Здесь мы представляем протокол для изучения иммунологии отторжения. Представленная хирургическая модель отличается коротким временем операции и лаконичной техникой приема. В зависимости от комбинации штамма донор-реципиент у трансплантированной почки может развиться острое клеточное отторжение или хроническое повреждение аллотрансплантата, определяемое интерстициальным фиброзом и тубулярной атрофией.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Мышь трансплантации почки: Модели аллотрансплантата Отказ
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Отторжение трансплантированной почки у людей по-прежнему является основной причиной заболеваемости и смертности. Мышиная модель трансплантации почки близко воспроизводит как технические, так и патологические процессы, происходящие при трансплантации почки человека. Несмотря на то, что мышиные модели аллогенного отторжения в органах, отличных от почек, существуют и являются более технически осуществимыми, существуют доказательства того, что разные органы вызывают несопоставимые режимы отторжения и динамики, например, временной ход отторжения в сердечном и почечном аллотрансплантате значительно различается в определенных комбинациях штаммов. Эта модель является привлекательным инструментом по многим причинам, несмотря на свои технические сложности. Поскольку гаплотипы инбредных линий мышей хорошо охарактеризованы, можно выбрать комбинации донора и реципиента для моделирования острого отторжения аллотрансплантата путем трансплантации через локусы класса I и II MHC. И наоборот, при трансплантации между штаммами со сходными гаплотипами может быть вызван хронический процесс, при котором у почки аллотрансплантата развивается интерстициальный фиброз и тубулярная атрофия. Мы модифицировали хирургическую технику, чтобы сократить время операции и повысить ее простоту, однако для точного воспроизведения модели все еще необходимо преодолеть кривую обучения. Это исследование позволит определить ключевые моменты хирургической процедуры и поможет в процессе внедрения этой техники.
Введение
Успешная трансплантация почки для лечения почечной недостаточности был впервые описан в 1955 году между монозиготных близнецов 1, с тех пор он стал революционером лечения для пациентов с терминальной стадией почечной недостаточности во всем мире, предлагая как улучшение длины и качества жизни 2. Однако долгосрочная выживаемость трансплантата была затруднена множеством патологических процессов, приводящих к хроническим повреждением трансплантата 3.
Отказ от пересаженной почки у человека остается одной из основных причин заболеваемости, несмотря на значительные улучшения в immunosupporessive схем. Цель разработки модели мыши почечной трансплантации является тесно повторить процесс и патологии, найденный в трансплантации почки человека 4. Skoskiewicz др. Впервые описал модель мыши трансплантации почки в 1973 году 5. Несмотря на передовые микрохирургические навыки необходимы, она является ценным тоол по нескольким причинам: геном мыши был хорошо охарактеризован и есть большое разнообразие экспериментальных методов и методик для исследований на мышах.
Многие группы с использованием мышиной модели трансплантации почки использовали трансплантированной почки в качестве жизни поддержки органа, однако в других исследованиях, и в нашей методики, описанной одного нативного почек, получающей мыши остается на месте в течение всего срока эксперимента 4. Выгода в том, что мышь подвергается одного анестезии и операции тем самым снижая заболеваемость к мыши и риск смерти от второй процедуры. Кроме мышь не страдают от неблагоприятных последствий постепенного почечной недостаточности.
Хотя модели аллогенной отказа существует и в других органах, таких как сердце и кожу, они не всегда непосредственное отношение к трансплантации почки. Существует доказательство того, что эти модели вызывают различные режимы и думика отказа, например, время, конечно, отторжения аллотрансплантата в сердечной и почечной аллотрансплантата существенно отличается в определенных комбинациях деформации 6. Мы описали острых модели почек отторжение аллотрансплантата в линии BALB / C доноров в не-трансгенных FVB / NJ мышей, эта модель показала сотовой опосредованное повреждение с накоплением Т-клеток и макрофагов 7. В качестве альтернативы мы также описали модель хронического повреждения трансплантата, который проявляет интерстициальный фиброз и трубчатую атрофию, это объясняется пересадки почки от C57BL / 6 BM12 доноров в C57BL / 6 получателей, как эти мыши характеризуются одного МНС класса II локусов MIS -match 8.
