Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Измерение мРНК темпы разложения в

12K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52240

⸱

13 декабря 2014 г.

 , 
1Department of Biology, Baylor University

В этой статье

Краткое содержание

Устойчивый государственный уровень специфических мРНК определяется скоростью синтеза и распада мРНК. По всему геному темпы деградации мРНК или нормы распада специфических мРНК может быть измерена путем определения мРНК полураспада. Этот протокол фокусируется на измерении скорости распада мРНК в Saccharomyces CEREVISIAE.

Аннотация

мРНК уровни стационарные варьируются в зависимости от условий окружающей среды. Регулирование устойчивых уровней накопления государство мРНК гарантирует, что нужное количество белка синтезируется для конкретных условий роста клетки. Один из подходов для измерения скорости распада мРНК ингибирования транскрипции и затем мониторинг исчезновение уже присутствующего мРНК. Скорость распада мРНК может быть количественно и точное время полужизни может быть определено с использованием нескольких методов. В S. Cerevisiae, протоколы, которые измеряют мРНК полураспада были разработаны и включают в себя ингибирования транскрипции мРНК с использованием штаммов, которые укрывают чувствительный к температуре аллель РНК-полимеразы II, rpb1-1. Другие методы измерения мРНК наполовину жизни включают ингибирующие транскрипцию с транскрипционными ингибиторов, таких как thiolutin или 1,10-фенантролина, или альтернативно, используя мРНК, которые находятся под контролем регулируемого промоторатаких, как галактоза индуцируемого промотора и-офф ТЕТ системы. Здесь мы описываем измерение S. скорость распада CEREVISIAE мРНК с использованием чувствительный к температуре аллель РНК-полимеразы II. Этот метод может быть использован для измерения мРНК скорости распада отдельных мРНК или генома.

Введение

Транскрипции и распад мРНК специфическими являются важными детерминантами генной экспрессии. Скорость синтеза и распада специфических мРНК определяет стационарный уровень этой конкретной мРНК. Стационарное состояние уровни мРНК регулируют изобилие мРНК и определить, сколько каждого мРНК доступна для синтеза белка. Измерения мРНК полураспада широко используются для определения скорости распада мРНК. Удельный распада мРНК с различной скоростью, которые связаны с особенностями мРНК, в зависимости от белка, кодируемого мРНК и от условий окружающей среды. В зависимости от техники, используемой для определения скорости распада мРНК, измерения скорость распада может быть определена глобально или для отдельных транскриптов. В дрожжах S. Cerevisiae, методы, которые наиболее часто используются для измерения скорости распада глобальной мРНК включать в себя использование штамм дрожжей, несущих чувствительный к температуре аллель РНК-полимеразы II и химической Закавкriptional ингибиторы, такие как thiolutin и 1,10-фенантролина 1-5. Эти методы также могут быть использованы для измерения скорости распада мРНК отдельные 4. Другие способы также могут быть использованы для измерения скорости распада мРНК. Эти методы включают в себя подход к стационарного маркировки или использования молекул мРНК, которые выражаются с регулируемой промотором, который выражается только в некоторых условиях. Каждый из этих методов имеет свои преимущества и недостатки. Методика описана здесь использует чувствительный к температуре аллель РНК-полимеразы II. Этот метод использует S. CEREVISIAE в качестве модели, но может были изменены и использованы в других системах с использованием специфических методик транскрипции ингибирования 6.

