Методическая статья

Оценка воздействия многократного воздействия Органотипической 3D бронхов и тканей носа культуры модели для всей сигаретного дыма

11.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52325

⸱

12 февраля 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biological Systems Research, Philip Morris International R&D, Philip Morris Products S.A.

В этой статье

Краткое содержание

Цель этого протокола - подвергнуть человеческие органотипические 3D-модели бронхов и носовой ткани воздействию сигаретного дыма (CS) на границе воздух-жидкость. Затем влияние CS на ткани исследуется с помощью анализа активности цитохрома Р450, измерения биения ресничек и подхода системной биологии.

Аннотация

Сигаретный дым (CS) оказывает значительное влияние на биологию легких и может привести к развитию заболеваний легких, таких как хроническая обструктивная болезнь легких или рак легких. Чтобы понять основные механизмы развития заболевания, важно изучить влияние воздействия КС непосредственно на легочные ткани. Однако этот подход трудно реализовать в эпидемиологических исследованиях, поскольку отбор проб легочной ткани является сложным и инвазивным. В качестве альтернативы, модели тканевых культур могут облегчить оценку воздействия воздействия на легочную ткань. Для этой цели традиционно используются погруженные в воду двухмерные клеточные культуры, такие как культуры нормальных клеток бронхиального эпителия человека (NHBE). Тем не менее, они не могут подвергаться прямому воздействию дыма таким же образом, как это происходит при воздействии in vivo. Недавно разработанные 3D-модели тканевых культур лучше отражают ситуацию in vivo, поскольку их можно культивировать на границе раздела воздух-жидкость (ALI). Их базальные стороны погружены в культуральную среду; в то время как их апикальные стороны подвергаются воздействию воздуха. Более того, органотипические культуры тканей, которые содержат различные типы клеток, лучше представляют физиологию ткани in vivo. В данной работе демонстрируется использование системы воздействия in vitro для воздействия на модели органотипических бронхов и носовой ткани человека воздействию основного КС. Для оценки функционального воздействия КС на ткани измеряли частоту билия цилиаров и активность цитохрома Р450s (CYP) 1A1/1B1. Кроме того, для изучения изменений, вызванных CS на молекулярном уровне, профили экспрессии генов были сгенерированы из тканей после воздействия. Небольшое увеличение активности CYP1A1/1B1 наблюдалось в тканях, подвергшихся воздействию CS, по сравнению с тканями, подвергшимися воздействию воздуха. Подход системной биологии, основанный на сети и транскриптомике, оказался достаточно надежным, чтобы продемонстрировать индуцированные CS изменения метаболизма ксенобиотиков, которые были аналогичны тем, которые наблюдались в бронхиальных и носовых эпителиальных клетках, полученных от курильщиков.

Введение

Легкие подвергаются прямому и постоянному воздействию вдыхаемого воздуха, который может содержать различные токсиканты, такие как загрязняющие вещества и составляющие сигаретного дыма (CS). Изучение воздействия этих токсикантов на дыхательные ткани является наиболее информативным, если это делается таким образом, который напоминает воздействие in vivo. По сравнению с классическими 2D-погруженными культурами клеток (например, нормальными эпителиальными клетками бронхов человека (NHBE)), 3D-модели органотипических тканей лучше повторяют морфологические, физиологические и молекулярные аспекты эпителия дыхательных путей человека in vivo1,2: 3D-модели тканей содержат разнообразие типов клеток, наблюдаемых in vivo, включая дифференцированные эпителиальные клетки, реснитчатые и нереснитчатые клетки, бокаловидные клетки и базальные клетки. Они имеют функциональные плотные соединения и демонстрируют мукоцилиарный фенотип 1-3. Кроме того, культуры могут быть выращены на проницаемой пористой мембране, на границе раздела воздух-жидкость, что позволяет осуществлять прямое воздействие аэрозоля на апикальной стороне (в то время как базолатеральная сторона погружается в питательную среду) 3-5. Дворжак и его коллеги сообщили, что профили экспрессии генов в моделях бронхиальной ткани были аналогичны тем, которые были получены из бронхиальных щупов человека. Кроме того, Матис и его коллеги показали, что реакция этих тканевых моделей на КС была аналогична различиям, наблюдаемым между бронхиальными эпителиальными клетками, полученными от курильщиков, и клетками, полученными от некурящих. Наконец, поскольку модели бронхиальной ткани могут быть культивированы в течение нескольких месяцев 4,5, они потенциально могут быть использованы для изучения эффектов длительного воздействия испытуемых объектов.

Оценка цитотоксичности — это общие параметры, измеряемые после химических повреждений или для оценки токсичности конкретных соединений или смесей. Например, целостность мембраны может быть измерена с помощью люминесцентного анализа, что позволяет измерить дозозависимое цитотоксическое действие на культуру клеток 7. Однако для оценки патофизиологических эффектов соединений при субтоксических концентрациях следует измерять и другие параметры. Например, целостность тканей, определенная с помощью анализа трансэпителиального электрического сопротивления (TEER), обеспечивает функциональность плотных соединений и контролирует разрушение эпителиального слоя 8,9. Частота биения ресничек также позволяет измерить связанные с КС эффекты на дыхательные ткани. Нормальная частота биения ресничек, граничащих с верхними и нижними дыхательными путями, важна для защиты от инфекций дыхательных путей 10. Каждая из реснитчатых столбчатых эпителиальных клеток респираторного эпителия имеет 200-300 ресничек, бьющихся с определенной частотой для устранения инфекционных агентов или вдыхаемых твердых частиц, захваченных в слизи, выделяемой вкраплениями бокаловидных клеток 11. CS содержит химические вещества, которые могут подавлять биение ресничек 12, что приводит к снижению защиты дыхательных путей. Эта работа показывает, что биение ресничек может быть измерено в органотипических моделях тканей. Этот подход позволяет оценить, проявляют ли эпителиальные клетки свою нормальную функцию в органотипической культуре тканей. КС также активирует реакции метаболизма ксенобиотиков в дыхательных путях для метаболизма компонентов табачного дыма 13. Можно измерить активность ферментов метаболизма ксенобиотиков I фазы, CYP1A1 и CYP1B1, тканевых моделей. Кроме того, как сообщалось ранее, глобальная экспрессия генов может быть измерена в органотипических моделях бронхиальной ткани 6,14,15. Для оценки влияния КС на метаболизм ксенобиотиков используется транскриптомные данные и сетевая системная биология.

