAP215 in restricting microtubule dynamics and promoting axonal outgrowth. Neural development. 8, 22(2013).
  18. Marx, A., et al. Xenopus cytoplasmic linker-associated protein 1 (XCLASP1) promotes axon elongation and advance of pioneer microtubules. Molecular biology of the cell. 24, 1544-1558 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

EB1 GFPMATLAB

Похожие статьи