мРНК измерения периода полураспада, использующие чувствительный к температуре аллель РНК-полимеразы II широко используются для обоих генома и физических измерений мРНК распада 4-5. Этот метод требует использование specifIC штамм дрожжей, которые таит в себе чувствительный к температуре аллель РНК-полимеразы II, rpb1-1 1. Основанием для этого метода является то, что воздействие на чувствительный к температуре штамма дрожжей к непермиссивной температуры ингибирует синтез мРНК. Впоследствии, распад мРНК существовавшие ранее контролируется в различные моменты времени после транскрипции был запрещено. Исчезновение существовавшие ранее мРНК контролируется путем экстракции РНК из дрожжевых клеток в различные моменты времени после транскрипции был выключен. Моменты времени, в котором дрожжевые клетки собирают предопределены пилотного эксперимента, и зависят от стенограммы и системы ведется расследование. Быстрее моменты времени используются для короткоживущих транскриптов, в то время как более длинные временные точки используются для более долгоживущими транскриптов. После распада мРНК контролируется либо северной блот анализа, количественной ПЦР или RNAseq.

Измерение мРНК полураспада, используя TEmperature чувствительны аллель РНК-полимеразы II имеет свои преимущества. Во-первых, эта техника легко и прямо вперед. Во-вторых, после того, как штамм дрожжей приобретается или генерируется в лаборатории измерения периода полураспада мРНК может быть определена в различных условиях роста; позволяет определить влияния окружающей среды на мРНК распада. В-третьих, скорость распада мРНК может контролироваться генома. Использование других методов ингибирования транскрипции также имеет свои преимущества и недостатки. Например, использование индуцируемого промотора требуется субклонирования, чтобы генерировать мРНК, которое под контролем регулируемого промотора. Thiolutin не легко доступны и дорого если таковые имеются. Кроме того, режим thiolutin по действию не полностью понимали, и было сообщено, чтобы влиять на другие клеточные процессы, включая ингибирования мРНК распада 7. В качестве альтернативы, 1,10-фенантролина, более легко доступны. Кроме того, все методы, используемые для ингибирования транскрипции может ПертУРБ клеточную функцию и может влиять на различные мРНК в различных направлениях. Следователь должен определить наиболее подходящий метод для использования в своих экспериментальных условиях для достижения наиболее надежные результаты. Чтобы определить, какой метод является наиболее подходящим для их применения, исследователь должен определить стенограммы и функции белков, кодируемых транскриптов ведется расследование. Наиболее надежные измерения скорости мРНК распада являются те, которые определяются с помощью нескольких методов и показать такую ​​же скорость распада. Ни один метод не всегда лучше, и наиболее подходящий метод зависит от конкретной ситуации.

Многочисленные исследования, проведенные в S. Cerevisiae измерили скорость распада мРНК в различных условиях и генетического происхождения. Условия что ставки мРНК распада, измеряемые в зависимости от конкретных эксперимент ведется расследование. Измерение скорости распада мРНК в различных клеточных средах определяет, являются ли условия бытияобследованных преимущественно влияют на скорость распада конкретных мРНК. Скорости распада мРНК может также варьировать в зависимости от штамма дрожжей используется. Например, скорость распада мРНК может быть определена в дрожжевых клетках дикого типа и клеток дрожжей с нефункциональной бред-опосредованной деградации мРНК (NMD) пути. Эта мРНК путь деградации встречается во всех эукариотических организмов, которые были изучены до сих пор и это вызывает деградацию мРНК, которые досрочно прекратить перевод 8. ПРО изначально определен как путь, который ухудшает мРНК с преждевременным кодонов терминации или бессмысленных кодонов, но в настоящее время признается в качестве пути, который также регулирует экспрессию не-глупости, содержащих природные мРНК. мРНК, которые стали целями пути быстро деградируют в дрожжевых клетках с функциональным ПРО пути и стабилизируется в дрожжевых клетках с нефункциональном ПРО пути. Таким образом, период полураспада мРНК, которые являются прямыми целями этого пути короче в дикого типа дрожжей челLs по сравнению с дрожжевых клеток с нефункциональной ПРО пути.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Рост клеток дрожжей