Здесь подробно описаны методологии, используемые для экспонирования органотипических 3D-моделей бронхиальной и носовой ткани с использованием системы воздействия in vitro, а также для измерения реакции тканей на это воздействие по сравнению с воздействием свежего воздуха (контроль).

Протокол

1. Культура Органотипической тканей Бронхиальная культуры модели

Примечание: Восстановленные модели тканей были приобретены в качестве вставок, которые готовы к использованию. Альтернативно, культура может быть разработана из первичных клеток, как описано, например, Karp и коллегами 16. После получения тканей в стерильной упаковке, беритесь органотипической тканей человека в стерильных условиях.

  1. Добавить 0,7 мл подогретого (37 ° С) среде для анализа в каждую лунку новой стерильной 24-луночного планшета под капотом.
  2. Удалить упаковку из тканей под капотом, и передачи культуры ткани вставки в новое, полученного 24-луночного планшета (описанного в пункте 1.1. Выше).
  3. Поддержание и культуры тканей в инкубаторе при 37 ° C (5% СО 2, 90% влажности).
  4. Замените среду каждые 2 дня.
  5. Во время смены среды, изучить ткани под световым микроскопом, чтобы убедиться, что они они contaminatiна свободный и что нет никакой утечки среды.

2. Дым сигареты (CS) Экспозиция с использованием в пробирке система экспозиции

  1. За три дня до экспериментов по воздействию, промыть апикальной стороне тканевой культуры с 200 мкл культуральной среды.
  2. В день экспозиции, если измерение мерцательной избиения планируется до воздействия, обрабатывать ткани для измерения мерцательная избиения, как описано в разделе 3.
  3. Предварительно прогреть климатическую камеру в пробирке системе замера экспозиции и выращивание базовый модуль до 37 ° C. Заполните выращивание базовый модуль с 17,5 мл среды на каждый ряд.
  4. Удалить тканей из инкубатора и поставить их под капотом, чтобы передать тканевой культуры вставки из культуральной пластины на выращивание базового модуля в пробирке системы экспозиции. Кроме того, крышка выращивание базовый модуль со стеклянной крышкой.
  5. Передача ткани в климатической камере в пробирке противовирусные экспозициим для воздействия на основной CS.
  6. Если в пробирке система экспозиции оснащен микровесах, настройка кристаллическую микровесов Quartz перед запуском экспозиции для измерения в реальном времени осаждения частиц дыма на кристалле кварца с помощью программного обеспечения микробаланса.
    1. Замените кристаллы в микробаланса модулей, подключенных к каждой строке системы разбавления / распределения.
    2. Подключите модуль микробаланса к программному обеспечению микровзвешивания. Установка шкалы измерений к нулю в программном обеспечении.
  7. Защиту ткани в соответствии с экспериментальной процедурой (например., Как показано на рисунке 1)
    Примечание: Перед экспозиции, ссылки на сигареты (3R4F) обусловлены между 7 и 21 дней при контролируемых условиях при 22 ± 1 ° С и относительной влажности 60 ± 3% согласно стандарту ИСО 3402 17.
    1. Создание сигаретного дыма (например., Из 3R4F сигарет), используя 30-портовый карусель курения машINE в соответствии с интенсивным режимом здравоохранения Канады: курят сигареты стандартной длины приклада, т.е. примерно 35 мм в 55 мл слоеного более 2 сек, два раза в минуту и 8 секунд время выпускной насос.
      Примечание: Если необходимо, разбавить основного потока CS так, чтобы доза не слишком токсичными. В результатов, представленных здесь, дым был разбавлен до 16% (об / об).
    2. Используйте 60% влажности-воздух для контрольных образцов (воздух, подвергшихся воздействию).
    3. Expose ткани 6-7 мин (т.е.., 1 сигарета или воздух, подвергшихся воздействию) в в пробирке системы экспозиции
    4. Поместить ткани обратно в инкубатор при температуре 37 ° C (5% CO 2, 90% влажности) в течение 1 ч.
    5. Повторите шаги 2.7.3 и 2.7.4 еще три раза.
  8. В конце эксперимента экспозиции, остановить программное обеспечение микробаланса. Программное обеспечение будет генерировать файл, содержащий все результаты измерений вместе с графическим представлением осаждения частиц.
  9. Возвращение ткани от выращивания бМодуль ASE в культуральную пластину. Поместите тканей обратно в инкубатор при 37 ° C (5% СО 2, 90% влажности) до измерений для различных конечных точек в конкретном после воздействия временных точках.

3. Измерение мерцательной избиении

Примечание: В соответствии с экспериментальной плана (рис 1), запись Мерцательная избиение до экспозиции и непосредственно после облучения.

  1. Удалить тканевой культуры пластины из инкубатора и оставить их под капотом при комнатной температуре в течение 30 мин, чтобы стабилизировать биение ресничек.
  2. Поместите ткани под световым микроскопом, подключенного к CiliaMetrix программного обеспечения.
  3. Запишите фильм и частоту (в Гц) цилиарной избиения. Измерьте частоту раз в 3 сек в течение 1 минуты.
  4. Возвращение ткани обратно в инкубатор при 37 ° C (5% CO 2, 90% влажности).

