Выявление и анализ повреждений ДНК в клетках мышиной скелетных мышц На месте Использование Тюнеля метод

Краткое содержание

В этом видео описывается диссекция, обработка тканей, секционирование и флуоресцентное мечение TUNEL скелетных мышц мыши. Также описан метод полуавтоматического анализа маркировки TUNEL.

Аннотация

Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза (TdT) дезоксиуридинтрифосфат (dUTP) ник-концевая маркировка (TUNEL) — это метод использования фермента TdT для ковалентного присоединения меченой формы dUTP к 3'-концам двух- и одноцепочечных разрывов ДНК в клетках. Это надежный и полезный метод обнаружения повреждений ДНК и гибели клеток in situ. В этом видео описывается диссекция, обработка тканей, срезы и флуоресцентное мечение скелетных мышц мышей методом TUNEL. В ней также описан метод полуавтоматического количественного определения сигнала TUNEL. Присущие нормальным тканям особенности и условия обработки тканей влияют на способность фермента TdT эффективно мечать ДНК. Обработка тканей также может привести к нежелательной автофлуоресценции, которая будет мешать обнаружению сигнала TUNEL. Поэтому важно опытным путем определить методы тканевой обработки и мечения TUNEL, которые позволят получить оптимальное соотношение сигнал/шум для последующего количественного определения. Описанный здесь анализ на основе флуоресценции позволяет исключить автофлуоресцентный сигнал путем вычитания цифрового канала. Анализ TUNEL, используемый с соответствующими методами обработки тканей и контролем, является относительно быстрым, воспроизводимым, количественным методом обнаружения апоптоза в тканях. Он может быть использован для подтверждения повреждения ДНК и апоптоза в качестве патологических механизмов, для идентификации пораженных типов клеток и для оценки эффективности терапевтического лечения in vivo.

Введение

Терминал дезоксинуклеотидтрансферазу (TdT) дУТФ ник конец маркировка (TUNEL) является процесс с использованием фермента TdT приложить дУТФ к 3 'концах дважды и одноцепочечной ДНК разрушает ^12,23. Метод TUNEL для обнаружения апоптоза и повреждения ДНК впервые было сообщено в течение 20 лет назад Gavrieli и др. ^1,12,24. С тех пор были оценены и оптимизированы в различных тканевых препаратов ^7,23,27,40. TUNEL был использован для изучения ишемии-индуцированной гибели клеток нейронов ^6,14,29 и кардиомиоциты ^43,44, эксайтотоксический нейронов гибель клеток ^30,31, и в качестве биомаркера в лечении артрита ^39. Он также используется в качестве прогностического фактора и опухолевых клеток маркера в различных человеческих раковых ^{2,3,15,32,37,38,42.}

Существуют альтернативные методы для повреждения ДНК и обнаружения гибели клеток, но они имеют технические проблемы и подводные камни. Саузерн-блоттинг может использоваться для quantifу повреждение ДНК в целом лизатов ткани ^7,9-11, но этот метод не дает разрешение сотовой уровня и трудно поддаются количественной оценке. Кометы анализ является альтернативным способом на основе клеток, что требуется извлечение сохранившиеся ядра из клеток ^4,20,28,36. Хотя комет хорошо работает на культивируемых изолированных клеток, это гораздо сложнее подготовить нетронутыми ядра от скелетной мышечной ткани ^8,21. Как Саузерну, комет не дает типов клеток конкретную информацию от целого мышечной ткани гомогенате. Другой альтернативой способу TUNEL является иммуногистохимии с использованием антител против одноцепочечной ДНК ^25,33,41 или против белков, участвующих в ответ повреждение ДНК и гибели клеток путей (например, р53, H2AX и каспазы) ^13,17,22,40. Такие методы на основе антител требует тщательного характеристику антител и отличную специфичность антител с получением высокого отношения сигнал-фон. Даже тогда, когда спецификациисуществуют БР антитела, они могут потребовать денатурации белка-мишени в соответствии с процедурами поисковых антиген ^34,35. Когда мы будем обсуждать здесь, антиген поиска в результатах мышечной ткани неприемлемо высокой флуоресценции. В отличие от альтернативных методов, TUNEL достигает обнаружение повреждений ДНК с высоким отношением сигнал и низким уровнем фона, отличную специфичность, которые могут быть проверены с помощью простых положительных и отрицательных контролей, хорошее проникновения в ткани, которые не требуют извлечения антигена, а разрешение сотовой уровня. Кроме того, метод TUNEL занимает около 4 часов, чтобы закончить, в то время как альтернативные методы, как правило, требуют ночные инкубации.