Несколько аспекты трансплантации были изучены с использованием мышиной модели трансплантации почки в том числе острого отторжения, клеточного и гуморального отторжения, ишемии, реперфузионного повреждения и испытания той новых терапевтических агентов. Мы модифицировали хирургическую тechnique сократить время работы и улучшить простоту операции. Особенно мы описали одновременное донора и подготовка получателя и упрощенную технику сосудистого анастомоза за счет использования непрерывный аорты патч анастомоза. Это видео и рукопись обеспечит ключевые моменты, чтобы помочь в создании этой техники.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Соответствующие национальные и местные институциональные этика должна быть на месте, прежде чем выполнять эксперименты на животных. В частности, в Великобритании следующие эксперименты были проведены в соответствии с животных (научные процедуры) Закон 1986 года Где два микрохирурги доступны одновременно работать донор хирург должен выполнить шаги 1,1 до 1,16, то 3,1 до 3,5, в то время как хирург получатель выполняет 2,1 до 2,8 . Для одного оператора, что шаги могут быть выполнены последовательно.
1 Донор Подготовка
Примечание: Эта процедура, представленные здесь, донора C57BL / 6 BM12 и получателя C57BL / 6 мышей-самцов в возрасте от 8 до 16 недель с массой тела, превышающей 20 г. Однако эта процедура может быть воспроизводимо выполняется на множестве линий мышей. Данные, представленные в разделе репрезентативные результаты были получены от мышей C57BL / 6, C57BL / 6 и BM12 линии BALB / C мышей.
- Процедуры Проведение Усинг стерильные хирургические инструменты и расходные материалы (автоклавного), с начинаниях сохранить рабочую зону максимальную стерильность. Выполните подготовку донорской одновременно с подготовкой получателя, если два хирурга доступны.
- Обезболить мыши путем внутрибрюшинной инъекции (31G иглы) медетомидина (0,5 мг / кг) и кетамина гидрохлорида (200 мг / кг). Это приводит к анестезии плоскости, которая ведется в течение 4 часов, обеспечивая достаточно времени для всей процедуры выполняться. Справочная анестезия не требуется.
- Убедитесь, что мышь не наркоз (ответа на носок щепотку).
- Бритье живот мыши и удалить любые свободные волосы с помощью клейкой ленты.
- Наведите на спине на стерильно завернуто подогревом коврик и свободно иммобилизации конечности стерильной липкой лентой.
- Монитор мыши на протяжении всей процедуры для термических ожогов. Если можно использовать не электрический источник тепла.
- Нанесите смазку глаз и саnitize брюшную стенку разбавленным раствором йода.
- Сделайте срединный разрез в брюшной полости, чтобы войти в брюшную полость и вставить 3 см Calibri животе втягивающим.
- Применить подогретое физиологический раствор, чтобы держать кишечник и хирургическую область влажной и избегать ненужного высыхание внутренних органов.
- Накройте мышь с стерильными пеленками и двигаться кишечник налево оператора (правой мыши), чтобы разоблачить аорты, полой вены и левую почку.
- Нанесите храповиком Forcep в желудок и тянуть кверху, чтобы выставить основные сосуды и левую почку полностью. Пакет влажные стерильные тампоны (2 мм х 2 мм) в брюшную полость для втягивания ткани от хирургической области, такие как долей печени, семенных пузырьков и кишечника.
- Изолировать левую почку от окружающей adventia, жиров и левого надпочечника в брюшную полость по прямо рассекает соединительной ткани с помощью тоненького кончика пинцета. Поместите закрытых кончики щипцов между областями, что Neред должны быть разделены и медленно позволяют кончики Forcep, чтобы открыть рассекать пространство.