4. трансэпителиального электрического сопротивления (TEER) Измерение

Примечание: Измерение проводится TEER 3 дней до и 48 ч после воздействия под капотом в стерильных условиях с использованием палочки электрод (STX-2), соединенный с voltohmmeter.

  1. Добавить 200 мкл культуральной среды на апикальной поверхности бронхиальных тканей человека.
  2. Включите машину EVOMX; мыть электрод с 70% -ным раствором этанола.
  3. Промыть электрод с культуральной средой.
  4. Измерьте сопротивление (Ω), вставив электрод в среду на апикальной стороне тканевой культуры, не касаясь ткани.
  5. Повторите шаг 4,4-пять раз, чтобы получить измерения пяти экземплярах.
  6. После измерений, осторожно удалить носитель из апикальной стороне культур тканей с использованием аспиратора.
  7. Возврат культуры тканей в инкубатор при при 37 ° С (5% СО 2, 90% влажности) для культивирования.

5. цитохрома P450 (CYP) 1A1 / 1B1 деятельноти

  1. Перед началом исследования, подготовить люциферина реагента обнаружения путем передачи все содержимое бутылки соответствующего буфера восстанавливающей Янтарной флакон, содержащий реагент для обнаружения люциферина (в соответствии с инструкциями изготовителя). Магазин аликвоты 2 мл при -20 ° С в течение не более 1 месяца.
  2. За время после воздействия 48 ч, инкубировать ткани в течение 48 ч после воздействия CS при 37 ° С.
  3. Теплый обнаружения реагента люциферин до КТ.
  4. Инкубируйте ткани вставки в течение 3 ч или O / N с люциферин-CEE подложки (разбавленного в 1:50) в базальной культуральной среде.
  5. Передача 50 мкл культуральной среды из каждой ткани вставки в 96-луночный белый непрозрачный фотометра пластины при комнатной температуре.
  6. Добавить 50 мкл реагента обнаружения люциферин в каждую лунку, чтобы инициировать реакцию люминесцентный.
  7. Инкубируют планшет при комнатной температуре в течение 20 мин.
  8. Читайте свечение с помощью фотометра.
    Примечание: Длялюминометр, используйте время интегрирования 0.25-1 сек на лунку в качестве ориентира.

6. Экстракция РНК.

  1. Перед сбором 3D органотипической ткани вставки, подготовка 1) коробку с сухим льдом, 2) достаточное количество лопастей (по одному на 3D вставки), 3) холодной PBS без хлорида кальция и магния хлорида, 4) один 25 мл стеклянной пипетки, и 5 ) стерильные стеклянные иглы для аспирации.
    1. Этикетка трубки, наполненные керамических шариков для гомогенизации твердых клеточных образцов и добавить 700 мкл Qiazol.
    2. Включите аспирации машины.
    3. Соберите пластинку с 3D органотипических тканей вставками из инкубатора.
    4. Промыть каждый вкладыш на пластине 3 раза холодным PBS. Между промывок PBS аспирации со стеклянной иглы. После третьей промывки, аспирация с PBS и крышкой, чтобы предотвратить высыхание вставки.
    5. Для каждого вкладыша от пластины, не вырезать вставки мембраны (3D, на которых ткани вставка находится) до Membrане лежит плоско вниз на лезвие.
    6. Передача ткани (вместе со вставкой мембраны) от лезвия к гомогенизации трубки соответствующей маркировкой и заверните крышку на трубе, встряхните его и вихрь его.
    7. Замораживание образца в сухом льду и хранят при -80 ° С или продолжать экстракта РНК.
      Примечание: Перед извлечением РНК, маркировать все трубы и столбцы в соответствии с проектом рандомизации (если применимо). Подготовка всех реагентов в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя и отборе проб от -80 ° C морозильника и разморозить их на лед, пока они не будут полностью разморожены.
  2. Гомогенизация
    1. Измельчить образцы с гомогенизации инструмент на 6000 Гц в течение 45 сек. Повторите, если образцы не должным гомогенизируют и оставить образцы в течение 5 мин при комнатной температуре.
    2. Добавить 140 мкл хлороформа к образцу и вихря на 10-15 сек.
    3. Передача супернатант из гомогенизации трубки к замку Фаза трубки и качаться наthermoshaker в течение 2 мин при 1400 оборотах в минуту и ​​комнатной температуре.
    4. Кроме того инкубировать образцов в течение 2 мин при комнатной температуре и образцы центрифуге при 12000 х г в течение 15 мин при 4 ° С.
  3. РНК осадков, стирка, подвеска и очистки в QIAcube.
    1. Передача верхней водной фазы в новую пробирку 2 мл.
    2. Загрузите все необходимые реагенты в добыче робота в соответствии с протоколом листа производителя, выберите соответствующий протокол, установите объем элюирования (30 мкл) и запустите извлечения робота.
    3. Когда перспективе закончена, снимите ротор адаптеры и держать элюирования трубы сразу же при 4 ° С для последующего анализа или при -80 ° С в течение длительного хранения.
  4. Контроль качества выделенной РНК
    1. Определить количество выделенной РНК с использованием УФ читателя в соответствии с инструкциями изготовителя.
    2. Проверьте качество РНК и целостность РНК с использованием микрофлюидальный-гель на основе лаборатории-на-чипе и УФ читателя, ACCОрдинг с инструкциями производителя.

7. микрочипов Workflow

Примечание: Способ, описанный ниже, фокусируется на способе Affymetrix GeneChip высокая пропускная способность 3'IVT экспресс Kit, который используется для синтеза целевого для гибридизации на экспрессию генов Affymetrix картриджей 3 ', начиная с подготовки к РНК использованием комплекса Жидкостная система обработки (напр.,, пипетки, разбавляя, распределяя, или интеграции).