Мы изучаем скелетных смерть мышечных клеток в мышиной модели спинальной мышечной атрофии (SMA) ^10, которая была сгенерирована Се-Li и его коллеги ^16. Для количественной оценки апоптоза клетки в мышцы, мы разработали способ получения тканей, окрашивания и количественного который работает энергично через другой ШкелеTal группы мышц в различных развития временных точках мышей. Мы используем имеющийся в продаже TUNEL-маркировки комплект и коммерчески доступного программного обеспечения для анализа изображений. Мы также успешно использовали анализ TUNEL в комбинации с иммунофлуоресцентного окрашивания в спинном мозге ^10.

Методы, описанные здесь, являются полезными для исследователей, которые хотят, чтобы оценить тканей патологии, механизмы заболевания, механизмы старения и развития (пре- и послеродовой) гибель клеток в скелетных мышцах. Методика TUNEL особенно полезно для исследований повреждений ДНК и ремонт и клеточной смерти в модельных системах, где только часть клеток зависит и клеточная разрешения уровня необходимо.

Это видео описывает вскрытие, обработки тканей, секционирование и флуоресценции основе TUNEL маркировки мыши скелетных мышц. Он также описывает способ полуавтоматического TUNEL сигнала количественного определения.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры на животных, описанные в этом протоколе были проведены в соответствии с рекомендациями, приведенными в руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения ^26. Протокол (MO13M391) был одобрен Комитетом Университета Джонса Хопкинса уходу и использованию животных мимо.

1. новорожденных мыши Жертва, рассечение, и фиксация

1. Пожертвуйте новорожденных мыши, CO ₂ ингаляции.
2. Сразу отрезать выше колена задней конечности. Примерно до послеродового день 7, кости ног не достаточно мягким, чтобы прорваться через большие лабораторных ножницами или острым лезвием и впоследствии раздел на криостата.
3. Поместите задних конечностей в 10 мл ледяной 4% параформальдегидом в фосфатном буферном солевом растворе (PBS) в 15 мл пробирку.
4. Погружение зафиксировать задних конечностей в параформальдегида течение 4-24 ч при 4 ° С. Эмбриональной ткани требуется только несколько часовс фиксации.
   1. Во избежание фиксации больше, чем 24 ч, так как это может снизить эффективность анализа TUNEL.
5. Cryoprotect задних конечностей, погружая его в растворе сахарозы.
   1. Изменение параформальдегида до 10% сахарозы в PBS в той же трубе 15 мл, инкубируют в течение ночи при 4 ° С.
   2. Изменение до 30% сахарозы в PBS, инкубируют в течение ночи при 4 ° С или до задней конечности опускается на дно пробирки. Ткань может быть оставлен в 30% сахарозы в течение более длительного периода, при условии, что сахароза была стерильно фильтруют.

2. Ткань вложения

1. Заполните меченого вложения плесени на полпути с вложение среды.
2. Поместите задних конечностей в верхней части вложения среды, с вырезом части как можно ближе к одной из стенок формы. Отметить ориентацию задней конечности на наружной стороне формы.
   1. Вставить несколько задних конечностей и сократить в том же блоке. Тем не менее, важно, чтобы убедиться, что все хинdlimbs в блоке ориентированы параллельно друг другу, чтобы получить секции в соответствие уровни вдоль оси конечности.
3. Обложка задних конечностей с вложение среды. Если задние конечности перейти при заливке среду, переориентировать их с тупыми наконечниками пинцета или зубочисткой.
4. Разрешить вложение среды, чтобы проникнуть в ткань при комнатной температуре в течение не менее 15 мин.
5. Место формы непосредственно на сухом льду или в изопентан на сухом льду, чтобы заморозить вложение среды. Удостоверьтесь, чтобы держать уровень прессформ во все времена и во избежание смещение встроенного ткани.
6. Держите замороженные формы при температуре -80 ° С до готовности, чтобы вырезать, в течение нескольких месяцев.

3. Cryosectioning Embedded Конечности

1. Установка криостата температуры в камере до -20 ° С, температура объекта до -18 ° С; регулировать температуру объекта вниз по мере необходимости.
2. Уравновешивают тканей блок внутри криостата камеры, по крайней мере, 30 мин. Правильный блок температуратературы имеет решающее значение для качества разделе.
3. Сокращение поперечные срезы с толщиной 10 мкм или менее. Более толстые участки не будут полностью проникает TUNEL реагентов. Используйте стабилизатор пластины, ножи и угол лезвия (как правило, 5 °) рекомендуется для криостата.
4. Соберите разделы на gelatin- или vectabond покрытием стеклах при комнатной температуре. Поместите сразу в слайд-поле на сухом льду. Сохраните упаковку слайд в отдельном контейнере с сухим льдом расположенной вблизи криостата на расстоянии вытянутой руки.
   1. Сокращение поперечной серийных срезов через длинной оси конечности, пропуская 100-200 мкм. Соберите по крайней мере 3 соседних участков на каждого последовательного уровне.