- Изолировать левой почечной вены путем лигирования с последующим делением левой надпочечниковой вены и оставил половые железы вены с 9 / O нейлона. Поместите шва близко к почечной вене.
- Перевязывать и разделить мочеточник с 7 / O шелковой нити близко к мочевого пузыря, оставляя шов заканчивается долго. Эти концы длиной шовные будет использоваться при почка собирают и необходимы для мочеточника анастомоза.
- Мобилизовать и полностью рассекать аорты и полой вены главно и уступает почечной артерии и вены использовать тонким наконечником пинцет, чтобы тупо рассекать лимфатические сосуды и жир из передней и боковых сосудов.
- Найдите тканей самолет между аортой и полой вены и медленно распространяются пинцетом. Медленно откройте кончики точная наклоненная щипцов распространяться ткани с минимальной травмой.
- Свяжите свободную 7 / O шелк вокруг аорты верхней и нижней в почечной артерии, проходя под углом штрафнаконечник щипцы вокруг задней сосудов и чертежные шовного материала через. Эти швы будут ужесточены до извлечения почки, чтобы ретроградной перфузии университет Висконсина решения.
2 Получатель Подготовка
В соответствии с подготовки донора выполните шаги 1,2 до 1,8.
- Перемещение кишечник направо оператора (левой мыши), чтобы разоблачить аорты, полой вены. Обложка кишечник с помощью стерильного физиологического раствора пропитанной тампоном.
- Выполните правый нефрэктомию путем лигирования правой почечной артерии и вены вместе с 7/0 шелковой нити, а затем разделить.
- Лигировать правого мочеточника с 7 / O шелковой нити и разделить.
- Мобилизовать и полностью рассекать аорты и нижней полой вены в почечной артерии и вены, как описано в шаге 1,14 и 1,15. Убедитесь, полный рассечение между аортой и полой вены. Позаботьтесь, чтобы сохранить внутренней семенной артерии, которая проходит кпереди от полой вены и aortнаряду с лимфатической расслоения.
- Определить поясничные сосуды, работающие в забрюшинного пространства от полой вены и вены к позвоночнику, перевязывать с 9 / O шелка в непрерывности, нет необходимости делить сосуды.
- Определите достаточное пространство для размещения микрососудистых зажимы с пространством между сосудистых анастомозов.
- Администрирование внутривенно гепарин (5 единиц) через спинной полового члена вены.
3 донорской почки поисковая
Затянуть шелковые 7 / вывода связей, которые были поставлены вокруг низшие и высшие аорты изолировать почку от артериального кровообращения.
- Настаивать ретроградные холодные 0,2 - 0,5 мл университет Висконсина раствора с иглой (31G) в аорту.
- Разделите аорты в течение швов и разделить почечной вены на ее стыке с полой вены удалить почку и почечной артерии с длиной аорты. Разделите поясничные сосуды, вытекающие из аорты, если они присутствуют, жОтсутствует перевязки.
- Поместите почку в холодном физрастворе на стерильный тампон в культуральной чашке.
- Усыпить мыши-донора путем смещения шейных позвонков.
4 трансплантации почки - Подготовка почек
- Создание аорты путем деления участок стенки аорты в продольном направлении прямо напротив почечных артерий. Выявление любых люмен сосудов в патче, которые должны быть лигирована или избежать при выполнении артериальное анастомоза.
- Поместите 10 / вывода шов снаружи внутрь почечных вен просвет главно и второй отдельный шва книзу. Швы используются для разделения надпочечников вену и гонадной вены может быть использован, чтобы ориентироваться на судно.
- Поместите почку правом фланге получателя (Рисунок 1.1) и обеспечить швы имеют хорошие возможности для обеспечения сосудистые анастомозы может быть завершена без швов становится переплетенных в мазках или других инструментов.
5 почек Transplanставление - Сосудистая Anastomosis
Применить микрососудистых зажимы первый книзу то главно охватывающих полой вены и аорты.
