Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Экс естественных Модель олигодендроцит-направленного Т-клеток Атака в острых мозга Ломтики

6.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52205

⸱

5 февраля 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, University of Münster, 2Germany and Interdisciplinary Center for Clinical Research (IZKF) Münster, 3Institute of Physiology I - Neuropathophysiology I, University of Münster

В этой статье

Краткое содержание

Для изучения механизмов демиелинизации и апоптоза нейронов при поражениях коры головного мозга при воспалительных демиелинизирующих заболеваниях используются различные животные модели. Здесь мы описываем подход ex vivo с использованием специфичных для олигодендроцитов CD8+ Т-клеток на срезах мозга, что приводит к олигодендроглиальной и нейрональной гибели. Обсуждаются возможные варианты применения и ограничения модели.

Аннотация

Гибель олигодендроцитов, сопровождающаяся разрушением нейронов и аксонов, является типичной гистопатологической находкой при корковых и подкорковых поражениях серого вещества при воспалительных демиелинизирующих расстройствах, таких как рассеянный склероз (РС). При этих заболеваниях обнаруживаются в основном CD8+ Т-клетки предполагаемой специфичности к антигенам, связанным с миелином и олигодендроцитами, так что апоптоз нейронов при поражениях серого вещества может быть побочным эффектом этих клеток. Для изучения основных механизмов упомянутых патофизиологических процессов созданы различные типы животных моделей. Однако, несмотря на то, что они имитируют некоторые аспекты рассеянного склероза, невозможно проанализировать точный механизм и временной ход «боковой» гибели нейронных клеток. Чтобы ответить на этот курс, здесь мы покажем протокол изучения механизмов и временной реакции повреждения нейронов после атаки CD8+ Т-клеток, направленной на олигодендроциты. Чтобы нацелиться только на миелиновую оболочку и олигодендроциты, активируемые in vitro олигодендроцит-специфичные CD8+ Т-клетки переносят в остро изолированные срезы мозга. После определенного инкубационного периода миелин и повреждение нейронов могут быть проанализированы в различных областях, представляющих интерес. Будут обсуждены потенциальные варианты применения и ограничения этой модели.

Введение

Гибель олигодендроцитов и разрушение миелиновой оболочки, сопровождающиеся потерей нейронов и аксонов, являются типичными патологическими признаками поражения серого вещества у людей, страдающих рассеянным склерозом (РС)1,2. На данный момент корковые поражения можно разделить на три различных подтипа2: субпиальные, внутрикортикальные и лейкокортикальные поражения. По сравнению с бляшками белого вещества, инфильтраты характеризуются преобладанием CD8+ Т-клеток, что предполагает их возможную решающую роль в воспалении сероговещества. Кроме того, олигоклональные экспансии в крови, спинномозговой жидкости (СМЖ) и в воспалительных поражениях могут быть обнаружены для самих CD8+ Т-клеток4-6.

В соответствии с этим, предполагается, что CD8+ Т-клетки могут быть специфичны к различным белкам миелина7,8. Действительно, CD8+ Т-клетки обнаруживаются вблизи олигодендроцитов и миелиновых оболочек9,10, которые демонстрируют экспрессию MHC I11 и, следовательно, могут быть ответственны за потерю миелиновой оболочки. Этот процесс часто наблюдается вместе с обширными «коллатеральными» повреждениями нейронов и аксонов в сером веществе центральной нервной системы (ЦНС)1,2. На самом деле, прямая и косвенная гибель олигодендроцитов и нейронов индуцируется CD8+ Т-клетками по двум различным механизмам: (i) набухание и разрыв клеточной мембраны из-за образования цитотоксических гранул после высвобождения перфоринов и гранзимов и (ii) лигирование к рецепторам Fas или экспозиция FasL на их поверхности8,12,13.

Различные типы животных моделей создаются для изучения основного механизма упомянутых процессов. В этом отношении праймированные CD8+ Т-клетки, специфичные к аутоантигенам с индуцированной экспрессией в глиальных клетках ЦНС, таких как олигодендроциты или астроциты, могут быть адоптивно перенесены для анализа «коллатеральной» гибели нейронов и аксонов в сером веществе впоследствии14,15. Проведение таких экспериментов in vivo является большим подспорьем для имитации некоторых патофизиологических аспектов рассеянного склероза, однако этот подход не подходит для определения основного механизма и кинетики повреждения аксонов и апоптоза нейронов.