4. TUNEL пробы на задних конечностях частей с помощью коммерчески доступного набора (все шаги при комнатной температуре, если не указано иное)

1. Оттепель слайды с разделами до комнатной температуры и сухой на ночь или на выходные.
2. Увлажняет разделы от immersinг слайды в PBS в течение 2 × 10 мин в банке Коплин. Высушите лаборатории протрите, удаляя как можно больше жидкости вокруг секции, как это возможно.
3. Проницаемыми разделы
   1. Используйте или не-протеолитическую, сапонин основе коммерческого реагента или 0,5% Tween20 и 0,05% Triton X100 в PBS.
   2. Поместите слайд в камере влажности. Простой камера влажности является пустой пипетки коробка с плотной крышкой, с достаточным количеством воды, добавляют, чтобы покрыть дно коробки.
   3. Внесите достаточно реагент на слайд, чтобы покрыть часть (50 мкл достаточно для новорожденных конечностей мыши). Не пипетки непосредственно на участке, а повторное возбуждение может вызвать раздел для того чтобы поднять слайд.
   4. Использование тупыми наконечниками пинцета, поместите небольшой прямоугольник парафильмом на верхней части раздела разложить падение реагента и полностью покрывают раздел. Если пузырьки образуются под парафином, осторожно поднимите его, сухой, и повторно.
   5. Выдержите слайды с permeabiliзации реагента в течение 1 ч в закрытой камере влажности. Если части начинают отрываться от ползуна, время пермеабилизации может быть уменьшено до 30 мин.
   6. Вымойте слайды в PBS в Коплин банку 2 х 5 мин. Парафильмом прямоугольники должны плавать на поверхности и может снять и выбросить.
   7. Использование лаборатории салфеткой, сушить как можно больше жидкости вокруг участков, как это возможно.
4. ТДТ-опосредованной ДНК-брейк маркировка
   1. Следуйте инструкциям по установке, чтобы 1x TdT маркировки буфер, пипетки достаточно буфер маркировки на слайд, чтобы покрыть срезы ткани (50 мкл достаточно для новорожденных конечностей мыши). Инкубируют в камере влажности в течение 5 мин. Кроме того, погрузите слайд в TdT маркировки буфера в Коплин банку.
   2. Следуйте инструкциям по установке, чтобы TdT маркировки смеси. Комплект включает в себя кобальт, магний и катионов марганца; катионом марганца хорошо работает на разнообразных тканей, в том числе скелетных мышц, нервных TISS системыЕЭС, печени, кожи и костного.
   3. Для положительного контроля, добавить ДНКазы (обозначенный "нуклеазы" в наборе) в смеси маркировки TdT. Альтернативно, предварительно обработать положительный секцию управления с ДНКазы в нуклеазы буфера в течение 1 ч при 37 ° С, в соответствии с инструкциями набора. Держите решение ДНКазы и ДНКазы лечение разделы вдали от других опытных участков, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение.
   4. Для отрицательного контроля, опустить TdT фермент от маркировки смеси.
   5. Используйте лаборатории салфеткой, чтобы удалить как можно больше TdT маркировки буфер из слайда, как это возможно. Пипетка TdT маркировки смесь на слайде (50 мкл) в разделе, крышка с новой прямоугольника парафином и инкубируют в камере влажности при 37 ° С в течение 1 часа.
   6. Следуйте инструкциям по установке, чтобы 1x буфер остановки. Использование лаборатории протереть, чтобы удалить TdT маркировки смесь из ползуна, и добавить 200-300 мкл буфера остановки, чтобы покрыть срезы ткани, и инкубируют в камере влажности в течение 5 мин. Аль ternatively, погрузите слайд в стоп-буфера в банке Коплин.
   7. Вымойте слайд 2 х 2 мин в PBS. Используйте лаборатории салфеткой, чтобы удалить как можно больше PBS с горкой, как это возможно.
5. Флуоресцентных меток
   1. Следуйте инструкциям по установке, чтобы подготовить флуоресцеина решение маркировки на этикетке дНТФ в разрывов ДНК. Внесите раствора на слайде (50 мкл в разделе), накрыть новый прямоугольник парафильма, и инкубировать в камере влажности в течение 20 мин.
   2. Вымойте слайд в течение 2 мин в PBS в банке Коплин. Используйте лаборатории салфеткой, чтобы удалить как можно больше PBS как можно дальше от слайда.
   3. Развести Hoechst 33258 ядерных пятно на 1 мкг / мл в PBS и пипеткой на предметное стекло (100-200 мкл достаточно, чтобы покрыть раздел). Инкубируют в камере влажности в течение 5 мин.
   4. Промыть 3 раза в течение 5 мин в PBS.
   5. Покровное с antifade флуоресценции монтажных СМИ и печать края с лаком для ногтей.