- Сделать ventomy с иглой (31G) выкалыванием переднюю стенку полой вены. Флеш кровь из полой вены путем введения примерно 50 мкл 0,9% NaCl.
- Расширить venotomy помощью тоненького кончика щипцы, открывая их в venotomy так, чтобы длина эквивалентно диаметру доноров почечной вены.
- Поместите 10 / вывода превосходную шов (который уже в просвете почечной вены) сначала на вершине venotomy (Рисунок 1.2) и присоединиться заднюю стенку анастомоза в работающей шва до уступает вершина не будет достигнута (Рисунок 1.3).
- Поместите 10 / вывода уступает шва и связать сначала с одной узла (Рисунок 1.4) затем связать с управлением шва от задней стенки.
- Использование уступает шов создать переднюю Walл анастомоза (Рисунок 1.5) с управлением шва и галстук на верхнем конце шва на верхней вершине (рисунок 1.6).
- Создайте aortotomy, подняв стенки аорты с пинцетом и резки эллиптическую патч с ножницами (примерно aortotomy должна быть пятая часть окружности аорты и три раза просвета почечной артерии в длину).
- Поставьте шов 10 / вывода в верхней точке аорты патч снаружи внутрь (рисунок 1.7) и пройти через аорту, чтобы связать вне сосудов в верхней вершине aortotomy.
- Создать артериальное анастомоза с работы шов, начиная главно (Рисунок 1.8) анастомоза доноров патча в аорту получателя, заботиться, чтобы не стягивать анастомоза, связывая нити слишком туго (Рисунок 1.9).
- Удалить низшие сосудистые зажимы сначала тогда превосходную зажим для reperfuse почку (Рисунок 1.10 и 1.11). Видимый перистальтика мочеточника возможно увидеть, если адекватного кровоснабжения в мочеточнике достигается.
6 трансплантации почки - мочеточников Anastomosis
- Разделите все вложения мочевого пузыря из брюшной стенки.
- Pass иглу (21G) от слева направо мочевого пузыря через обе стены.
- Поместите прямые концы Forcep в просвете иглы и передать обратно и через мочевой пузырь, так что в настоящее время щипцы, проходящей в направлении справа налево из левой части мочевого пузыря.
- Draw шва на мочеточник доноров через мочевой пузырь, так что мочеточник проходит в левом дефекта мочевого пузыря, то из правой стороны.
- Шовный адвентиции мочеточника к адвентиции мочевого пузыря с тремя односпальными узловыми швами вокруг точки входа с 9 / O нейлона шва на круглом здоровых иглы.
- Разрежьте мочеточника проксимальнее лигатуры, тем самым открыв йэлектронной мочеточника, чтобы позволить моче протекать и позволяют конец мочеточника, чтобы убрать в тело мочевого пузыря. Видимый производство мочи может наблюдаться наряду с кровотечением из пригородных мочеточника сосудов.
- Закройте правую дефект сторона мочевого пузыря с одной прерванной 9 / O шелковой нити.
7 Восстановление и послеоперационный уход
Замените желудочно внутренности в брюшную полость в исходной ориентации и закрыть брюшную стенку путем аппроксимации прямых мышц с 6 / O рассасывающимся швом.
- Приблизительная кожу клипов металла кожи.
- Частично обратном анестезии с подкожной инъекции atipamazole гидрохлорид (10 мкл / г).
- Администрирование обезболивание путем подкожной бупренорфина гидрохлорида (0,05 мг / кг) и для инъекций поддержки жидкости 1 мл подкожно 0,9% NaCl.
- Восстановление мышь в потеплением шкафу при 28 ° С в течение 24 до 48 часов. Соблюдайте мышь для болезни дозавершение эксперимента.
- Удалить клипы металла кожи 7 - 10 дней после операции.
- После того, как эксперимент завершен усыпить мыши путем смещения шейных позвонков.
