Оценка жизнеспособности человеческого жира инъекции голым мышам с Micro-компьютерной томографии

Краткое содержание

Пересадка жира является важным методом для реконструкции дефицита мягких тканей. Тем не менее, это остается непредсказуемой процедурой, характеризующейся переменной приживаемостью трансплантата. Наша цель состояла в том, чтобы разработать мышиную модель, которая использует новый метод визуализации для сравнения удержания объема между различными методами подготовки и доставки жирового трансплантата.

Аннотация

Lipotransfer является жизненно важным инструментом в арсенале хирурга для лечения дефицита мягких тканей по всему телу. Жир является идеальным ткани наполнитель мягкой, как он легко доступен, легко получить, недорогой, и, по существу биологически совместимым. ¹ Однако, несмотря на растущий популярности, жир прививки препятствует непредсказуемых результатов и переменной выживаемость трансплантата, опубликованным отсева, начиная где-то от 10 -80%. ^1-3

Для облегчения исследования по жира прививки, поэтому здесь мы разработали животную модель, которая позволяет в режиме реального времени анализа введенного жира задержка жидкости. Вкратце, небольшой надрез в коже головы компакт-1 голой мыши, и 200-400 мкл обработанной липоаспирата находится над черепа. Головы будет выбран в качестве места получателя из-за его отсутствия родной подкожного жира, и из-за превосходного фонового отличие представленной свода черепа, что способствуетПроцесс анализа. Micro-компьютерная томография (микро-КТ) используется для сканирования трансплантата в начале исследования и через каждые две недели. Изображения КТ реконструированы и ПО для обработки изображений используется для количественной оценки объемов трансплантата.

Традиционно, методики оценки жира объем трансплантата потребовало эвтаназии животных исследования, чтобы обеспечить только одну оценку массы трансплантата и объема на физическом измерении экс естественных условиях. Биохимические и гистологические сравнения были также потребовало изучения животное усыпить. Это описано метод визуализации имеет то преимущество, визуализации и количественного объективно объем в нескольких точках времени после первоначального прививки без того, чтобы жертвовать исследовании на животных. Методика ограничен размером трансплантата способный вводить в кожу большие трансплантаты риска и жира некроза. Этот метод находит применение для всех исследований, оценивающих жира жизнеспособности трансплантата и задержка жидкости. Он особенно хорошо подходит для providiнг визуальное представление жировых трансплантатов и после изменения объема с течением времени.

Введение

Дефекты мягких тканей возникают по разным причинам, включая травмы, резекцию опухоли, старение и врожденные аномалии. Они могут быть изнурительными для пациентов и представляют собой одну из самых распространенных, но сложных проблем для реконструктивных хирургов. Существует множество методов устранения дефицита мягких тканей, таких как локальные и свободные лоскуты, инъекции коллагена и синтетические филлеры. ^4-8 Тем не менее, с момента его первого документально подтвержденного использования Нойбером в 1893^году1, аутологичный перенос жира остается золотым стандартом для восстановления дефицита мягких тканей, поскольку он легко доступен, его легко и безопасно собрать, а также он естественно совместим. ^1,2

Несмотря на эти преимущества, аутологичные жировые трансплантаты страдают от непредсказуемой и изменчивой выживаемости, при этом коэффициент удержания колеблется от 10 до 80% с течением времени. ^1-3,9 Чтобы объяснить эту ожидаемую потерю объема и симметрии, хирургам часто приходится проводить чрезмерную коррекцию при заполнении дефектов мягких тканей или выполнять несколько последующих процедур.

Плохо васкуляризированные кровати трансплантата частично виноваты в этой резорбции тканей. Кроме того, отсутствие метода сравнительного анализа для сравнения выживаемости трансплантатов также может способствовать несогласованности в представленных результатах. Точный метод измерения объема трансплантата снизит погрешность измерения при оценке коэффициента ретенции. Это, в свою очередь, поможет исследователям более точно определить причинные факторы, влияющие на выживаемость трансплантата. Несмотря на то, что многие модели на лабораторных животных облегчают как количественную, так и качественную оценку выживаемости жирового трансплантата человека, большинство из них основаны на гистологическом и биохимическом анализе и требуют жертвования исследуемым животным для получения одного измерения. ^3,10-12 Мало что известно об использовании методов визуализации для подсчета удержания объема жирового трансплантата in vivo.