jove_title "Приобретение Digital Image> 5.

1. Получение изображений с помощью обычного флуоресцентного микроскопа с DAPI, FITC и Техас Red фильтров (или эквивалент). Используйте большее увеличение цели (20x или 40X), чтобы убедиться, что маркировка была успешной, и ядра (нетронутых или фрагментированные) были помечены. 10X Цель является достаточным для количественного определения TUNEL-положительных Puncta.
2. Собирают изображения окрашивания Hoechst, окрашивание TUNEL и autofluorescent сигнала в виде трех отдельных искусственных цветовых каналов, объединенных в одно изображение. Если флуорофор этикетки TUNEL зеленый, изображение autofluorescent сигнала в красный фильтр, и наоборот.
   1. Держите все настройки визуализации эквивалентны между слайдами для последующего порога и количественного определения. Для каждого фильтра, заданных и записи времени воздействия, усиления и биннинга (без отбора по не лучше); не использовать автоматические настройки экспозиции или усиления.
   2. Используйте проб и ошибок, чтобы найти настройки экспозиции и усиления, которые лучше всего учесть весь спектр Intenстей во всех окрашенных слайдов. Убедитесь, что нет насыщенные пиксели в получаемых изображений, как это количественного воля смещения.
3. Выполняйте съемку всей группы мышц интересов. Это может потребоваться несколько образов, которые будут "сшитые" вместе.

Анализ 6. Изображение

1. Используйте имеющиеся в продаже программы анализа изображений для анализа цифровых изображений окрашивания TUNEL. Анализ с использованием коммерческого программного обеспечения показано здесь. Кроме того, бесплатное программное обеспечение ImageJ от НИЗ может быть использована для анализа окрашивание TUNEL.
2. Пятно раздел прилегающей к секции TUNEL-окрашенных гематоксилином и эозином (H & E) и взять полный раздел цифровое изображение с помощью обычного светлого микроскопа. Используйте этот H & E изображение в сочетании с анатомии атлас ^5,18,19 проследить анатомические структуры должны быть определены количественно.
3. С канала TUNEL выключен вручную отслеживать контур области, чтобы быть количественно, используяHoechst и автофлуоресцентной каналы для руководства. Преобразование прослеживается область в маске (множество выбранных координатах пикселей, которые будут проанализированы).
4. Включите канал TUNEL. Использование интенсивности пороговых значений функции в программе анализа изображения, установите нижний порог, чтобы исключить все автофлуоресцентной сигнал.
5. Примените те же настройки пороговых ко всем изображениям в наборе исследования. Преобразование порогами выбор в масках.
6. Для каждого изображения, объедините маску мышцы области и маску TUNEL. Новая комбинация маска будет представлять сигнал TUNEL в рамках прослеживается области мышц всего.
7. Выполните маски количественное от комбинации маску, чтобы определить количество объектов и объектов площадью сигнала TUNEL в рамках прослеживается области мышц. Выполните это, используя функцию анализатора частиц в ImageJ.

Результаты

С успешной окрашивания TUNEL-позитивный сигнал должен быть достаточно ярким, чтобы изолировать автофлюоресценции, установив пороги интенсивности. TUNEL-позитивные объекты на малом увеличении может отображаться в виде ярких нерегулярные фрагменты в скелетных мышцах (рис 1А). Тем не менее, при более высоком увеличении, некоторые TUNEL-положительных объекты с классической апоптоза морфологии следует соблюдать, если тип гибели клеток участвует в апоптоз (фиг.1В). Положительный контроль (ДНК...

