Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Автоматическое измерение эмфиземы легких и малых дыхательных путей Ремоделирование в сигаретном дыме, подвергшихся воздействию мышей

13K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52236

⸱

16 января 2015 г.

 ,  ,  ,  , 
1Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Brigham and Women's Hospital - Harvard Medical School, 2Department of Respiratory Medicine, University of Cambridge - Addenbrooke's Hospital, 3Lung Transplant Program, Brigham and Women's Hospital - Harvard Medical School, 4COPD and IPF Programs, Lovelace Respiratory Research Institute

В этой статье

Краткое содержание

Целью этого протокола является предоставление автоматизированных методов количественной оценки хронических патологий легких в мышиной модели ХОБЛ. Протокол включает в себя воздействие сигаретного дыма (КС) на мышей, измерение функции легких, раздувание легких и использование методов морфометрии для измерения эмфиземы и ремоделирования мелких дыхательных путей у мышей.

Аннотация

ХОБЛ, по прогнозам, станет третьей по распространенности причиной смертности во всем мире к 2020 году(1). Животные модели ХОБЛ используются для идентификации молекул, которые способствуют процессу заболевания, и для проверки эффективности новых методов лечения ХОБЛ. Исследователи используют ряд моделей ХОБЛ с участием различных видов, включая грызунов, морских свинок, кроликов и собак (2). Тем не менее, наиболее широко используемой моделью является модель, в которой мыши подвергаются воздействию сигаретного дыма. Мыши являются особенно полезными видами для моделирования ХОБЛ, потому что их геномом можно легко манипулировать для создания животных, которые либо испытывают дефицит отдельных белков, либо чрезмерно экспрессируют их. Исследования мышей, подвергшихся воздействию сигаретного дыма, предоставили ценную информацию о вкладе отдельных молекул в различные патологии легких при ХОБЛ (3-5). Большинство исследований были сосредоточены на путях, участвующих в развитии эмфиземы, которая способствует обструкции воздушного потока, характерной для ХОБЛ. Тем не менее, небольшой фиброз дыхательных путей также вносит значительный вклад в обструкцию воздушного потока у пациентов с ХОБЛ (6), но гораздо меньше известно о патогенезе этого поражения у животных, подвергающихся воздействию дыма. Чтобы восполнить этот пробел в знаниях, данный протокол количественно оценивает как развитие эмфиземы, так и небольшой фиброз дыхательных путей у мышей, подвергшихся воздействию дыма. Этот протокол подвергает мышей воздействию КС с использованием метода воздействия на все тело, затем измеряет механику дыхания у мышей, надувает легкие мышей до стандартного давления и фиксирует легкие в формалине. Затем исследователь окрашивает участки легких либо красителем Гилла для измерения средней длины альвеолярной хорды (в качестве показателя тяжести эмфиземы), либо трихромным окрашиванием Массона для измерения отложения белков внеклеточного матрикса (ВКМ) вокруг малых дыхательных путей (в качестве считывания небольшого фиброза дыхательных путей). Исследования влияния молекулярных путей на обе эти патологии легких приведут к лучшему пониманию патогенеза ХОБЛ.

Введение

Использование животных моделей для изучения ХОБЛ является сложной задачей, потому что ни одна модель не может идеально повторить все особенности человеческого заболевания (2). Большинство исследователей использовать мышей для моделирования ХОБЛ из-за сходства между мышами и людьми в их легких физиологии, патологии, генетики и метаболитов. Кроме того, мыши являются относительно недорогими, чтобы учиться, и как эмфизема и малых ремоделирования дыхательных путей развиваются в течение 6 месяцев CS экспозиции (5,7-9).

Сигаретный дым, вызванных ХОБЛ: Несколько методов могут вызвать ХОБЛ у мышей. Большинство исследователей подвергайте мышей CS, которая является основным этиологическим фактором для человеческого ХОБЛ. CS экспозиции в течение 6 месяцев вызывает развитие эмфиземы и небольшое ремоделирования дыхательных путей (SAR) у мышей, но тяжесть заболевания, которые индуцируют варьируется в зависимости от мышиного штамма исследуемого. Например, у мышей NZWLacZ устойчивы к развитию CS-индуцированной эмфиземы, тогда как AKR / J мышей extremelу чувствительных (10). Большинство исследователей изучать C57BL / 6 деформации мышей в модели экспозиции CS, как многие ген-направленных мышей доступны в этом штамме. После 6 месяцев CS экспозиции, эмфиземы и небольшой фиброз дыхательных путей развиваться в дикого типа (WT) C57BL / 6 мышей, и оба поражения в относительно легкой степени тяжести (5,10). Исследователи используют два типа CS воздействия: нос только и всего тела экспозиций. Основные недостатки: Только нос техники экспозиции в том, что: 1) это еще один способ трудоемкий; и 2) у мышей должны быть ограничены в небольших камерах, которые могут вызывать реакцию на стресс и гипертермии у животных (11). Основным недостатком экспозиции всего тела (описанного здесь), что животные могут поглощать (а также вдоха) никотина и смолы продуктов, когда они очистить их меха. Мышей, подвергнутых всего тела CS также имеют более низкий уровень карбоксигемоглобина и уменьшить потерю массы тела по сравнению с животными воздействию носа-только CS (12).