- Удалить и собирать контралатеральной почки и аллотранспланта гистологического анализа.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Почечная отторжение аллотрансплантата может быть оценена с помощью гистологического анализа methacarn фиксированной парафин тканевых секций трансплантированной почки (рисунок 2). Изотрансплантат трансплантация почки между сингенным мышей приводит к почечной реперфузии ишемического повреждения, однако на 4 недели трубочки выздоровели и гистологически сопоставимы с родных почек. Острое отторжение может моделироваться / 6 трансплантации почки C57BL в BALB / с получателей, в течение 1 недели есть диффузная ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Наиболее хорошо описаны способ для выполнения артериального анастомоза является использование дистальный аорты донора, с почечной артерии в продолжение, в виде конца в сторону, чтобы аорты реципиента. Мы описали использование аорты патч, похожий на 'Карелл патч "зеркалирования, что выступал в трансплантации почки человека, который мы считаем более удобным. Хотя сообщения в литературе донора и реципиента оперативного времени редки мы считаем, что использование аорты патч к получателя аорты вместо конца в сторону...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Финансирование из почек исследования Великобритании, Королевский колледж хирургов Эдинбурга и Европейского общества трансплантации органов поддержали это исследование.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Хирургические инструменты | |||
| Тупые препарирующие ножницы | Инструменты для тонкой науки | 14072-10 | Для разрезания кожи |
| Изогнутые ножницы Castoviejo | Fine Science Tools | 15017-10 | Для резки тканей |
| Пружинные ножницы – прямые | Fine Science Tools | 15000-08 | Для резки швов |
| Зубчатые щипцы 1x2 зуба | Fine Science Tools | 11021-12 | |
| 2 x Fine Tip щипцы (Dumont No.5) | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Угловые щипцы с тонким наконечником (Dumont No. 5/45) | Fine Science Tools | 11253-25 | Для тупого препарирования |
| Изогнутый щипцы с тонким наконечником (Dumont No.7) | Fine Science Tools | 11273-22 | Полезны для пропускания по сосудам |
| Изогнутый Crile Haemostat | Fine Science Tools | 1300-04 | |
| Аппликатор с микрозажимом и замком | Fine Science Tools | 18056-14 | |
| 2 x Micro serrefines ширина пружины 2 мм, длина челюсти 4 мм | Fine Science Tools | 18055-04 | Микрососудистые зажимы |
| 2 x Colibri 3 см проволочный ретрактор | Fine Science Tools | 17000-03 | |
| Иглодержатель Castroviejo с замком | Fine Science Tools | 120660-01 | |
| Аппликатор для раны | Fine Science Tools | 12031-07 | |
| 7 мм Clips для ран 7 мм | Fine Science Инструменты | 12032-07 | Снять через 7-10 дней после операции |
| Оборудование | |||
| OPMI pico микроскоп | Carl Zeiss | S100 | |
| Термоблок прижигания с тонким наконечником | Geiger | 150A | |
| Нагревательная электронная прокладка | Cozee Cumfort | n/a | |
| Euroklav 23-S | Melag | n/a | Autoclave |
| Одноразовый оборудование | |||
| 7/O Шелковый плетеный шовный материал | Pearsall | 30514 | |
| 10/O Дафилон (полиамид) шовный материал | B-Braun | ||
| 6/O Vicryl (plygalectin) | Ethicon | W9537 | |
| Обычная игла со скосом, 1 дюйм, 21G | Bection, Dickinson and Company | 305175 | Для анастамоза мочеточника |
| Обычная игла со скосом, 5/8 дюйма, 25G | Bection, Dickinson and Company | 305122 | |