  1. Выберите соответствующие штаммы дрожжей, которые будут использоваться для измерения скорость распада мРНК. Для подавления транскрипции с помощью чувствительный к температуре аллель РНК-полимеразы II, использовать дрожжевые штаммы, несущие rpb1-1 мутацию 1. Получить этот штамм дрожжей из лаборатории, который уже имеет один или генерировать его в лаборатории с помощью стандартных методов, если конкретный генетический фон требуется 9.
  2. Использование метода стерилизации, подготовки дрожжей СМИ, используя стандартные процедуры 10. Если выбор не требуется, подготовить мультимедийные такие как YPD. С другой стороны, подготовка селективной среде, если дрожжевые клетки, трансформированные плазмидами, и выбор не требуется. Автоклав СМИ.
  3. Выращивают дрожжевых клеток при 28 ° С, которая является разрешающей температуре для этого штамма дрожжей. Сделайте это в два этапа:
    1. Для первого O / N, растут дрожжевых клеток в 5 мл питательной среды на насыщение.
    2. Настройка второго O / N в конце второго дня. Для второго O / N, инокуляции различные количества дрожжевых клеток от первого O / N в от 100 до 150 мл питательной среды (в пределах от 100 мкл до 1 мл, 2 мл или более, в зависимости от того, когда дрожжевые клетки должны быть собирают на следующий день). Этот шаг, чтобы гарантировать, что один из культур при правильном OD 600 на следующий день.

2. Урожай дрожжевых клеток

  1. Приготовьтесь к тому, урожай дрожжевых клеток. Время для этого шага является критическим; маркировать все необходимые трубы и собрать все необходимое оборудование и материалы в одном месте. Предварительный нагрев на водяной бане до 39 ° С и предварительного нагрева два 15 мл пробирках с питательной среды при 28 ° С и при 60 ° С.
    Примечание: объем 15 мл питательной среды может изменяться в зависимости от количества временных точках клетки должны быть собраны.
  2. Урожай дрожжевых клеток, когда они достигают ОР 600 от 0,4 до 0,7. Transfэ клетки до 4 - 6 стерильных 50 мл с винтовой крышкой бутылки. Центрифуга при 7500 х г в высокоскоростной центрифуге в течение 5 мин при комнатной температуре.
  3. Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют гранул в питательной среде 15 мл, что было в равновесие при 28 ° С. Бассейн дрожжевых клеток в одном стерильную колбу объемом 250 мл и уравновешивают их в течение ~ 5 мин при температуре роста 28 ° C.
  4. После того, как дрожжевые клетки уравновешивали при температуре роста, сразу же добавить 15 мл питательной среды, уравновешенную при 60 ° С, чтобы повысить температуру до 39 ° C (температура) запрещающих и сразу же колбу помещают на водяную баню на 39 ° , Убедитесь, что питательная среда остается в ванне C воды 39 ° в течение оставшихся шагов сбора клеток для того, чтобы транскрипция выключен.
  5. Урожай клетки в разное время после помещения колбы в водяной бане 39 °. Для первой точки времени, сбора клеток сразу же после помещения колбы в 39 и #176; С. Урожай 3 мл аликвоты и распространять 3 мл на две части, 1,5 мл микроцентрифужных пробирок. Осаждения клеток в течение 10 сек в мини центрифуги или picofuge с быстрым замедлением и вылейте супернатанта.
  6. Сразу заморозить осадок в сухой лед / этанол бане или в жидком азоте. Назначают первый момент времени клетки собирали в качестве нулевой момент времени.
  7. Экспериментально определить временные точки клетки собирают в дальнейшем с помощью пилотного эксперимента, в зависимости от мРНК, представляющих интерес. Как правило, урожай дрожжевые клетки в следующих временных точках: 0, 3, 6, 9, 12, 18, ​​25 и 35 мин (рис 2b). Если мРНК полураспада не может быть определена с помощью вышеуказанных точек времени, регулировать эти временные точки. Например, для мРНК с ожидаемым коротким периодом полураспада, использовать более короткие времена точек (то есть, 0, 1, 2, 3, 4, 6, 9, 12 и 18 мин) и мРНК с ожидаемым длинным периодом полураспада, расширить моменты времени.
  8. После клеток гаrvested, храните их в -80 ° C морозильнике до экстракции РНК осуществляется.