Несколько клинических исследований показали более эффективные методы измерения с использованием визуализации. Магнитно-резонансная томография (МРТ) была использована Hörl et al. для измерения выживаемости жировых трансплантатов¹³, а КТ была использована Har-Shai et al. и Fontdevila et al. в своих анализах удержания объема после трансплантации у пациентов, страдающих от ВИЧ. ^14,15 Используя программное обеспечение для трехмерной (3D) визуализации, Meier et al. Измеряли удержание объема у людей после аутологичной жировой пластики путем сравнения изображений дооперационного и послеоперационного периода. ¹⁶

Тем не менее, стандартизированный метод, использующий визуализацию для измерения выживаемости жирового трансплантата, отсутствует в фундаментальных научных исследованиях. Подход к визуализации с высоким разрешением для оценки объемов жировых трансплантатов позволит не только проводить точные и воспроизводимые измерения объемов, но и проводить повторные измерения, позволяющие визуализировать эволюцию выживаемости жировых трансплантатов в режиме реального времени.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментальные протоколы и пациентов формы согласия для получения жира были рассмотрены и утверждены Стэнфордского университета ведомственного комитета (Протокол № 2188). Все процедуры на животных были одобрены административной комиссии Стэнфорда, на лабораторных животных (APLAC) в соответствии с Протоколом # 9999. Все эксперименты проводились при строгом соблюдении безопасности животных и руководящих принципов гуманного обращения с.

1. Жир Сбор

1. Используя процедуру Coleman ^17-19, получить жировой ткани человека от живота, боковой и / или бедра регионах здоровых пациенток, проходящих выборные липосакции.
2. Для обработки липоаспирата для прививки, начинают, позволяя жиру отстояться в течение 30 мин.
3. Липоаспирата, как правило, оседает в три слоя, с маслом на вершине, жира в середине, и крови в нижней части. Аспирируйте и выбросить верхний слой масла и нижний слой крови.
4. Для дальнейшего удаления остатков tumescENT жидкости или клеточный дебрис, центрифугировать жир в течение 5 мин при 350 х г и 4 ° С и аспирации нижнюю водную фазу.
5. Рассчитать количество жира, необходимого для прививки, что позволяет 20% ошибки доставки и передачи нужного объема жира до 50 мл коническую (ов). Умножить 400 на число мышей в исследовании, чтобы получить мкл жира, необходимого для трансплантации.
6. В этот момент, если выполнение сотовый Assisted Lipotransfer ^20,21, место объем жира для прививки на льду. Затем собирают из жировой ткани стромальные клетки (ИСС) от остальной жир, используя стандартную технику, описанную Zuk и др ^22.