тест легочной функции (ПФТС): Меры податливости легких и эластичности, как правило, похожи на C57BL / 6 дикого типа (WT) мышей воздействию воздуха или CS в течение 6 месяцев в связи с относительно мягкой эмфиземы, которая развивается, когда это Штамм подвергается CS (10). Однако, когда эмфизематозный разрушение более серьезными, увеличение эластичности легких и левых сдвигов в давление-объем (PV) текут петли могут быть обнаружены. Последнее можно наблюдать, например, в мышиных штаммов, которые более восприимчивы к воздействию CS (10), в CS-инфицированными / 6 деформации ген-направленных мышей C57BL, которые имеют более тяжелые эмфизема, чем C57BL / 6 дикого мышей (13), или в CS-инфицированными мышей, подвергнутых воздействию экологических изменений, которые делают их более восприимчивыми к воздействию CS (14). Этот протокол использует маленькое животное вентилятор для измерения сокращения в упругой отдачи легких (увеличение квазистатическом податливости легких [сСт] и уменьшение тканиэластичность [H]), контуров движения PV, и изменения в дыхательных путях и тканевой резистентности наркозом мышей (15,16).

Меры эмфиземы легких: Анализ развития эмфиземы в CS-открытой C56BL / 6 деформации мышей является сложной задачей, поскольку его распределение в пространстве неоднородна. Существует несколько методов количественной оценки воздушного пространства расширение у мышей. Первый способ использовали среднее линейное перехвата (L м) (17). Тем не менее, способ Л М представляет собой медленный, ручной процесс, который не может захватить гетерогенность заболевания (если все участки легких не случайным образом отобранных) и, следовательно, его использование может привести к систематической ошибке наблюдателя в анализе. Разрушительное индекс [Д.И., (18)] и количественно воздушного пространства расширение с помощью прозрачного листа с 50 равномерно распределенных точек, расположенных над печатной оцифрованного образа гематоксилином и эозином окрашенных разделе легких. Оценки метод PI районе, прилегающем к каждой точке переменного токаПеретяжка в той мере, которая альвеолярные протоки и альвеолярных стенок внутри этой области уничтожены. Основным недостатком метода DI является то, что отнимает много времени и не более точными, чем другие методы (19,20).

Этот протокол меры означают альвеолярного длину хорды и альвеолярной области на парафиновых срезах легких, окрашенных красителем Гилла. Морфометрия программное обеспечение преобразует изображения срезах легких в бинарных изображений (в которой ткань белого цвета, воздушное пространство черный), а затем накладывает на равномерной сетке горизонтальных и вертикальных линий (аккорды), а затем программное обеспечение количественно длину каждого аккорда в областях, определенных программное обеспечение как в воздушном пространстве. С помощью этого метода, можно измерить размер альвеол во всех частях легких в стандартной и относительно автоматическом режиме (21).

Малый ремоделирования дыхательных путей (SAR): увеличена осаждение белков ВКМ (особенно interstitiaл коллагены), вокруг малых дыхательных путей происходит в CS-инфицированными животными и способствует обструкции дыхательных путей. Исследователи не изучают SAR в животных моделях ХОБЛ так часто, как развитие эмфиземы (22). Для количественной оценки SAR в CS-облученных мышей, этот протокол использует программное обеспечение анализа изображений для измерения толщины слоя белков ЕСМ, который откладывается вокруг малых дыхательных путей (дыхательных путей, имеющих средний диаметр между 300 и 899 м) в парафин срезах легких окрашивали трихромом пятно Массона.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Протокол занимает ~ 25 недель. Протокол воздействию мышей воздуха или дыма в течение 24 недель. В конце дыма воздействия, меры протокола легочной функции у мышей, и легкие накачаны до фиксированном давлении, фиксированной и удалены в тот же день. Дополнительное время необходимо для исследователя, чтобы вставлять, вырезать и окрашивать разделы легких (2-3 дня), а также захватить и анализировать изображения (2-4 дней в зависимости от количества животных изучены). Этот протокол также может быть использован для измерения связанных с возрастом увеличение воздушного пространства у мышей.

Все процедуры, описанные в этом протоколе были одобрены уходу и использованию комитета Институциональная животных в Brigham и женской больницы / Гарвардской медицинской школы в.