| Обычная игла со скосом, 1/2 дюйма, 30G | Bection, Dickinson and Company | 304000 | |
| Инсулиновая игла 1 мл, 29 г | Bection, Dickinson and Company | 324827 | |
| Инсулиновая игла 0,3 мл, 30 г | Bection, Dickinson and Company | 324826 | |
| 1 мл шприц с скользящим наконечником | Bection, Dickinson and Company | 300184 | |
| 5 мл шприц с скользящим наконечником | Bection, Dickinson and Company | 302187 | |
| Wypall бумажные тампоны | Kimberley-Clark | L40 | стерилизовано автоклавом |
| Ватные палочки | Johnson and Johnson | н/а | стерилизованы автоклавом |
| Простые простыни | Guardian | CB03 | стерилизованные автоклавом |
| Чашка для клеточных культур 60 мм x 15 мм | Corning Incorporated | 430166 | |
| Дозирующий штифт | B-Braun | DP3500L / 413501 | Используется с NaCl 0,9% |
| Реагенты и препараты | |||
| (Lacri-Lube) Белый мягкий парафин 57,3%, минеральное масло 42,5% и ланолиновые спирты 0,2% | Allergan Ltd | 21956GB10X | |
| (Videne) Повидон-йод 10% | Ecolab Ltd | PL 04509/0041 | |
| (Vetalar V) Кетамина гидрохлорид | Pfizer Animal Health | Vm 42058/4165 | 100мг/мл раствор (доза 200мг/кг) |
| (Domitor) Медетомидина гидрохлорид | Orion Pharma | Vm 06043/4003 | 1 мг/мл (доза 0,5 мг/кг) |
| (Vetergesic) Бупернорфина гидрохлорид | Alsto Animal | Health Vm 00063/4002 | 0,3 мг/мл (доза 0,05 мг/кг) |
| (Антиседан) Атипамезола гидрохорид | Orion Pharma | Vm 06043/4004 | 5 мг/мл (доза 2 мг/кг) |
| University of Wisconsin Solution | Belzer Bridge to Life | н/д доза | примерно 500 мкл/мышь |
| NaCl 0,9% | Baxter | FKE1323 | |
| гепарина сульфат | непатентованный | н/д | 5000 единиц/мл (доза 5 единиц/мышь) |
Ссылки
- Guild, W. R., Harrison, J. H., Merrill, J. P., Murray, J. Successful homotransplantation of the kidney in an identical twin. Trans. Am. Clin. Climatol Assoc. 67, 167-173 (1955).
- Wolfe, R. A., et al. Comparison of mortality in all patients on dialysis, patients on dialysis awaiting transplantation, and recipients of a first cadaveric transplant. N. Engl. J. Med. 341, 1725-1730 (1999).
- Nankivell, B. J., Alexander, S. I. Rejection of the Kidney Allograft. N. Engl. J. Med. 363, 1451-1462 (2010).
- Tse, G. H., Hughes, J., Marson, L. P. Systematic review of mouse kidney transplantation. Transplant International. 26, 1149-1160 (2013).
- Skoskiewicz, M., Chase, C., Winn, H. J., Russell, P. S. Kidney transplants between mice of graded immunogenetic diversity. Transplant. Proc. 5, 721-725 (1973).
- Zhang, Z., et al. Pattern of liver, kidney, heart, and intestine allograft rejection in different mouse strain combinations. Transplantation. 62, 1267-1272 (1996).
- Qi, F., et al. Depletion of cells of monocyte lineage prevents loss of renal microvasculature in murine kidney transplantation. Transplantation. 86, 1267-1274 (2008).
- Dang, Z., Mackinnon, A., Marson, L. P., Sethi, T. Tubular atrophy and interstitial fibrosis after renal transplantation is dependent on galectin-3. Transplantation. 93, 477-484 (2012).
- Jabs, W. J., et al. Heterogeneity in the Evolution and Mechanisms of the Lesions of Kidney Allograft Rejection in Mice. Am. J. Transplant. 3, 1501-1509 (2003).
- Lin, T., et al. Deficiency of C4 from Donor or Recipient Mouse Fails to Prevent Renal Allograft Rejection. Am. J. Pathol. 168, 1241-1248 (2006).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