2. Жир Прививка

1. Получить женщина, гомозиготный CD-1 голых мышей для экспериментального исследования. Выберите мышей между 8 - 12 недель от роду.
2. Для анестезии, переместить мышь в нокдаун коробке с 2,5% -ным раствором ИФ / кислорода в 2 л / мин в течение 10 мин. Пожалуйста, обратите внимание, что рекомендуемый ISOFlurane доза варьируется в зависимости от штамма мыши.
3. Когда частота дыхания мыши замедлился, подтверждают достаточную седации с ног крайнем случае. Применить ветеринарной смазочного глазной мази в оба глаза мыши.
4. Если мышь не дрогнул в ответ на носка крайнем случае, это подтверждает достаточную плоскость анестезии. Поместите нос мыши в головная доставки 2,5% смеси ИФ / кислорода на 1-2 л / мин. Если мышь убирается с головы крайнем случае, вернуться к бросовой поле и перепроверять после 5 мин.
5. Настройка стерильное поле под мышкой, а затем стерилизовать кожу головы 2,5% повидон-йода с последующим 70% раствора этанола. Повторите еще два раза.
6. Поместите хирургические простыни вместо мыши и быть осторожными, чтобы поддерживать стерильную поле. Стерильные инструменты, перчатки и СИЗ должны использоваться в любое время.
7. Если жир громкости быть привиты ранее было помещено на льду, позволяют жир сначала настроить до комнатной температуры перед поставкой.
8. Backload в Луера шприц 1 мл с 1 млжира.
9. Подключение 14 г, 8 см в длину жира прививки канюлю к концу шприца.
10. Председатель Система по не нажимая на поршень шприца до тех пор, между 200 и 400 мкл жира остается в шприце. В то время как нажатием на поршень шприца подтвердить, что канюля полностью заполнены жиром, наблюдая жир, выходящий из дистального канюли отверстие.
11. Использование тонких щипцов, поднимите кожу спины в средней линии, покрывающий хвостовой-Мост аспект черепа. Сделать 1,5 мм, вырезанные в кожу с помощью тонких ножниц.
12. Поместите одну 6-0 нейлона шов через середину разреза, что в дальнейшем будет использоваться, чтобы принести края раны вместе после прививки выполняется. Не привязывайте шва.
13. Создать подкожный карман по черепу, вставив канюли через разрез кожи и попутные канюли взад и вперед в форме веера шаблона по черепу, чтобы освободить любые соединительные вложения ткани к коже вышележащих.
14. После того, как карман был создан, поместите Cannula в средней линии мыши непосредственно над черепа до кончика лежит в ростральной-наиболее аспекту карман, который должен быть как раз за линией, проведенной между глазами. (1А)
15. Медленно введите жир ретроградным способом, продвигая поршень, потянув канюли назад. Использование щипцов, привести края раны вместе и поднимите их вверх, чтобы любой жир от утечки из кармана.
16. Свяжите шва, который ранее был помещен, убедившись, что первый узел лежит слегка на коже. Свяжите еще три квадратных узлов и сократить шов с 3 мм хвоста. (Фигура 1В)
17. Подтвердите с визуализацией и ручной пальпации, что карман не переполнен и Кожа, закрывающая карман не напряжен. Если карман был переполнен, вырезать шва и удалите все отложения внутри кармана. Промыть карман с фосфатным буферным солевым раствором (PBS), рН 7,4 и повторно ввести меньший объем жира.
18. Удалить мыши изnesthesia и место на спине или на боку в чистом клетке само по себе. Монитор животное для регулярного дыхания, нормальной движений, отсутствие кровотечения и признаков боли или страданий. Администрирование бупренорфин 0,1 мг / кг подкожно каждые 6 ч до 48 ч, если животное находится в боли.
19. Убедитесь, что животное проснулось достаточно, чтобы поддерживать грудины лежачее положение, прежде чем покинуть его без присмотра. Не ставьте животное в клетке с другими животными, пока он полностью не восстановился.
20. Через 4 часа, убедитесь, что животное способно, чтобы поесть и пить, двигаться, и дышать нормально и что нет кровотечения из места операции. Верните его в питомник.

3. Micro-CT

1. Сканирование мыши для объема базовой линии послеоперационного дня 3, а затем повторите сканирование в послеоперационных недель 2, 4, 6 и 8.
2. При визуализации мышей в каждой временной точке, следуйте до и после процедурных седации и уход за животными руководящие принципы, изложенные ранее в SТЭЦ 2.2-2.4 и 2.17-2.19.
3. Выполните сканирование на микро-КТ сканера с размером реконструкция воксельном 100 мкм или лучше.
4. С пиковой рентгеновского kilovoltage 80 кВп и анодного тока 450 мкА, управлять рационе дозу примерно 5 centiGy во время 9 мин Сканирование в каждой мыши. Пожалуйста, обратите внимание, эти показатели меняются в зависимости от протокола сканирования.
5. До выполнения первого сканирования, калибровки микро-КТ с изображения фантома, который отличает между воздухом, водой и интенсивности кости.
6. Поместите четыре мышей в сканер в вентральной позиции с двумя мышами на верхней части и два снизу. Сканирование кровать может быть легко построены с использованием 60 мл шприцы провести тело мыши и 10 мл шприцев в качестве головных частей. ²³
7. Поддерживать мышей под наркозом с 2,5% -ным раствором ИФ / кислорода на 1-2 л в минуту.
8. Подтвердите разведчик изображения, весь череп мыши, от носа до первого шейного позвонка, и сверху черепа до основания SKULL, будет образ.

Анализ 4. Micro-CT

1. Откройте реконструированные изображения с микро-КТ обработки изображений анализа, который позволяет создавать регионов интереса (ROI-х), выбрав вокселей с помощью пороговых значений для интенсивности пикселей. Программное обеспечение также позволяет создавать поверхности 3D через интерполяции выбранных вокселей, и для анализа объема.
2. Для начала загрузки реконструированные КТ-изображений в двумерной (2D) корональной, осевые и сагиттальной видом. (2А)
3. Использование аксиальный срез в качестве руководства, перейти к сагиттальной среза, который соответствует самой левой аспектом жира трансплантата. Выбор верхнего и нижнего порога интенсивности пикселей, который захватывает все вокселей, соответствующих жира трансплантата, но исключает окружающие ткани и кости. (Фиг.2В)
4. Определить ROI в сагиттальной зрения, которая соответствует жировой трансплантата с использованием ранее определенных пороговых значений интенсивности пикселей. REPEAT эту процедуру каждый пятый сагиттальной кусочек, навигации, пока самая правая сторона трансплантата не будет достигнута. (Фиг.2С)
5. Интерполировать выбранных вокселей из всех 2D ROI в единую, в сочетании 3D ROI. (Рис 2D)
6. Рекордный объем ROI рассчитывается с помощью программного обеспечения.
7. Рендер 3D изоповерхность визуализировать конечный объем жира трансплантата. (Рис 2E)
8. В последующих анализах, не забудьте сохранить максимум интенсивности пикселей и минимальные пороговые значения так же, как те, которые используются для анализа исходной ситуации.