1. всего тела Дым сигареты экспозиции

  1. Expose мышей курить в устройство воздействию табачного дыма на все тело (рис 1) установлен в вытяжном шкафу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Устройство автоматически загружает исследований сигареты в колесе, лч и сигареты, а также собирает боковой поток дыма в боковой поток дыма сбора камере, и извлекает сигареты. Машина сочетает в себе боковой поток дыма основного потока дыма с извлеченной из сигареты с помощью насоса, чтобы создать смесь основного и бокового потока дыма. Вентилятор в смесительной и разбавления камеры смешивает дым с окружающим воздухом и приводит дым в камерах облучения.
  2. Место клетки, содержащие мышей без клетки крышками удалены (рис 1) в экспозиционной камере. Разрешить мыши свободно передвигаться в своих клетках и иметь доступ к пище и воде для продолжительности воздействия дыма (~ 1,75 ч).
  3. Поместите ведро с водой под сигарет камеры для тушения выброшенного сигареты. Запустите этанол (100%) через насос и подключить его к устройству. Включите микропроцессорной элементной устройства, который инициирует автоматическую загрузку сигарет, пыхтя насоса и нагрев сигарет светодиодныека провод.
  4. Нагрузки устройств, фонари, и курит 10 сигарет в то время, а затем выбрасывает использованные сигареты и заменяет их новой партии 10 сигарет и повторяет этот процесс. Каждый цикл занимает 9 мин.
  5. Акклиматизации мышей курят, подвергая их дым от 20 сигарет в первый день, 40 сигареты на второй день, 60 сигареты на третий день, 80 сигареты на четвертый день, и 100 сигарет на пятый день. Во время периода акклиматизации, наблюдать мышей тщательно признаков дистресса.
  6. После 5 дней акклиматизации, разоблачить мышей 100 сигарет в день, 5 или 6 дней-на-неделю в течение 6 месяцев. Этот уровень воздействию табачного дыма необходимо, чтобы побудить относительно скромную воздушного пространства расширения в C57BL / 6 мышей дикого типа (23,24). Expose контрольных мышей до комнатной воздуха в помещении в течение 6 месяцев. Взвесьте мышей до дыма акклиматизации и затем еженедельно, чтобы оценить эффект воздействия дыма на массу тела.
  7. Следить за общее содержание взвешенных частицматерия (TSPM) в камерах риска после первых 60 сигарет были копчения:
    1. Взвешивание фильтровальную бумагу и поместите его в держатель фильтра на линии, который соединен с приурочено пробоотборника фильтра и сухой метр газа. Приурочен фильтр сэмплер тянет воздух из камеры облучения через фильтровальную бумагу и газа Измеритель потока воздуха во время отбора проб.
      ПРИМЕЧАНИЕ: фильтр улавливает частицы до 20 м 3 экспозиции камеры воздух проходит через фильтр (измеренная на метр сухого газа).
    2. Рассчитайте количество TPM как изменения веса фильтра до и после отбора проб (в мг) на м 3 воздуха. Идеально рассчитывает TPM находятся между 150 и 200 мг / м 3.
  8. После того как все сигареты были копченые, удалить клетки из камеры выдержки и наблюдать мышей на признаки дистресса в течение 20 мин.
  9. Очистите насос со 100% этанола после каждого использования, и чистить все порты и стержни в машине каждые две недели, чтобы способствоватьциркуляция воздуха и предотвращения накопления дегтя.