  1. Подготовка
    1. Случайно образцы, чтобы избежать пакетных эффектов. Количество образцов, обработанных партий от 1 до 96, в том числе один положительный (коммерческий человека Универсальный справочник РНК) и отрицательный (РНКазы воды) контроль за партии.
    2. Начало целевой синтеза с использованием 100 нг общей РНК в 3 мкл РНКазы воды. Для 100 нг общей РНК, используйте 16 ч время инкубации.
  2. РНК Усиление
    1. Подготовка POly-РНК пик в контрольном растворе последовательным разбавлением поли-A РНК складе с поли-A управления Буфер для разведения:
      1. Для разбавления 1, готовят 2 мкл полиА контрольный пакет акций в 36 мкл буфера для разведения.
      2. Для разбавления 2, подготовить 2 мкл разведения 1 в 98 мкл буфера для разведения.
      3. Для разбавления 3 подготовить 4 мкл разведения 2 в 196 мкл буфера для разведения.
      4. Для разбавления 4, подготовить 20 мкл разведения 3 в 180 мкл буфера для разведения.
    2. Развести РНК в РНКазы свободной воды, чтобы получить концентрацию 33,3 нг / мкл.
    3. Добавить 2 мкл контрольного раствора поли к 3 мкл общей РНК образца непосредственно в 96-луночный планшет. Этот шаг выполняется системой наливных.
    4. Подготовка системы подготовки пробы и целевой синтез. Место пластин на робота. Разместить все необходимые реагенты и лабораторное оборудование на палубе. Робот начнет процедуру подготовки appropriatе mastermixes и инкубировать образцов в автоматизированной дистанционным управлением ПЦР блока.
    5. Во-первых Control Контроль качества: контроль амплификации процесса
      1. Если качество является приемлемым АРНА, выполнять этап фрагментации путем добавления к каждому образцу 8 мкл фрагментации 5X буфера (Этот этап выполняется с помощью системы жидкой обработки). В противном случае выполните предыдущий шаг снова, начиная с РНК. Используйте фрагментированный Арна сразу или хранить в неразбавленном и фрагментарный Арна при -20 ° С (или -70 ° С в течение более длительного хранения).
      2. Выполните второй анализ контроля качества, выбирая случайным образом 12 образцов в плите и передача 1 мкл на системы микрофлюидики гель на основе, чтобы проверить эффективность дробления.
  3. Процедура гибридизации
    1. Сканирование чип штрих-кодов и зарегистрировать каждый образец в программном обеспечении производителя в соответствии с инструкциями.
    2. Подготовка гибридизации смеси, аследует для одной реакции и добавить его в 33 мкл фрагментированной и с надписью Арна: 4,2 мкл управления олигонуклеотидов В2 (3 нм), 12,5 мкл 20х эукариотических контролей гибридизации, 25 мкл 100% ДМСО, 125 мкл 2x гибридизации буфера и 50 мкл H 2 O для конечного объема 216,7 мкл
      Примечание: гибридизующиеся, вымыть и проверять положительный и отрицательный контроли перед обработкой образцов.
    3. Предварительное смачивание массив с 200 мкл предварительно гибридизации смеси, содержащихся в комплекте гибридизации мыть и пятен.
    4. Поместите чип в гибридизации печь, установленную на 45 ° С и 60 оборотов в минуту в течение 10 мин.
    5. В то же время, денатурации пластину (содержащий конечный коктейль гибридизации смеси) в блоке ПЦР при 99 ° С в течение 5 мин и 45 ° С в течение 5 мин.
    6. Удалить предварительно гибридизации смесь из массива и заменить его с 200 мкл мишени гибридизации коктейль (одна проба на чип).
    7. Поместите массив в hybridization сушильном шкафу при температуре 45 ° С в течение 16 ч (O / N) со скоростью вращения 60 оборотов в минуту.
  4. Стиральная и окрашивание
    1. Запустите "струйная" в строке меню программного обеспечения. В диалоговом Fluidics окне выберите модуль интереса (1 - 4), затем выберите программу Prime_450 ко всем модулям. Поместите трубку для промывочного буфера А в бутылке (400 мл) и по промывочным буфером B в бутылке (200 мл), а также для MilliQ воды в бутылке (500 мл).
    2. Впоследствии, следуйте инструкциям ЖК-дисплея. Поднимите иглы и поместите 600 мкл пятен коктейль 1 (SAPE Решение Mix) и 600 мкл пятен коктейль 2 (антитела Решение Mix), содержащий микроцентрифужных пробирок на позициях № 1 и № 2, и 900 мкл массива, содержащего буферный раствор с позиции № 3.
    3. После O / N инкубации в духовке, аспирация коктейль с чипа и заполнить микрочипов с 250 мкл промывочного буфера А. Назначьте правильный чип для каждого модуля, выберите протокол FS450-001 и запустить каждый моDule, следуя инструкциям на экране. Этот процесс длится 90 мин.
    4. После того, как ЖК-экран показывает сообщение "Eject картриджа", удалите фишку и проверьте, есть ли пузырьки. Если имеются пузырьки, полностью заполнить массив с массива, содержащего буфер. Применить наклейки на перегородках, чтобы избежать каких-либо утечек в сканер и очистить окно микрочипов до погрузки в сканере.
  5. Сканирование.
    1. Разминка сканера. Загрузите чип в автомате заряжания сканера и начать сканирование.
      Примечание: После ~ 12 мин на чипе, .CEL файл на чипе генерируется.
    2. Проверьте изображение и выровнять сетку (при необходимости) в месте, чтобы определить зонда клетки.
      Примечание: набор данных был представлен на Arrayexpress (Присоединение код = E-MTAB-1721).