3. Выписка РНК из дрожжевых клеток

  1. Для извлечения части РНК протокола, используйте РНКазы методы для предотвращения деградации РНК РНКазы. Подготовка РНКазы решения, посуда и пластиковая посуда для использования в экстракции РНК.
  2. Извлечение РНК из дрожжевых клеток в соответствии со стандартными протоколами. Как правило, используется метод горячего фенола 12. В качестве альтернативы, использовать наборы, которые могут быть использованы для извлечения РНК из клеток дрожжей.
  3. Определить количество и чистоту РНК, как правило, путем измерения оптической плотности при 260 и 280 из 2 мкл РНК с помощью NanoDrop. Определить концентрацию РНК от A 260. На основе концентрации, разбавить РНК до 1 мкг / мкл с использованием DEPC обрабатывают водой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: отношение A 260/280 предоставляет информацию о тон чистота РНК. Образец РНК чистым, если соотношение 260/280 2.0 ± 0.1.

4. Северная блот анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте северные помарки количественно уровни мРНК и получить информацию о размере транскриптов. Кроме того, использование нозерн-блоттинга для обнаружения мРНК получения нескольких изоформ одного и того же мРНК.

  1. Приготовьте 1,0% агарозном геле с формальдегидом. Запуск равные количества РНК образца на агарозном геле формальдегида с помощью электрофореза в соответствии со стандартными протоколами 12. Запуск РНК лестнице рядом образцов РНК и использовать его для определения размеров РНК, которые обнаружены на севере пятно. Перед передачей РНК, разделенных на агарозном геле формальдегида к мембране, разрезать полосу с РНК лестницы из геля и визуализации с использованием бромистый этидий.
    Примечание: В качестве альтернативы, если весь гель может быть окрашивали бромистым этидием перед передачей РНК.
  2. Образцы осле РНК мигрировали в надлежащем расстоянии от геля, трансфер РНК на мембрану с помощью РНКазы методы. Используйте один из нескольких имеющихся протоколов для передачи РНК мембран 12-13. Для передачи РНК на мембрану, сократить мембраны примерно того же размера, что и гель. Передача РНК в соответствии со стандартными протоколами 12.
  3. УФ кросс-Link РНК с мембраной с помощью УФ-сшивающий агент, следуя инструкциям изготовителя. Кроме того, печь мембраны в печь, установленную на 80 ° C в течение 1 часа. Хранить мембрану при -20 ° С в пластиковом пакете бесконечности, пока он не образует гибрид с специфических зондов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: сухая мембрана также может храниться при комнатной температуре между фильтровальной бумаги.

5. гибридизующиеся Зонды В дополнение к РНК интересов с мембраной

Примечание: Один из способов выявления мРНК на мембраны для гибридизации 32 P меченых ДНК-зондов. ВНИМАНИЕ: исследовrchers, работающие с 32 P необходимо использовать защитные процедуры для предотвращения загрязнения. Следуйте институциональные рекомендации по использованию радиоактивных материалов.