2. легочная функция Test (ПФТС) и легких Инфляция

  1. В конце экспозиции, анестезию мыши каждый, обеспечивая коктейль из кетамина (100 мг / кг), ксилазина (10 мг / кг), и ацепромазина (3 мг / кг) внутрибрюшинно в 200 мкл физиологического раствора (USP класс) и использовать ветеринарной мазь для глаз, чтобы предотвратить их от высыхания. Подождите, пока животное не находится в хирургическом плане анестезии, оценивает, используя метод схождения крайнем случае.
  2. Бритье передней кожи в трахею и дезинфицировать область с йодным раствором, содержащим последующим этанола. Сделать средней линии разрез через кожу и подкожной клетчатки передней трахеи с использованием автоклавного ножницами, и отделить sternothyroid мышцы щипцами, чтобы разоблачить трахеи.
  3. Пройдите длину 2-дюймовых шелковой нити позади трахеи, сделать трахеотомию на передней поверхности трахеи с автоклавного тRacheal ножницы, вставить трахеи канюли (18 г) в трахеотомии, и закрепите его на месте с помощью шва.
  4. Подключите мышь к Y-трубки адаптера механического вентилятора через трахеи канюли, и начать искусственную вентиляцию легких с помощью дыхательного объема 10 мл / кг и частота дыхания 150 вдохов / мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это важно на данном этапе, чтобы гарантировать мыши адекватно наркозом, чтобы получить точные измерения PFT. Повторное дозы мышь с анестетики, если животное не в хирургической анестезии плоскости. Общая продолжительность всех PFT маневров составляет около 7,5 мин, так что обычно нет необходимости redose мышей с анестетиками раз хирургическое самолет анестезии была достигнута. Общее время от индукции анестезии эвтаназии ~ 20 минут.
  5. Раздуть легкие в общей емкости легких (TLC) 3 раза для истории громкости для измерения емкости вдоха (IC) и снижения ателектаз легких. Далее, perforм одной частоте вынужденных колебаний маневр (снимок-150 возмущений) и оценить динамическое сопротивление (R), жесткости (ERS) и соблюдению (CRS) дыхательной системы, а затем широкополосного частоты вынужденных колебаний маневра (Quick Prime-3 возмущений ) и измерьте центральную сопротивление дыхательных путей (R п), сопротивление тканей (G), ткани эластичность (H) и отношение G / N (). Наконец, запись quasic статическое соответствие (C ST) во время маневров объемного расхода, давления.
  6. Повторите каждый из этих маневров в пять раз (или выполнить дополнительные меры, пока последовательные показания не будут получены) и раздувать ТСХ три раза между каждым повторным набором измерений. Запишите среднее значение для каждого параметра для каждой мыши.
  7. Отключив мышь от механического вентилятора, и усыпить его с CO 2 наркозом с последующим смещением шейных позвонков [этот метод эвтаназии одобрен нашими Уходу за животными и использованию комитета]. Сокращение диафрагмы, опан грудной клетки в средней линии, и удалить передние ребра, чтобы разоблачить легкие. Проанализируйте кожи и подкожной ткани вокруг трахеи и пройти вторую длину 2-дюймовых шелковой нити позади трахеи.
  8. Подготовка оборудования для инфляции легких (рисунок 2):
    1. Заполните 500 мл коническую колбу Эрленмейера на ¾ стерильной PBS, герметизации его с резиновой пробкой, инвертировать, и приостановить ее на кольцевом основании (так, что мениск в фосфатно-солевом буфере рН 7,4 (PBS) в 25 см над Сердце мыши).
    2. Вставьте один конец внутривенного подачи, установленного в PBS в колбу через резиновую пробку. Вставка длину 6 дюймов пластиковой пипетки серологического через резиновую пробку так, чтобы его отверстие лежит выше мениска PBS, чтобы позволить воздуху выходить заменить PBS колбу.
    3. Откройте клапан дает набор и запустить PBS, хотя система для очистки воздуха из давая набора.
  9. Подключите INTRavenous набор давая трахеи канюли, открыть клапан, и позволяют PBS поступать в легкие под действием силы тяжести, пока легкие полностью не раздувать. Закройте клапан, галстук трахею с помощью шовного хирургического дистальнее трахеи канюли, и снимите канюлю.
  10. Поднимите трахеи пинцетом и вырезать трахеи проксимальнее узла, и анализировать соединительной ткани кзади от трахеи и легких. Осторожно снимите легкие (без засечек них), и поместите легкие в пробирку, содержащую 10% раствор натрия хлорида буфером формалине. Закрепите легкие O / N в РТ, и на следующий день, мыть их с PBS в два раза.
  11. Код для вставки в легкие в парафин, разрезать 5 мкм разделы, а затем окрасить участки с пятном Гилла, как описано ниже.