8. Системы Сетевые Биология Анализ для оценки воздействия

  1. Обработка данных микрочипов.
    Примечание: Обработка данныхD методы количественной оценки были реализованы с использованием R статистическая среда версию 2.14.
    1. Откройте сеанс R 18 и загрузить AFFY 19, gcrma и affyPLM установленных пакетов, выполнив команды: библиотека (AFFY)> библиотека (gcrma)> Library (affyPLM)
    2. Читайте файлы исходных данных, выполнив команду: data.affybatch <-ReadAffy ("путь к папке, где хранятся CEL файлы")
    3. Вычтите фоне коррекции и квантили Нормальную для генерации значений экспрессии набора зондов с использованием пакета gcrma, выполнив команду: eset.norm <-gcrma (data.affybatch)
  2. Контроль качества.
    1. Создание деградации РНК участки с помощью команды: град <-AffyRNAdeg (data.affybatch)
    2. Выписка коэффициент деградации РНК склоне выполнив команду наклон = град $ склона
    3. Участок коэффициента наклона и определить возможные выбросы.
    4. Создание Nuse и RLE участки, выполнив следующие команды: Pset <-fitPLM (data.affybatch)> УПИ (Pset)> Nuse (Pset).
    5. Укажите, если некоторые из присущи рефлективный, вербальный, генерируемых находятся на периферии: массив считается выброс, если, по крайней мере 2 из КК показателей 3, определенных ниже отклоняются от других массивов:
      - Град $ наклона отличается от средней град $ наклоном
      - Nuse участка: массив считается выброс, если верхняя квартиль падает ниже 0,95 или ниже квартиль выше 1,05, то есть, если boxplot полностью выше 1,05 или полностью ниже 0,95..
      - УПИ участка: массив считается выброс, если медиана распределения РЛЭ больше, чем 0,1 или меньше, чем -0,1.
    6. Если массив определен как выброс, то отказаться и начать заново с шага 8.1.2.
    7. Установите общую линейную модель к данным для конкретных контрастов интереса (то есть., В сравнение "лечение" и "контрольных" условий) формирование первоначального значения P для каждого зонда, установленного на микрочипе, который может быть Furtее настроить с помощью процедуры Benjamini-Höchberg пакета Limma. Выберите probeset на ген держать в качестве представителя гена для дальнейшего анализа, как описано в 20.
      Примечание: блокирующий фактор (пластина экспозиции) от дизайна эксперимента было учтено в модели для обработки данных.
  3. Сеть на основе анализа.
    Примечание: Способ реализован здесь подробно описаны в Мартина и др. (В редакции в BMC биоинформатика).
    1. Для каждого парного сравнения интересов, начать с компьютерной (log2-) раз изменения (лечение по сравнению с контролем) для каждого гена в рамках сети (из шага 8.2).
    2. Вычислить подписанный Лапласа матрицы L сети, определяемой L (I, J) = - знак (я ~ J) W (I, J), если существует ребро веса W (I, J) между узлом я и J, L (I, J) = град (я) является взвешенной степенью я и L (I, J) = 0 еще. Вес без (I, J) равны 1, если я и J находятся в позвоночнике и ш (I, J) = 1 / п, если я является основой узел и J является одним из его н neighbПРС в протоколе слоя.
    3. Вычислить оценки для позвоночника на F = L3-1L2Tx, где L3 является суб-матрица L для магистральных узлов и L2 является суб-матрица L, строки которой соответствуют транскрипционных узлов слоя и колонки к магистральным узлам
    4. Вычислить подписанный Лапласа, Q, сети, определяемой магистральной сети, где все краевые знаки поменялись местами.
    5. Вычислить оценки НПД по NPA = fTQf.
    6. Вычислить доверительный интервал Р-значение край перестановки, позвоночник и р-значение Перестановка уровня транскриптов.
      Примечание: (. Например, биологические вариации между образцами в экспериментальной группе) В дополнение к доверительных интервалов баллов NPA, на долю которых приходится экспериментальной ошибки, статистика компаньон были получены для описания специфики счетом NPA в биологии, описанной в сети. Потому что НПД квадратичная форма складок изменений, ее дисперсия может быть вычислена на основе раз-изменение оценивается Variances. Доверительный интервал впоследствии получены с использованием центральной предельной теоремы. Два теста перестановок были реализованы 21 посредством первых, оценивает, если результаты были специфичны для основного доказательства (то есть., Ген сгиба-изменения) в модели, что приводит к P-значения перестановки (обозначается * O в цифрах, когда P -value <0,05). Во-вторых, оценить, насколько "причинно-эффект" слой сети значительный вклад в амплитуду сети возмущения (обозначается К * в цифрах, когда P-значение <0,05).
    7. Рассмотрим сеть, как влияние лечения, если доверительный интервал не содержит нуля и два перестановок р-значения <0,05.
    8. Вычислить ведущих узлов, которые определены в качестве ключевых узлов в позвоночнике, способствующий до 80% оценки НПД.

Результаты

В результатах, описанных ниже, органотипической ткани являются основными человека эпителиальные клетки, выделенные из здоровых, некурящих, Белый доноры и восстанавливали с помощью фибробластов 15.

3D бронхиальных и модели тканей носа
В пробирке бронхов и носовых органотипических моделей напоминают на клеточном уровне эпителия человек дыхательных путей (Рисунок 2).

Воздействие CS
Органотипической бронхиальных и модели тканей носа может быть неоднократно подвергался основной CS на границе воздух-жидкость. Экспериментальная процедура воздействие дыма для результатов, показанных здесь, изображен на рисунке 1.

Запись мерцательной избиения
Реснички избиение был записан в воздухе, подвергшихся воздействию тканей, как показано на видео. Воздействие CS был связан со снижением частоты мерцательная избиения: чем сильнее пик наблюдается вокруг4 Гц в Шам открытой и до воздействия не наблюдается больше после CS экспозиции (рисунок 3). Это привело к снижению частоты будет сделать реснички избиение менее эффективными, чтобы удалить слизь и инфекционных агентов 22.