Чтобы преодолеть эти ограничения, был разработан подход ex vivo для изучения механизмов и временного хода гибели нейрональных клеток после атаки CD8+ Т-клеток, направленной на олигондендроциты. Поскольку иммунные клетки должны нацеливаться только на олигодендроциты и, следовательно, на продукцию миелиновой оболочки, используются ОТ-I Т-клетки, ограниченные МНС класса I, овальбумин (OVA). Эти клетки впоследствии переносятся в срезы мозга, полученные от мышей, селективно экспрессирующих OVA в олигодендроцитах (мыши ODC-OVA)17.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты на мышах должны быть выполнены в соответствии с руководящими принципами соответствующей институциональной уходу и использованию животных комитета.

1. Общие Комментарии к экспериментах на мышах

  1. Держите мышей под патогена условиях и позволяют им доступ к пище и воде вволю.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать возрасту и полу соответствием мышей в экспериментальных группах, потому что иммунологические образцы могут варьироваться в зависимости от возраста и пола.

2. Подготовка и активация OVA-специфических CD8 + Т-клетки (ОТ-я)

  1. Выполните стимуляции OT-я Т-клеток, как описано ниже 5 дней перед приготовлением кусочки мозга.
    Примечание: 5 х 10 5 активированного CD8 + эффекторные ОТ-I Т-клеток (CD8 + Т-клетки трансгенных мышей, распознающих только OVA 257-264 пептида в контексте молекул MHC-I) необходимы в срезе концентрации 5 х 10 5 был выбран экспериментсоюзника в оптимальной отдавать предпочтение хорошее взаимодействие клетка-клетка сразу, что клетки начинают мигрировать в часть и, в то же время, количество клеток не было слишком высоким, чтобы вызвать чрезмерную реакцию, позволяющую одной клетки подсчета 8,18.
  2. Подготовка среды для культивирования ОТ-I Т-клеток. Дополнение 500 мл DMEM с 5% фетальной телячьей сыворотки (FCS), 10 мМ HEPES, 2 мМ L-глутамина, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола, 1% заменимых аминокислот и 25 мкг / мл гентамицина. Хранить среду при 4 ° С до использования.
  3. Снимите селезенки OT-I трансгенных мышей, в ссылке 16. Передача их в подготовленную среду.
  4. Генерация суспензии отдельных клеток путем затирания селезенки через сито и центрифуги суспензии 70 мкм при 300 х г в течение 5 мин, 4 ° С.
  5. Инкубируйте клеточной суспензии 5 мл аммония-хлорида калия (ACK) буфера (150 мМ NH 4 Cl, 10 мМ КНСО 3, 0,1 мМ ЭДТА, рН 7,3) в течение 5 мин, чтобы лизировать красные кровяные клетки.
  6. Стоп incubatiна 10 мл среды и центрифуги его снова, как описано выше.
  7. Развести клеточной суспензии в среде и рассчитать число. Пластина клеток при плотности 3 × 10 7 клеток / лунку в 12-луночный планшет и простое их путем инкубации с OVA 257 - 264 (SIINFEKL; 1 нМ) и интерлейкин-2 (ИЛ-2) (500 МЕ / мл) в течение 5 дней.
  8. После 4 дней, добавить IL-2 в концентрации 500 МЕ / мл снова.
  9. После стимуляции, очистить OT-I T-клеток из клеточной суспензии с помощью отрицательного отбора, основанного мышь набор для выделения Т-клеток CD8 + в соответствии с инструкциями изготовителя. Очистка основана на истощение всех не CD8 + клеток с использованием коктейля антител против CD4, CD11b, CD11c, CD19, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, MHC класса II, трет-119, и TCRγ / δ, которые затем отбрасывают с использованием магнитных колонки для элюирования очищенных CD8 + Т-клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Критические шаги в этом процедуры, применяемыеRe обозначены производит: важно, что реакция включает в себя только отдельные клетки, поскольку присутствие комков может блокировать столбец в течение стадии элюирования; Подсчет клетки перед добавлением Byotin коктейль имеет важное значение для степени чистоты образца и процедура должна быть выполнена на льду, чтобы минимизировать неспецифических привязки антител.