3. Эмфизема

  1. Окрашивание Гилла из залитых парафином срезах легких
    1. Поместите слайды в пластиковой стойке и инкубировать их на 70 ° C в течение 20-30 мин в духовке.
    2. De-pariffinize слайдыпри инкубировании их в течение 2 мин в каждой из четырех изменений ксилола.
    3. Увлажняет слайдов, при инкубировании их в течение 2-3 мин в каждой из двух изменений 100% этанола, после чего 2-3 мин в каждой из двух изменений 95% этанола, и затем промыть слайдов дважды в PBS в течение 2-3 мин Для каждой смене раствора.
    4. Инкубируйте слайды в течение 18-48 ч в 1: 1 смеси гематоксилином Гилла и модифицированного Harris гематоксилином.
    5. Промыть слайдов в течение 2 мин в каждой из пяти сменах дистиллированной воды и обезвоживают слайды путем инкубации затем в течение 2-3 мин в каждой из двух изменений 95% этанола, с последующим 2-3 мин в каждой из 2 изменений 100% этанола.
    6. Очистка слайды, при инкубировании их в течение 2 мин в каждой из четырех изменений ксилола.
    7. Установите слайды с четкими монтажными средствами и добавить покровное без введения пузырьков, которые будут препятствовать их последующего анализа.
  2. Рандомизированное получения изображений:
    1. Приобретать черно-белых изображений, как TIFF-файлс с помощью микроскопа, 20 X цели, и камера и программное обеспечение, которые могут приобрести высококачественные цифровые изображения.
    2. Захват ~ 20-30 изображений (X 200 увеличения) на мышь в случайным образом, с наблюдателем, не знающим о экспериментальных условиях, избегая при завышенных участков легких.
    3. Лента микро-слайд-поля-Finder на слайде. Finder поле имеет сетку, содержащий ряд квадратов, которые обозначены буквой (в вертикальном направлении) и число (в горизонтальном направлении), и каждый квадрат имеет крест (+) в центре и идентифицируется одной буквой и номер (например, А1, А2, ...... Z25).
    4. Используйте случайного поля Генератор Excel таблицу, чтобы случайным образом выбрать квадрат для захвата изображения. Чтобы создать случайные буквы, введите EFGHJKLMNPQRSTU в ячейку B1 в таблице (исследователь может настроить этот письмо диапазон охватывают диапазон квадратов, определенных в письме, что перекрывать легких). Затем добавьте формулу [= MID ($ B $ 1,1 + INT(RAND () * LEN ($ B $ 1)] в ячейку С1 случайным образом выбирать буквы в С1. Скопируйте и вставьте С1 в С2, С3, С4 и так далее, чтобы создать столбец случайных букв.
    5. Чтобы создать случайное число в соседней колонке, введите формулу = RANDBETWEEN (5,25) в D1 (где 5-25 является Типичный диапазон ткани на слайде). По желанию, регулировать этот диапазон, чтобы охватить весь диапазон квадратов, определенных ряда, что перекрывают легкие.
    6. Копирование и вставка D1 в D2, D3, D4 и так далее, чтобы генерировать столбец случайных чисел рядом с этим, содержащих случайных букв. Таким образом, каждая строка содержит пару случайно сгенерированных букв и цифр, соответствующих меток на площадях в поле видоискателя (например, E17, H24 ....).
    7. Поместите слайд на микроскопом. Использование объектива микроскопа 4X найти соответствующий квадрат в поле видоискателя слайд (например, E17, H24 ...) и поместите этот квадрат в центре поля микроскопа.
    8. Совместите центр микроскопическихполе с "+" в центре выбранной площади. Удалить искатель поля, сосредоточиться на легких с использованием объектива микроскопа 20X и приобрести изображение в виде файла в серой шкале TIF. Если легочной ткани чехлов <50% от микроскопического поля, выберите следующий случайно сгенерированные кв. Повторяйте до тех пор ~ 20-30 изображения не будут захвачены для каждого животного. Сохранить все изображения для каждого животного в одной папке с надписью с номером тега животного для того, чтобы Excel Report макро признать файлы.

4. Морфометрия измерить эмфизема

Протокол использует Scion Image и индивидуальные макросы для анализа расширения воздушного пространства. Scion Изображение для Windows-совместимая версия оригинального NIH применения образ, который работает под управлением операционной системы Macintosh. Scion Image работает под Windows XP и по-прежнему доступен в режиме онлайн через Wikiversity.org, где поиск по запросу "Scion Image" будет направлять пользователя к ссылкам наРуководство и бета 4.0.2 релиз Scion Image. Установка и программное обеспечение операция подробно описана в руководстве онлайн дополнить и приведены ниже. Альвеолярного длина хорды макро была заимствована из макроса, имеющихся в NIH Image.