5. Жир урожая

1. После мышей были отсканированы на неделю 8 ^24,25 момент времени, обезболить мышей, как описано ранее выше на этапах 2.2-2.4 и 2.17-2.19.
2. Согласно основным принципам APLAC, усыпить мышей, отделяя их позвоночника столбцов.
3. Поместите курсор в операционном поле. Использование Тенотомии ножницы, аккуратно откройте карман и анализировать тон вышележащих кожу и вложения соединительной ткани с содержанием жира трансплантата.
4. В этот момент, это может помочь, чтобы вырезать патч кожи покрывающей спинной, чтобы помочь в извлечении трансплантата. (3А)
5. Слегка поддержания тяги на трансплантата щипцами и поверните трансплантат из стороны в сторону, чтобы визуализировать последовательные точки напряженности, которые должны быть освобождены с ножницами.
6. Пребывание как можно ближе к трансплантата, насколько это возможно, когда иссечения, чтобы свести к минимуму соединительной ткани, принятое с трансплантатом. (3В)
7. После иссечения лоскута, измерить массу на тарированный масштабах, которые с точностью не менее 0,01 грамма.
8. Рассчитать объем жировой трансплантат, используя измеренное значение массы и среднюю плотность человеческого жира (0,9 г / мл) в качестве коэффициента пересчета.
9. Сравните расчетный объем жира трансплантата, полученному с помощью микро-КТ.
10. Жировые трансплантаты могут быть обработаны для гистологического или дальнейшего анализа, если это необходимо.

Результаты

Жировые трансплантаты постепенно уменьшается в объеме в течение исследования, в результате чего 62,2% средней выживаемости по неделям 8. (фиг.4А) ²⁴ По завершении недели 8 сканирования, каждая жира трансплантата экстрагировали в виде единой детали. Wilcoxan тест суммы рангов был использован для сравнения разницу между измерениями объема жировых трансплантатов, полученных либо микро-КТ или рассчитанных физической массы. Никаких существенных различий не было найдено между этими двумя методами (...

Обсуждение

До этого момента большинство исследователей опирались на условиях без визуализации для количественной оценки долгосрочного выживания жировых трансплантатов, но эти методы требуют жертву исследования животного и дают только одно измерение. ^3,10-12 Наше исследование представляет Усовершенствованный способ анализа, который позволяет объективно реального времени количественного жира выживаемость трансплантата в модели мыши.

Критические в этом процессе обеспечения того, чтобы в достато...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Центрифуга для липоаспирата
Beckman	Coulter, Inc., Пасадена,
50 мл конические пробирки	BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния
CD-1 обнаженные мыши (Crl:CD1-Foxn1nu)	Charles River Laboratories, Inc., Уилмингтон, Массачусетс
Изофлуран	Генри Шейн, Дублин, Огайо
2,5% Betadine	Purdue Pharma, L.P., Stamford, CT
70% раствор этанола	Gold Shield, Хейворд, Калифорния
1cc шприц с люэровским замком	BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния
канюля 14-го калибра	Shippert Medical, Centennial, CO
Щипцы	Fine Science Tools, Гейдельберг, Германия
Тенотомические ножницы	Fine Science Tools, Гейдельберг, Германия
6-0 нейлоновый шов	Ethicon, Blue Ash, OH
Phosphate Buffered Salt	Gibco, Carlsbad, CA
микро-КТ сканер	Siemens Healthcare, Плезантон, Калифорния
Phantom	TriFoil Imaging, Нортридж, Калифорния
Программное обеспечение для анализа изображений	IRW, Siemens Healthcare, Плезантон, Калифорния
Scale	Mettler-Toledo International, Inc., Колумбус, Огайо

SAL Калифорния