3. Подготовка острой мозга ломтиками и сотрудничеству в культуре с OT-I Т-клеток

  1. До подготовки острого мозга ломтики 19, подготовить placedine ледяной физиологический раствор, используя 200 мМ сахарозы, 20 мм Трубы диаметром 2,5 мм KCl, 1,25 мМ NaH 2 PO 4, 10 мМ MgSO 4, 0,5 CaCl 2 и 10 мМ декстрозы и искусственный спинномозговой жидкости (ACSF) с помощью 125 мМ NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 24 мМ NaHCO 3, 2 мМ MgSO 4, 2 мМ CaCl 2, 10 мМ декстрозы. Отрегулируйте рН каждого раствора 7,35 по Усинг NaOH. Перед регулировкой рН ACSF, раствор должен быть барботируют смесью 95% O 2 и 5% CO 2.
  2. Pre-охлаждать решения.
  3. Обезболить 8 - 10 недель старых мышей (например, C57BL / 6 в качестве контроля или трансгенных ODC-OVA мышей 17 с помощью ингаляции 5,0% изофлуран, 5,0% галотана или инъекции 100 мг / кг кетамина и 10 мг / кг веса тела с помощью ксилазина IP Подождите для анестезии и использовать ОО щепотку для оценки уровня анестезии и обезглавить их сразу. Эвтаназии мышей, как в учреждениях для животных и использовать критерии Комитет по эвтаназии.
  4. Положите мышь в брюшной положении. Лечить и сократить кожу головы в сагиттальной. Откройте кости черепа сагиттально, извлечь мозг быстро с помощью совка и закрепить его на пластины vibratome с помощью клея.
  5. Заполните табличку с подготовленной placedine ледяной физиологическом растворе.
  6. Вырезать 300 мкм корональные срезы с vibratome.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура знаюп для получения жизнеспособных образцов интактной ткани, подходящие для функциональных клеточных исследований в течение периода времени, равного по меньшей мере 8 ч 19-21. Действительно, после этого периода времени, уже начиная после 6 часов, препарат показал снижение качества, а именно изменения в основных и функциональных свойств, таких как генерации потенциала действия и распространения.
  7. После секционирования, передавать один кусок непосредственно в каждую лунку 12-луночного планшета, заполненной ACSF.
  8. Добавить внимательно 5 х 10 5 OT-я Т-клеток в срезе.
  9. Инкубируйте ломтики в течение до 8 ч в инкубаторе (37 ° С, 5% СО 2).
  10. После инкубационного периода, урожай ломтиками и вставлять их с помощью октября соединение тканей-Tek и заморозить их в жидком азоте. Хранить их при температуре -20 ° С для дальнейших гистологических исследований в например, оценку нейрональной структуры (например, с использованием анти-MAPII или анти-антитела синаптофизина) или апоптоз (например, с использованием анти-каспазы-3 антитела и анти-анти NeuNорганы) в соответствии со стандартными процедурами.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

После инкубации срезов головного мозга с олигодендроцитов-направленный CD8 + Т-клеток, олигодендроциты, а также нейроны претерпевают апоптоз (2а и 1С, соответственно). Гистологические признаки апоптоза (например, ген каспазы-3, Tunel) могут быть обнаружены после ранней 3 ч инкубации. Инкубационный период не должен быть больше, чем 8 часов для того, чтобы гарантировать хорошее качество подготовки и воспроизводимых результатов. Апоптоза клетки могут быть найдены на всем протяжении кусо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Различные модели на животных были описаны в последние десятилетия для решения патологические особенности воспалительных заболеваний демиелинизирующих как MS. В естественных условиях мышей и крыс модели широко используются для выполнения патофизиологические особенности заболевания, а именно, анализ последствий демиелинизации и процессы ремиелинизации и приобщены эпизодов воспаления и нейродегенерации. Тем не менее, только экс естественных подход позволяет анализировать точные основные механизмы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Междисциплинарным центром клинических исследований (IZKF) Münster (SEED 03/12, SB), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB TR128, TP B6 to S.G.M. ME3283/2-1 to S.G.M.) и Innovative Medizinische Forschung, Münster (I-BI111316, SB и SGM).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
12-луночный планшетCorning3513
2-меркаптоэтанолGibco31350-010
2-метилбутанRoth3927.1
70 &; m ситечкоFalcon352350
CaCl2Merck1.02382.0500хлорид кальция
CD8+-изоляционный наборMiltenyi Biotech130-090-859
D(+)-глюкозаMerck1.08337.1000
DMEMGibco31966-021теплый в 37 ° C водяная баня перед применением
EDTASigmaE5134
FCSPAA LaboratoriesA15-151сыворотка теленка
плода GentamicinGibco15750-060
HEPES 1 MGibco15630-050
IL-2Peprotech212-12
IsofluranAbbott05260-05
KClMerck1.04933.0500хлорид калия
KHCO3SigmaP9144гидрокарбонат калия
L-глутаминGibco35050-038
MgSO4Merck1.05886.0500сульфат магния
NaClSigma31434хлорид натрия
2PO4 * H2OMerck1.06346.0500гидрофосфат натрия
NaHCO3Merck1.06329.0500гидрокарбонат натрия
NaOHMerck1.09137.1000гидроксид натрия
NH4ClSigma213330хлорид аммония
Заменимая аминокислотаGibco11140-050
OVA (257-264)GenscriptRP10611овальбумин
PIPESSigmaP6757
SucroseMerck1.07687.1000
Tissue-Tek OCTSakura4583