  1. Подготовка TIFF изображение из цветного разделе легких жаберных для анализа изображений Scion:
    1. Начните Scion Image и загрузить макросы, как указано в онлайн дополнения. Выберите Open светлое изображение [1] макрос, чтобы выбрать и открыть файл изображения в формате TIFF. Затем, используя изображения инструментов редактирования, чтобы подготовить образ для анализа.
    2. Используйте инструмент Кисти малярные, чтобы заставить областей снимка, которые не в воздушном пространстве или альвеолярных стенок, чтобы рассматриваться как в качестве воздушного пространства или ткани. Например, краска бронхов и сосудов черный, так что они анализируют, как ткани. Краска воспалительные клетки (пыль), занимающие места в альвеолы ​​белого, они анализировали, как воздушное пространство.
    3. Выберите цвет краски кисти, нажав на указатель мыши наслова, черный или белый на нижней части окна LUT. Далее, выберите инструмент кисть. Чтобы изменить размер кисти, дважды щелкните на инструменте кисти и введите подходящий размер кисти. Щелкните и перетащите курсор на изображение, чтобы нарисовать структур выбранный цвет (см # 1 выше).
  2. Измерение средней длине хорды воздушного пространства
    1. Выберите макрос длине хорды воздуха [2] для измерения длины воздушного пространства аккорда.
    2. Порог изображение сначала, кликнув мышкой недалеко от центра изображении, а затем перетащите мышь вверх или вниз, чтобы отрегулировать пороговое значение (число между 0 и 255, которое показано в окне Info). Щелкните мышью еще раз, чтобы принять пороговое значение. Регулировка порога, чтобы сделать альвеолярных стенок и той же толщины, что и в исходных изображений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно, чтобы исследователь не под порога и тем самым создать разрывы в стенках альвеол, которые не существуют в исходном изображении, которая будет производитьискусственно значения длины высокого аккорд.
    3. Программа автоматически удаляет отдельные пиксели (одиночные черные пикселы в окружении 8 белых пикселей).
    4. EM> 4.2.4. Соблюдайте окно, которое предлагает пользователю повторно пороговое бинарное изображение, продолжают макрос или отменить макрос. Для порога снова, ответьте Y в строке и нажмите кнопку OK.
    5. EM> 4.2.5. Визуализируйте горизонтальный и вертикальный окно сетку с линии 5 пикселей, кроме созданных с помощью макросов. Программа измеряет длину горизонтальных и вертикальных линий, которые пересекаются воздушное пространство.
    6. Сохраните файл в любую папку, но не изменить имя по умолчанию в противном случае макросы Excel отчет не найдете файл (формат имя образа с добавлением "CLa.txt" для длины воздушного пространства аккорда.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если программа не делает замеры, пороговое значение может быть слишком низкой (должно быть> 1). Если это происходит, исследователь повторно пороги изображение, используя более высокое значение.
    7. EM> 4.2.7. Для измерений альвеолярных области (в дополнение к аккорд длины), запустите дополнительно [4] и [5] макросы, а также.
    8. EM> 4.2.8. Продолжайте, пока все изображения не были проанализированы.
  3. Анализируя результаты, используя Excel Report макросов
    1. Открыть Excel Report 20x.xls. Включить вручную макросов при необходимости в зависимости от настроек безопасности по умолчанию в версии Excel используется.
    2. Соблюдайте список макросов в макро окна (см таблицу 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: CL_Air_1 сообщает длины хорды воздушного пространства для одного животного (папку). CL_Air_Multi сообщает длины хорды воздушного пространства для нескольких животных (папок). AP_No_Edge_1 сообщает площадь альвеол без края контактов для одного животного (папка) .AP_No_Edge_Multi сообщает площадь альвеол без края контактов для нескольких животных (папок). AP_With_Edge_1 сообщает площадь альвеол с ребром контактов для одного животного (папку). AP_With_Edge_Multi сообщает площадь альвеол с ребра сontacts для нескольких папок.
    3. Выберите макрос CL_Air_Multi сообщить альвеолярные измерения длины хорды для нескольких папок, соответствующих изображений из нескольких мышей. Программа сообщает все файлы _CLa.txt в выбранных папках. Исключить файл _CLa.txt (при необходимости), перемещая его в подпапку текущей папки или переименования часть _CLa.
    4. Из окна файлов выберите одну папку в то время, выделив папку и выбрав OK (программа не поддерживает множественный выбор в одно время). Как выбирается каждая папка, наблюдать его на листе. Выберите "Отменить" или закрыть окно файла, чтобы продолжить.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от версии Excel, исследователь, возможно, придется вернуться обратно на один уровень папок после выбора каждой папки.
    5. Соблюдайте отдельный лист для каждой папки, показывая статистику для каждого файла _CLa.txt последующим статистики для данных Длина хорды в сочетании со всех файлов _CLa.txt.
      6. отдельный лист "Все CL" содержит все данные из всех таблиц.
    6. Переименовать и сохранить таблицу. Имя файла по умолчанию имя родительской папки, к которому добавлены _CLa.xls. Закройте таблицу перед выбором другого макроса.