Измерение TEER и CYP1A1 / 1B1 деятельности
TEER измеряли 48 ч после последнего воздействия для обеспечения ткани по-прежнему функционирует. CYP1A1 / 1B1 активность также измеряют через 48 ч после окончания воздействия, как показано на рисунке 1. Значения Тир в CS-инфицированными тканями существенно не отличались по сравнению с воздухом на ткани головного мозга, подтверждающие, что нет никаких серьезных цитотоксический эффект дыма при этой концентрации. В 48 ч после воздействия, CYP1A1 / 1B1 активности тканей слегка увеличился, что свидетельствует о незначительном увеличении тканевой защитный механизм следующий экспозиции (рисунок 4).

Джин профили экспрессии и сетевых систем бигии подход к изучению последствий воздействия CS на изменения метаболизма ксенобиотиков
Ткани были собраны через 48 часов после облучения моменты времени. Впоследствии, анализ микрочипов был проведен для генерации профили экспрессии генов в CS- и воздушные, подвергшихся воздействию тканей. Влияние воздействия КС на метаболизма ксенобиотиков была исследована с помощью сетевых систем биологии подход не рискованного из профилей экспрессии генов, и, как сообщалось ранее 15. Использование сетевых систем биологии подход показывает, что воздействие облучения CS на уровне магистральных узлов в ксенобиотиков модели Метаболизм сети были приятно коррелируются между в пробирке и в естественных наборов данных (рис 5). В отличие от этого, на уровне каждого отдельного изменения экспрессии генов, бедные корреляция наблюдается между в пробирке (CS-подвержена против воздушного воздействия), так и в естественных условиях (курильщиков по сравнению с некурящими).

figure-results-1
Рисунок 1. Схема процедура многократного воздействия сотовой станции в органотипических моделей бронхиальной ткани Сокращения:. CYP цитохрома Р450; CS, сигаретный дым; TEER, трансэпителиальная электрическое сопротивление.

figure-results-2
Рисунок 2. Органотипической бронхиальных и носовых эпителиальных модели культуры тканей. Мультфильм иллюстрирующий бронхов (A) и носовой (B) тканевой культуре вставки на границе воздух-жидкость. Модели в пробирке содержится реснитчатые клетки, показанные в апикальной слоя окрашенных клеток гематоксилином и эозином (C бронхиальной, D для назального), как сообщалось ранее 15. Модели культивировали совместно с фибробластами, которые важны для роста и дифференцировки эпителиальных клеток (показано стрелками). Окрашивание дыхательных путей клона маркеров: p63 (E бронхиальной, F для назального) и Muc5AC (G бронхиальной, H для назального) показаны как сообщалось ранее 15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3. Реснички Избиение частотой. Реснички частота биения (CBF) измерялось в воздухе подвергается и в культуре до и после воздействия. Снижение CBF был замечен после воздействия CS (представительные результаты двух вставки показаны как реплики с 1 (R1) и повторить 2 (R2)).

объявления / 52325 / 52325fig4.jpg "/>
Рисунок 4. Измерение CYP1A1 / CYP1B1 активности и TEER. Левые дисплеи показывают CYP1A1 / CYP1B1 активность в бронхиальных (А) и носовые (B) модели ткани. Правые панели указывают на измерение Тир в бронхиальном (C) и носовые (D) тканей моделей. Средства ± SD показано на рисунке. Сокращения: CS, сигаретный дым; CYP цитохрома Р450; TEER, трансэпителиальная электрическое сопротивление; РОС, относительная единица luminescense.

figure-results-4
Рисунок 5. Системы Сетевые биологии подход для оценки последствий воздействия CS в контексте метаболизма ксенобиотиков. Изменения генных выражений уровнях были использованы для вычисления активации магистральной узла сетевой модели метаболизма ксенобиотиков (A) STRONG> как сообщалось в предыдущей публикации 15. Рисунок справа иллюстрирует концепцию количественного определения системообразующих узлов, также известный как "дифференциальное значение магистральной сети", используя подход, NPA. Синие овалы представляют активность магистральных узлов (то есть., Функциональный слой) и зеленые шарики представляют экспрессию генов (т.е.., Транскрипционный слой). Воздействие облучения CS в органотипических бронхиальной ткани (in vitro, CS, подвергшихся воздействию против воздушного воздействия) в 48 ч после контакта были по сравнению с теми курения на человека эпителия бронхов, собранной при бронхоскопии и назального эпителия по burshing нижней носовой раковины (GSE16008 ) (в живом организме, курильщиков против некурящих) (В). Вставки, корреляция экспрессии генов меняется между в пробирке и в естественных данных. Сокращения: CS, сигаретный дым; NPA, амплитуда сеть возмущение.ove.com/files/ftp_upload/52325/52325fig5large.jpg "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Здесь мы показали применимость человека органотипической бронхов и моделей тканей носа для оценки влияния многократного воздействия CS. В качестве альтернативы испытаний на животных, ряд систем воздействия были разработаны для токсикологических оценок аэрозольного воздействия в пробирке (например., Vitrocell, Cultex, Алиса и т.д.). Эти модули экспозиции, также могут быть использованы для токсикологической оценки в воздухе загрязняющих веществ, переносимых по воздуху частиц, наночастицы и т.д. В этом исследовании мы использовали систему Vitrocell, которые могут вместить до 48 различных образцов одновременно, что позволяет более масштабных экспериментов и низкой вариабельностью между лечения. Для каждого аэрозольного воздействия в пробирке, риск заражения культуры тканей остается основным фактором риска которого смягчение требует осторожного обращения из тканевых культур по всей экспериментов.