Ссылки

  1. Moll, N. M., et al. Cortical demyelination in PML and MS: Similarities and differences. Neurology. 70 (5), 336-343 (2008).
  2. Peterson, J. W., Bo, L., Mork, S., Chang, A., Trapp, B. D. Transected neurites, apoptotic neurons, and reduced inflammation in cortical multiple sclerosis lesions. Ann Neurol. 50 (3), 389-400 (2001).
  3. Bo, L., Vedeler, C. A., Nyland, H. I., Trapp, B. D., Mork, S. J. Subpial demyelination in the cerebral cortex of multiple sclerosis patients. J Neuropathol Exp Neurol. 62 (7), 723-732 (2003).
  4. Babbe, H., et al. Clonal expansions of CD8(+) T cells dominate the T cell infiltrate in active multiple sclerosis lesions as shown by micromanipulation and single cell polymerase chain reaction. J Exp Med. 192 (3), 393-404 (2000).
  5. Junker, A., et al. Multiple sclerosis: T-cell receptor expression in distinct brain regions. Brain. 130 (11), 2789-2799 (2007).
  6. Skulina, C., et al. Multiple sclerosis: brain-infiltrating CD8+ T cells persist as clonal expansions in the cerebrospinal fluid and blood. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (8), 2428-2433 (2004).
  7. Friese, M. A., Fugger, L. Autoreactive CD8+ T cells in multiple sclerosis: a new target for therapy. Brain. 128 (8), 1747-1763 (2005).
  8. Melzer, N., Meuth, S. G., Wiendl, H. CD8+ T cells and neuronal damage: direct and collateral mechanisms of cytotoxicity and impaired electrical excitability). FASEB J. 23 (11), 3659-3673 (2009).
  9. Booss, J., Esiri, M. M., Tourtellotte, W. W., Mason, D. Y. Immunohistological analysis of T lymphocyte subsets in the central nervous system in chronic progressive multiple sclerosis. J Neurol Sci. 62 (1-3), 219-232 (1983).
  10. Hauser, S. L., et al. Immunohistochemical analysis of the cellular infiltrate in multiple sclerosis lesions. Ann Neurol. 19 (6), 578-587 (1986).
  11. Hoftberger, R., et al. Expression of major histocompatibility complex class I molecules on the different cell types in multiple sclerosis lesions. Brain Pathol. 14 (1), 43-50 (2004).
  12. Göbel, K., et al. Collateral neuronal apoptosis in CNS gray matter during an oligodendrocyte-directed CD8(+) T cell attack. Glia. 58, 469-480 (2010).
  13. Melzer, N., et al. Excitotoxic neuronal cell death during an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack in the CNS gray matter. J Neuroinflammation. 10, 121(2013).
  14. Huseby, E. S., et al. A pathogenic role for myelin-specific CD8(+) T cells in a model for multiple sclerosis. J Exp Med. 194 (5), 669-676 (2001).
  15. McPherson, S. W., Heuss, N. D., Roehrich, H., Gregerson, D. S. Bystander killing of neurons by cytotoxic T cells specific for a glial antigen. Glia. 53 (5), 457-466 (2006).
  16. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76 (1), 17-27 (1994).
  17. Cao, Y., et al. Induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in transgenic mice expressing ovalbumin in oligodendrocytes. Eur J Immunol. 36 (1), 207-215 (2006).
  18. Göbel, K., et al. CD4(+) CD25(+) FoxP3(+) regulatory T cells suppress cytotoxicity of CD8(+) effector T cells: implications for their capacity to limit inflammatory central nervous system damage at the parenchymal level. J Neuroinflammation. 9, 41(2012).
  19. Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).
  20. Meuth, S. G., et al. Contribution of TWIK-related acid-sensitive K+ channel 1 (TASK1) and TASK3 channels to the control of activity modes in thalamocortical neurons. J Neurosci. 23 (16), 6460-6469 (2003).
  21. Misgeld, U., Frotscher, M. Dependence of the viability of neurons in hippocampal slices on oxygen supply. Brain Res Bull. 8 (1), 95-100 (1982).
  22. Ling, C., Verbny, Y. I., Banks, M. I., Sandor, M., Fabry, Z. In situ activation of antigen-specific CD8+ T cells in the presence of antigen in organotypic brain slices. J Immunol. 180, 8393-8399 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

CD8
Экс естественных Модель олигодендроцит-направленного Т-клеток Атака в острых мозга Ломтики
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.