5. Малый дыхательных путей Ремоделирование

  1. Окрашивание и получение изображений
    1. Пятно разделы легких с трихромом пятно Массона, используя коммерческий набор и следуйте инструкциям изготовителя.
    2. Захват изображения всех дыхательных путей в обоих легких, которые могут быть размещены полностью (в том числе синего слоя за пределами дыхательных путей, которая является слой ECM белков, которые депонированы) в пределах области изображения с использованием цели 20X на микроскопе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Большие дыхательные пути не связано с повышенным отложением белков ЕСМ в CS-мышей, подвергавшихся воздействию.
    3. Сохраните цветные изображения, как JPEG файлы.
  2. Анализ изображений: Откройте файл изображенияв программе анализа изображения.
    1. Откройте и имя файла журнала для записи измерений.
    2. Выберите линия инструмент для рисования. Draw 4 линии, пересекающие просвет дыхательных путей (внутренний диаметр), чтобы измерить размер дыхательных путей и только те, включают дыхательные пути, имеющие желаемый размер в области анализа. Далее, сделать 12 равномерно распределенных линий (в положении в дыхательных путях, соответствующего количества часов), проходящей от края адвентициальной слоя, примыкающей к дыхательных путей к краю сине-окрашенных области окружают дыхательные пути для измерения толщины слоя белков ЕСМ, осажденных за пределами дыхательных путей (фиг.5). Избегайте измерения области, где дыхательных путей взаимодействия с другими дыхательных путей или сосудов.
    3. Первая запись всех линий внутренний диаметр в лог-файле, а затем записать 12 линий, которые измеряют толщину синего ECM слоя вокруг дыхательных путей.
    4. Закрыть изображение затем открыть следующий файл.
    5. Повторите эти шаги, пока все снимки для животного не были записаны в одну папку.
    6. Начните с шагом 5,2 для следующей папке, которая содержит изображения, снятые на срезах легких от следующего животного. Выход из программы после завершения анализа всех дыхательных путей в срезах легких из всех животных в эксперименте.
    7. Введите измерения 4 Внутренний диаметр и 12 ECM измерения толщины белка уровня, записанные для каждой дыхательных путей для каждой мыши в лог-файлах данных в электронную таблицу Excel. Нормальное измерения толщины слоя диаметра и ECM белка для каждого животного.
    8. Преобразование измерения от пикселей микрон.
    9. Группа дыхательных путей в зависимости от их размера внутреннего диаметра (напр.,, 300-399 мкм, 400-499 мкм и т.д.), и сравнить ECM измерения толщины белок слой вокруг дыхательных путей, имеющих сходные размеры для авиа- против табачного дыма мышей, подвергавшихся воздействию (например,., дыхательных путей, имеющие диаметр 300-899 мкм; Рисунок 5).
    10. При необходимости, immunostain срезах легких для индивидуальных белков (в том числе интерстициальных коллагенов и базальной мембраны белка) и выполнить подобный анализ для количественной оценки отложения белков, представляющих интерес, используя этот метод.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этот протокол начинается с воздействием всего тела мышей на CS. Надлежащего надзора и технического обслуживания устройства и мониторинга TPM рассчитывает обеспечить устойчивые воздействия дыма (рисунок 1). Важно, чтобы исследователь практикует технику инфляции легких с помощью инфляции устройство

Этот протокол начинается с воздействием всего тела мышей на CS. Надлежащего надзора и технического обслуживания устройства и мониторинга TPM рассчитывает обеспечить устойчивые возде...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Большинство исследователей используют мышей для моделирования основных хронических патологий легких и аномальной физиологии легких при ХОБЛ (расширение воздушного пространства, SAR и повышение податливости легких), присутствующих при заболевании человека. Необходим комплексный подход к оценке влияния представляющих интерес молекул как на развитие эмфиземы, так и на SAR, у мышей с целью всесторонней оценки активности молекул, представляющих интерес в этих хронических патологических процессах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У нас нет никаких конфликтов интересов, которые мы могли бы раскрыть.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Франческа Польверино доктор медицинских наук, научный сотрудник Бригама и женской больницы за ее вклад в эту статью, а также Моника Яо, BS, и Кейт Rydell, BS за помощь в мышиной хозяйства и подвергая мышей сигаретного дыма.

Эта работа была поддержана Государственной службы здравоохранения, Национальный институт сердца, легких и крови институт грантов HL111835, HL105339, HL114501, бортпроводники Института медицинских исследований грант № CIA123046, Бригама и Женской больницы-Лавлейс органов дыхания НИИ консорциума, и Кембриджского NIHR Biomedical Научно-исследовательский центр.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Устройство для воздействия дыма на все телоTeague EnterpriseTE-10zВоздействие хронического дыма для индуцирования хронического заболевания легких у мышей
Исследование сигаретУниверситет Кентукки3R4F эталонные сигареты
Pallflex® Фильтры контроля воздуха, фильтры Emfab TX40HI20WW, 25 ммPall Corporation7219Для измерения TPM
держатель фильтра PallCorporation
Фильтр пробоотборникIntermaticMetal T100
Счетчик газаAEMСчетчики газа G1.6; G2.5; G4
Трахеальная канюля для мышей 18 калибраLabизобретениеАнализ функции легких
Аппарат искусственной вентиляции легкихScireqFlexiVent
Раствор гематоксилина Гилла Sigma-AldrichGSH316Для окрашивания жабр, работы под вытяжным шкафом
раствором гематоксилина, Harris модифицированныйSigma-AldrichHHS16
Cytoseal-60Thermo Scientific8310-16
Micro-Slide-Field-FinderAndwin Scientific INC50-949-582Для анализа эмфиземы
Scion Image Program Scion Corporation
Трихромное окрашивание МейсонаSigma-AldrichHT15Для анализа малого фиброза дыхательных путей
MetaMorp Offline версия 7.0Molecullarlar Devices LLC31032
25 мм