Измерение осаждения частиц в реальном времени на микровесов в течение еXposure эксперимент позволяет отслеживать, что дозы CS, полученные от системы экспозиции, в соответствии с ожиданиями. Для обеспечения точности измеряемого осаждения частиц, наладка онлайн измерения правильно, прежде чем экспозиция critial, например, создание шкалы 0. Кроме того, из-за разницы между районами микровесов (см 2) и тканевой культуры вставка (0,33 см 2), мы доводили окончательный расчет в области культуры вставки: только 33% от осаждения на микровесов отразить фактический осаждения в культуральной пластины.

Измерение TEER выяснить функциональность барьера плотно спая и оценить нарушения эпителиального слоя относительно простая процедура в реализации, что мы сообщили здесь. Однако, поскольку модели бронхов и тканей носа содержат слизь производства перемежаются бокаловидных клеток, верхушечные стиральная должно быть выполнено до тез TEERрений. Апикальная стиральная имеет решающее значение, так как присутствие слизи слоем и изменчивость ее толщина может смещения при измерении TEER, interferring с воздействием облучения CS. Это понятие в согласии с тем, что было сообщено Hilgendorf и коллег, в которых проницаемость Caco-2 клеток, пострадавших от совместного культивирования с слизи-линии по производству кубок клеток НТ29 23. Слизь должна быть смыты перед измерением Тир, потому что верхушечный стиральная прямо перед воздействия могут вмешиваться в ответах ткани в CS. Таким образом, измерение выполняется за три дня до облучения, а не непосредственно перед воздействием.

Мы показали, что CYP1A1 / CYP1B1 деятельность может быть измерена с органотипических моделей культуры после воздействия CS, хотя активность лишь незначительно увеличилась на CS. Это слабый сигнал может быть усилен путем более длительного инкубации CYP1A1 / 1В1 подложки (т.е.., Люциферин-CEE), например, для24 ч (данные не показаны). Одним из ограничений при измерении активности CYP в данной работе, является отсутствие нормализации до уровня CYP белка или к количеству клеток, которые могут быть приняты во внимание для будущих исследований, чтобы гарантировать, что изменения в активности фермента не влияют по изменению либо уровне белка или количества клеток.

Мы сообщили, что воздействие CS подавляется цилиарной избиения как в носовой и моделей бронхиальной ткани. Аналогичные наблюдения были сделаны в различных млекопитающих и не млекопитающих моделей 12. Для цилиарного бить измерение, гарантируя, что ткани обрабатываются и обрабатывают таким же образом, имеет решающее значение, например, если среда замена осуществляется, он должен применяться для всех образцов. Sutto и коллеги сообщили, что рН влияет цилиарной млекопитающих, победив частоту 24. Таким образом, при сравнении бить частот между клетками, обработанными различными compunds / смесей, рНРегулировка должна быть рассмотрены, чтобы минимизировать вариабельность измерения цилиарного биений. Кроме того, температура, при которой проводится измерение также имеет важное значение, поскольку частота биения цилиарной падает с понижением температуры. Чтобы свести к минимуму колебания, обусловленные этими изменениями, этап верхом инкубатора, оборудованные с температурой, CO 2, и контроля влажности была использована в данном исследовании. Несмотря на это, мы обнаружили, что мерцательная избиение частоты в бронхиальных тканей после воздействия CS были сильно варьирует (т.е.., Увеличение в одном вставки и уменьшить в другом вставки), предполагая, что мерцательная избиение сильно возмущена сразу после воздействия. В отличие от этого, мы наблюдали отсутствие измеримых частот цилиарного бьется в носовой ткани после воздействия CS, предполагая, что реакция носовой ткани является более чувствительным и последовательным. Это согласуется с предыдущей публикации, показывающие, что носовая ткань имеет меньшую пропускную способность, детоксикации, какпо сравнению с 25 бронхов.

Наконец, мы показали, что экспрессия генов профилирования из органотипической бронхов и моделей носовых тканей подвергаются CS может продемонстрировать влияние СС на метаболизма ксенобиотиков. Интересно, что наблюдалось изменение в метаболизме ксенобиотиков в органотипической бронхов и носовых в моделях пробирке воздействию CS напоминают, что в ситуации, в естественных условиях у курильщиков, как более подробно описано в предыдущей публикации 15. Для анализа экспрессии генов с использованием роботизированного делает возможным анализ высокой пропускной. Кроме того, автоматическая роботизированная обработка дополнительно повышает согласованность и точность результатов экспрессии генов. Тем не менее, быстрый сбор образцов ткани была критической, чтобы избежать деградации РНК в ходе экстракции РНК. Обработка РНК и транскриптомных подходы, описанные здесь, могут также быть применены к образцов ткани в естественных условиях.

Раскрытие информации

Это исследование было профинансировано Philip Morris International.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Мориса Смита и Марья Talikka для их рассмотрения рукописи.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
слизистая оболочка - фибробласты человека-бронхи,эпителикс, Sá rl, Женева, Швейцарияhttp://www.epithelix.com/content/view/122/19/lang,en/
MucilAir Culture MediumEpithelix Sá rl, Женева, Швейцарияhttp://www.epithelix.com/content/view/84/16/lang,en/
VITROCELLVITROCELL systems GmbH, Вальдкирх, Германияhttp://www.vitrocell.com/index.php?Nav_Nummer=2&R=
3R4F эталонная сигаретаУниверситет Кентуккиhttp://www2.ca.uky.edu/refcig/
30-портовая карусельная курительная машина SM2000Philip Morris, Int.
Фотоаппарат CiliaMetrix и программное обеспечениеLa Haute & Eacute; cole de Gestion (HESGE), Женева, Switzlerland
Leica DMIL microscope Leica, Хеербругг, Швейцария
Светодиодный источник светаTitan Tool Supplies, Буффало, Нью-Йорк
Электрод для палочек для еды STX-2World Precision Instrumentshttp://www.wpiinc.com/products/physiology/stx2-chopstick-electrode-set-for-evom2/
Эпителиальный вольтометр EVOMXTM World Precision Instrumentshttp://www.wpiinc.com/products/physiology/evom2-evom2-epithelial-voltohmmeter-for-teer/
Реагент для обнаружения люциферина 
MagNA Lyser Instrument Рошhttp://www.roche.com/products/product-details.htm?region=us&type=product&id=66
хлороформ Сигма-Олдричhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion=
QIAcube Qiagen9001882
NanoDropThermo Scientifichttp://www.nanodrop.com/
Биоанализатор Agilent 2100 Agilenthttp://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106
Affymetrix GeneChip Высокая производительность 3' Набор IVT ExpressAffymetrixhttp://www.affymetrix.com/catalog/prod370001/AFFY/High-Throughput-(HT)-Whole-Transcript-(WT)-Kit
Scanner 3000 7G Аффиметрическийhttp://www.affymetrix.com/catalog/131503/AFFY/Scanner-3000-7G