Обсуждение

Метод обнаружения и количественного анализа повреждений ДНК, ассоциированных с апоптоз в клетках мышиной скелетных мышцах описано. Процедура включает в себя сбор тканей, окрашивание TUNEL, цифровой захвата изображений и анализа изображений. Общие гистологические материалы и инструменты необходимы, и специальный коммерческий набор TUNEL необходимо. Основные крупные единицы оборудования, необходимые являются криостат, эпифлуоресцентной микроскоп с возможностью цифрового изображения, и компьютерная система для анализа изоб...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
4% параформальдегид в фосфатно-солевом буфере	Электронная микроскопия Sciences	19202	Для описанных здесь процедур 4% раствор готовили свежий из порошка. Можно использовать параформальдегид от любого поставщика. Приготовленный раствор формальдегида следует хранить при 4°С; C и не следует использовать по истечении срока его годности (до нескольких месяцев). Параформальдегид является канцерогеном и токсином при вдыхании и контакте с кожей. Пожалуйста, соблюдайте меры предосторожности, указанные в паспорте безопасности, при работе с параформальдегидом.
Сахароза	Sigma	S0389	Используется для криозащиты тканей перед замораживанием. Можно использовать сахарозу от любого поставщика.
O.C.T. compound	Tissue-Tek	4583	Закладная среда для криосекции.
Криостат	Leica	CM 3050S	Для описанных здесь препаратов использовался криостат Leica CM3050S. Любой криостат, способный разрезать 10 мкм; Можно использовать сечения m.
Стеклянные слайды, 25 x 75 x 1 мм	Fisher	12-552-3	от любого поставщика.
Желатин	Sigma	G-9391	Желатин используется для улучшения адгезии срезов тканей к предметным стеклам. Для покрытия стекол желатином растворить 2,75 г желатина и 0,275 г хромовых квасцов в 500 мл дистиллированной воды, подогреть до 60° градусов; C, опустите на горки на несколько секунд и дайте высохнуть. Можно использовать желатин любого поставщика. В качестве альтернативы можно приобрести предметные стекла с желатиновым покрытием.
Додекагидрат сульфата калия хрома (квасцы хрома)	Сигма	243361	квасцы хрома добавляются в раствор желатина для улучшения адгезии тканей на предметных стеклах. Это возможный канцероген и токсин при вдыхании и контакте с кожей. Соблюдайте меры предосторожности, указанные в паспорте безопасности при работе с хромированными квасцами.
Реагент для адгезии тканей Vectabond	Vector Labs	SP-1800	Дополнительная подложка для лучшей адгезии тканей к стеклянным предметным стеклам; вместо этого можно использовать предметные стекла с желатиновым покрытием.
Tween20	Sigma	P9416	Моющее средство, используемое для проникновения в ткани. Можно использовать Tween20 от любого поставщика.
Triton X100	Sigma	T8787	Моющее средство, используемое для проникновения в ткани. Можно использовать Triton X100 от любого поставщика.
TACS 2 TdT набор для обнаружения апоптоза in situ	Trevigen	4812-30-K	Коммерческий набор для флуоресцентного мечения TUNEL.
ДНКаза/нуклеаза	Trevigen	4812-30-K	(входит в комплект)
ДНКаза/нуклеаза буфер	Trevigen	4812-30-K	(входит в комплект)
10x фосфатный солевой буфер (PBS), pH 7,4	Amresco	780	Make 1x PBS для смывов и разбавлений. Можно использовать PBS от любого поставщика.
Вода без ДНКазы	Качество Биологические препараты	351-029-131	Можно использовать воду от любого поставщика.
Hoechst 33258	Sigma	94403	Ядерный краситель. Можно использовать любой синий флуоресцентный ядерный краситель. Как ДНК-связывающий краситель, Hoechst является подозреваемым канцерогеном, и с ним следует обращаться с защитными средствами, чтобы свести к минимуму контакт с кожей.
Парапленка M	multiple	807	Можно использовать любую другую гидрофобную пленку или защитное покрытие. Доступно у нескольких поставщиков.
Флуоресцентный микроскоп с цифровой камерой	--	--Можно	использовать любой флуоресцентный микроскоп, способный цифровым образом захватывать красную, зеленую и синюю флуоресценцию в отдельных каналах.
Можно использовать фильтрующий материал Vectashield	Vector Labs	H-1000	Antifade от любого поставщика.
стеклянные покровные стекла, толщина No 1	Brain Research Labs	2222-1	Можно использовать защитные накладки от любого поставщика. Наименьший размер 22 х 22 мм достаточен для секций ножки неонатальной мыши.
Лак для ногтей	Ted Pella	114-8	Используется для запечатывания покровных стекол. Можно использовать лак для ногтей от любого поставщика (включая обычных розничных продавцов). Избегайте использования лака для ногтей с цветом или добавками, которые могут отражать свет во время флуоресцентной визуализации.