Ссылки

  1. Murray, C. J., Lopez, A. D. Measuring the global burden of disease. N. Engl. J Med. 369, 448-457 (2013).
  2. Wright, J. L., Cosio, M., Churg, A. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. Am. J Physiol Lung Cell Mol. Physiol. 295, 1-15 (2008).
  3. Hautamaki, R. D., Kobayashi, D. K., Senior, R. M., Shapiro, S. D. Requirement for macrophage elastase for cigarette smoke-induced emphysema in mice. Science. 277, 2002-2004 (1997).
  4. Churg, A., et al. Late intervention with a myeloperoxidase inhibitor stops progression of experimental chronic obstructive pulmonary disease. Am. J. Respir. Crit Care Med. 185, 34-43 (2012).
  5. Churg, A., Zhou, S., Wang, X., Wang, R., Wright, J. L. The role of interleukin-1beta in murine cigarette smoke-induced emphysema and small airway remodeling. Am J Respir. Cell Mol. Biol. 40, 482-490 (2009).
  6. Hogg, J. C., et al. The nature of small-airway obstruction in chronic obstructive pulmonary disease. N. Engl. J. Med. 350, 2645-2653 (2004).
  7. Paigen, K. A miracle enough: the power of mice. Nat. Med. 1, 215-220 (1995).
  8. Vlahos, R., Bozinovski, S. Recent advances in pre-clinical mouse models of COPD. Clin. Sci. (Lond). 126, 253-265 (2014).
  9. Churg, A., Tai, H., Coulthard, T., Wang, R., Wright, J. L. Cigarette smoke drives small airway remodeling by induction of growth factors in the airway wall). Am. J. Respir. Crit Care Med. 174, 1327-1334 (2006).
  10. Guerassimov, A., et al. The development of emphysema in cigarette smoke-exposed mice is strain dependent. Am. J. Respir. Crit Care Med. 170, 974-980 (2004).
  11. van Eijl, S., van Oorschot, R., Olivier, B., Nijkamp , F. P., Bloksma, N. Stress and hypothermia in mice in a nose-only cigarette smoke exposure system. Inhal. Toxicol. 18, 911-918 (2006).
  12. Mauderly, J. L., et al. Comparison of 3 methods of exposing rats to cigarette smoke. Exp. Pathol. 37, 194-197 (1989).
  13. Yao, H., et al. Extracellular superoxide dismutase protects against pulmonary emphysema by attenuating oxidative fragmentation of ECM. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 15571-15576 (2010).
  14. Crane-Godreau, M. A., et al. Modeling the influence of vitamin D deficiency on cigarette smoke-induced emphysema. Front Physiol. 4, 132(2013).
  15. McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the forced oscillation technique. J Vis. Exp. , e50172(2013).
  16. De Vleeschauwer, S. I., et al. Repeated invasive lung function measurements in intubated mice: an approach for longitudinal lung research. Lab Anim. 45, 81-89 (2011).
  17. Dunnill, M. S. Quantitative methods in the study of pulmonary pathology. Thorax. 17, 320-328 (1962).
  18. Saetta, M., et al. Destructive index: a measurement of lung parenchymal destruction in smokers. Am Rev. Respir. Dis. 131, 764-769 (1985).
  19. Saito, K., Cagle, P., Berend, N., Thurlbeck, W. M. The 'destructive index' in nonemphysematous and emphysematous lungs. Morphologic observations and correlation with function. Am Rev. Respir. Dis. 139, 308-312 (1989).
  20. Robbesom, A. A., et al. Morphological quantification of emphysema in small human lung specimens: comparison of methods and relation with clinical data. Mod. Pathol. 16, 1-7 (2003).
  21. Moghadaszadeh, B., et al. Selenoprotein N deficiency in mice is associated with abnormal lung development. FASEB J. 4, 1585-1599 (2013).
  22. Churg, A., Sin, D. D., Wright, J. L. Everything prevents emphysema: are animal models of cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease any use. Am J Respir. Cell Mol. Biol. 45, 1111-1115 (2011).
  23. McComb, J. G., et al. CX3CL1 up-regulation is associated with recruitment of CX3CR1+ mononuclear phagocytes and T lymphocytes in the lungs during cigarette smoke-induced emphysema. Am. J. Pathol. 173, 949-961 (2008).
  24. Mizumura, K., et al. Mitophagy-dependent necroptosis contributes to the pathogenesis of COPD. J. Clin. Invest. 124, 3987-4003 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

воздействие сигаретного дыматестирование функции легкихискусственная вентиляция легкиханализ окрашивания по Гиллуокрашивание трихромом по Массонудлина альвеолярных хордотложение внеклеточного матриксаавтоматизированный анализ изображений
Автоматическое измерение эмфиземы легких и малых дыхательных путей Ремоделирование в сигаретном дыме, подвергшихся воздействию мышей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.