Ссылки

  1. Pezzulo, A. A., et al. The air-liquid interface and use of primary cell cultures are important to recapitulate the transcriptional profile of in vivo airway epithelia. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiolog. 300, L25-L31 (2011).
  2. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature reviews Molecular cell biolog. 8, 839-845 (2007).
  3. Dvorak, A., Tilley, A. E., Shaykhiev, R., Wang, R., Crystal, R. G. Do airway epithelium air–liquid cultures represent the in vivo airway epithelium transcriptome. American journal of respiratory cell and molecular biolog. 44, 465(2011).
  4. Wiszniewski, L., et al. Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biolog. 34, 39-48 (2006).
  5. Balharry, D., Sexton, K., BéruBé, K. A. An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane. Toxicolog. 244, 66-76 (2008).
  6. Mathis, C., et al. Human bronchial epithelial cells exposed in vitro to cigarette smoke at the air-liquid interface resemble bronchial epithelium from human smokers. Am J Physiol Lung Cell Mol Physio. 304, L489-L503 (2013).
  7. Cho, M. -H., et al. A bioluminescent cytotoxicity assay for assessment of membrane integrity using a proteolytic biomarker. Toxicology in Vitr. 22, 1099-1106 (2008).
  8. Stewart, C. E., Torr, E. E., Mohd Jamili, N. H., Bosquillon, C., Sayers, I. Evaluation of Differentiated Human Bronchial Epithelial Cell Culture Systems for Asthma Research. Journal of Allerg. 2012, 11(2012).
  9. Blume, L. F., Denker, M., Gieseler, F., Kunze, T. Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability. Pharmazi. , 19-24 (2010).
  10. Chhin, B., et al. Ciliary beating recovery in deficient human airway epithelial cells after lentivirus ex vivo gene therapy. PLoS genetic. 5, e1000422(2009).
  11. Jiao, J., Meng, N., Wang, H., Zhang, L. Comparison of human nasal epithelial cells grown as explant outgrowth cultures or dissociated tissue cultures in vitro. Front Me. 7, 486-491 (2013).
  12. Talbot, P. In vitro assessment of reproductive toxicity of tobacco smoke and its constituents. Birth defects research. Part C, Embryo today : review. 84, 61-72 (2008).
  13. Port, J. L., et al. Tobacco smoke induces CYP1B1 in the aerodigestive tract. Carcinogenesi. 25, 2275-2281 (2004).
  14. Hoeng, J., et al. A network-based approach to quantifying the impact of biologically active substances. Drug Discov Toda. 17, 413-418 (2012).
  15. Iskandar, A. R., et al. Systems approaches evaluating the perturbation of xenobiotic metabolism in response to cigarette smoke exposure in nasal and bronchial tissues. Biomed Res In. 2013, 512086(2013).
  16. Karp, P. H., et al. An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures. Methods in molecular biolog. 188, 115-137 (2002).
  17. ISO 3402: Tobacco and tobacco products -- Atmosphere for conditioning and testing. , International Organization for Standardization. (1999).
  18. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , The R Core Team. (2011).
  19. Gautier, L., Moller, M., Friis-Hansen, L., Knudsen, S. Alternative mapping of probes to genes for Affymetrix chips. BMC Bioinformatic. 5, 111(2004).
  20. Hermida, L., et al. Confero: an integrated contrast data and gene set platform for computational analysis and biological interpretation of omics data. BMC genomic. 14, 514(2013).
  21. Thomson, T. M., et al. Quantitative assessment of biological impact using transcriptomic data and mechanistic network models. Toxicology and applied pharmacolog. 272, 863-878 (2013).
  22. Teff, Z., Priel, Z., Gheber, L. A. The forces applied by cilia depend linearly on their frequency due to constant geometry of the effective stroke. Biophysical journa. 94, 298-305 (2008).
  23. Hilgendorf, C., et al. Caco-2 versus Caco-2/HT29-MTX co-cultured cell lines: permeabilities via diffusion, inside- and outside-directed carrier-mediated transport. J Pharm Sc. 89, 63-75 (2000).
  24. Sutto, Z., Conner, G. E., Salathe, M. Regulation of human airway ciliary beat frequency by intracellular pH. The Journal of physiolog. 560, 519-532 (2004).
  25. Zhang, X., et al. Similarities and differences between smoking-related gene expression in nasal and bronchial epithelium. Physiological genomic. 41, 1-8 (2010).

Перепечатки и разрешения

Теги

Органотипическое 3D-культивирование тканейграница раздела воздух-жидкостьвоздействие сигаретного дымачастота биения ресницактивность цитохрома P450технология микрочиповсетевая системная биологиябронхиальные и назальные моделисистема воздействия in vitro
Оценка воздействия многократного воздействия Органотипической 3D бронхов и тканей носа культуры модели для всей сигаретного дыма
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.