  1. Подготовка ДНК-зонда путем маркировки 25 - 50 нг ДНК, подлежащей гибридизации с мембраной в соответствии со стандартными протоколами 12. Генерирование фрагмент ДНК с помощью ПЦР или плазмиды пищеварения. Определить удельную активность ДНК-зонда путем подсчета 1 мкл меченого ДНК-зонда после некорпоративные нуклеотиды удал 12.
  2. Разогреть буфер предгибридизацию / гибридизация при 42 ° C. Использование ~ 10 мл буфера предгибридизацию / гибридизации на 100 см 2 мембраны 12.
  3. Гибридизоваться 1 - 5 × 10 6 СРМ радиоактивно меченного зонда ДНК на мл буфера гибридизации с мембраной O / N в гибридизации печи для обнаружения мРНК интерес 12. Убедитесь, что во время гибридизации вращение гибридизации печь в направлении,вызывает весь мембраны подвергаться растворе для гибридизации, чтобы обеспечить надлежащее гибридизации.
  4. Промыть мембраны в два раза при комнатной температуре в течение 15 мин с 50 мл 2 раза ПСПЭ и один раз при 65 ° С с 50 мл 2х ГНПП / 2% SDS в течение 15 мин 12. Оберните мембраны в полиэтиленовую пленку, чтобы убедиться, что он не высохнет и не загрязнять, люминесцентный экран.
  5. Используя счетчик Гейгера, оценить интенсивность радиоактивности на мембране.
    Примечание: Эта оценка гарантирует, что мембрана подвергается люминесцентным экраном для соответствующего периода времени. Используйте более длительного времени воздействия для мембран с низким содержанием радиоактивности.
  6. Для северных пятна, используйте контроль загрузки, чтобы подтвердить, что равные количества РНК установлен на каждом месте. Чтобы сделать это, лишить мембрану и reprobe его с РНК, которая не влияет на процесс изучается. Полоса мембрану, поместив его в стеклянную лоток, содержащий 200 мл кипящей зачистки раствора (0,1% SDS / 0,01 XSСК) в течение 2 мин. Вылейте зачистки решение и повторите процедуру пять раз 12.
    Примечание:. Пример РНК использовали в качестве контроля нагрузки является SCR1 SCR1 является РНК-полимераза III транскрипт, что является стабильным и в изобилии SCR1 РНК изобилие не должно существенно меняться в течение коротких периодов РНК-полимеразы II, ингибирование..

6. Количественная РНК, которая связывается с мембраной

Примечание: Для определения количества радиоактивности на мембране, подвергнуть мембрану к люминесцентным экраном. После соответствующей времени экспозиции, сканирование, люминесцентный экран, используя Phosphorimager.

  1. Сканирование, люминесцентный экран, используя инструкции, предоставленные производителем Phosphorimager.
  2. Количественная мРНК в каждый момент времени. Количественного определения уровней мРНК с использованием ImageQuant программное обеспечение или программное обеспечение. Нормализация мРНК в каждый момент времени на контроль нагрузки. Если SCR1 был использован в качестве загрузкиконтроль, нормализовать Half-Life северян к SCR1.
  3. Период полураспада мРНК рассчитывается путем деления количества мРНК оставшееся в каждый момент времени на величину мРНК настоящее в момент времени 0 (начальная точка времени). Графе процентов мРНК оставшееся от времени в полулогарифмическом участка (рис 2С). Рассчитать мРНК полураспада по следующему уравнению:
    т 1/2 = -0,693 / к (отрицательный 0.693)
  4. К наклон наиболее соответствующей линии и т 1/2 мРНК Half-Life.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Способность этого протокола для точного измерения скорости распада мРНК зависит от ингибирования транскрипции, уборки дрожжевых клеток в соответствующих временных точках и использования РНКазы методов при извлечении РНК и нозерн-блоттинга. Исследование в течение двух мРНК управления известно, является нестабильным и стабильным, соответственно, обеспечивает уверенность в том, эксперимент удался. Например, это может быть достигнуто путем зондирования с зондом, который обнаруживает как CYH2 пре-мРНК и мРНК. ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Ингибирование синтеза мРНК и мониторинга оборот мРНК в отсутствии нового синтеза является метод, который часто используется для измерения скорости распада мРНК. В S. CEREVISIAE, измерение скоростей мРНК распада путем ингибирования транскрипции с использованием чувствительный к температуре аллель РНК-полимеразы II является одним из наиболее часто используемых методов. Этот метод специфически ингибирует РНК-полимеразы II. Наиболее важные шаги для определения скорости распада мРНК с использованием такой технологии...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Исследования в лаборатории автора поддерживаются Программой перспективных исследований Нормана Хакермана Техасского координационного совета по высшему образованию и стартовыми фондами Университета Бэйлора.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Высокоскоростная центрифугаEppendorf22628169
Мини-центрифугаFisher Scientific05-090-100
Мембрана Genescreen PlusPerkinElmer50-905-0169
Гибридизационная печьFisher Scientific95-0030-01
Нанокапельный спектрофотометрThermo ScientificND-8000
Люминофорный экранGE Healthcare Медико-биологические науки28-9564-78
Фосфоримиджер TyphoonHealthcare Медико-биологические науки29004080
УФ-сшивающий агентGE Healthcare Медико-биологические науки80-6222-31В качестве альтернативы мембрану можно запекать в духовке, настроенной на 80°С; в течение 1 часа
Буфер предварительной гибридизации/гибридизации NorthernMax;Life TechnologiesAM8677
Штаммы дрожжей с мутациейШтаммы дрожжей могут быть получены из лаборатории или созданы с определенным фоном
GE rpb1-1

Ссылки

  1. Nonet, M., Scafe, C., Sexton, J., Young, R. Eukaryotic RNA polymerase conditional mutant that rapidly ceases mRNA synthesis. Mol. Cell. Biol. 7, 1602-1616 (1987).
  2. Santiago, T. C., Purvis, I. J., Bethany, A. J., Brown, A. J. The relationship between mRNA stability and length in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 14 (21), 8347-8360 (1986).
  3. Jimenez, A., Tipper, D. J., Davies, J. Mode of action of thiolutin, an inhibitor of macromolecular synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Antimicrob Agents Chemother. 3 (6), 729-738 Forthcoming.
  4. Herrick, D., Parker, R., Jacobson, A. Identification and Comparison of stable and unstable mRNAs in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 10 (5), 2269-2284 Forthcoming.
  5. Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. Genome-wide Analysis of mRNA Stability Using Transcription Inhibitors and Microarrays Reveals Postranscriptional Control of Ribosome Biogenesis Factors. Mol Cell Biol. 24 (12), 5534-5547 (2004).
  6. Tani, H., Akimitsu, N. Genome-wide technology for determining RNA stability in mammalian cells. RNA Biology. 9 (10), 1233-1238 (2012).
  7. Pelechano, V., Perez-Ortin, J. E. The transcriptional inhibitor thiolutin blocks mRNA degradation in yeast. Yeast. 25, 85-92 (2008).
  8. Kervestin, S., Jacobson, A. NMD: a multifaceted response to premature translational termination. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 700-712 (2012).
  9. Kolodziej, P. A., Woychik, N., Liao, S. M., Young, R. A. RNA Polymerase II subunit composition, stoichiometry and phosphorylation. Mol Cell Biol. 10 (5), 1270-1275 (1990).
  10. Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. Current Protocols in Molecular Biology. , John Wiley and Sons, Inc.. (1998).
  11. Kebaara, B. W., Nazarenus, T., Taylor, R., Atkin, A. L. Genetic background affects relative nonsense mRNA accumulation in wild-type and upf mutant yeast strains Current Genetics). 43, 171-177 (2003).
  12. Kebaara, B. W., Baker, K. E., Patefield, K. D., Atkin, A. L. Analysis of Nonsense-Mediated mRNA Decay in Saccharomyces cerevisiae. Current Protocols in Cell Biology. 27 (27.3), 27.3.1-27.3.39 (2012).
  13. Hu, W., Coller, J. Methods for measuring mRNA Decay Rate in Saccharomycescerevisiae. Methods in Enzymology. 530, 137-155 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

температурно-чувствительный аллельингибирование транскрипциисеверный блоттингРНК-полимераза IIгель-электрофорезфосфориммиджингизмерение периода полураспада
Измерение мРНК темпы разложения в
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.