Методическая статья

Человек плюрипотентных стволовых клеток на основе Экспериментальная токсичность Анализы для химической безопасности Скрининг и системной биологии генерации данных

DOI:

10.3791/52333

⸱

17 июня 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Physiology and Pathophysiology, Institute of Neurophysiology, University of Cologne, 2Department of Biology, University of Konstanz, 3Department of Statistics, Technical University of Dortmund, 4Leibniz Research Centre for Working Environment and Human Factors, Technical University of Dortmund

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протоколы описывают два в пробирке тест-систем развития токсичности (УКК и UKN1) на основе эмбриональных стволовых клеток человека и транскриптом исследований. Тестовые системы прогнозирования с развитием токсичности человека, и может способствовать сокращению исследования на животных, затрат и времени, необходимого для тестирования химической безопасности.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эффективные протоколы дифференцировать человека плюрипотентных стволовых клеток в различных тканях в сочетании с -omics технологии открыли новые горизонты для экстракорпорального токсичности тестирования в потенциальных лекарственных препаратов. Чтобы обеспечить прочную научную основу для таких анализов, это будет иметь важное значение для получения количественной информации о времени ходе развития и на основных регуляторных механизмов по системной биологии подходов. Два теста были поэтому настроены здесь этих требований. В тестовой системе УКК, человеческие эмбриональные стволовые клетки (чЭСК) (или другие плюрипотентные клетки) оставляют самопроизвольно дифференцировать в течение 14 дней в эмбриональных телец, чтобы поколение клеток всех трех зародышевых листков. Эта система повторяет основные этапы раннего эмбрионального развития человека, и он может предсказать человеческое конкретных раннего эмбрионального токсичность / тератогенность, если клетки подвергаются воздействию химических веществ во время дифференцировки. Тест-система UKN1 основана на дифференциации ЭСК в populatион нейроэктодермального предшественников (НЭП) клетки в течение 6 дней. Эта система повторяет раннюю развития нервной и прогнозирует раннего развития нейротоксичности и эпигенетические изменения, запускаемые химическими веществами. Обе системы, в сочетании с транскриптом микрочипов исследований, подходят для идентификации биомаркеров токсичности. Кроме того, они могут быть использованы в комбинации для генерации входных данных для анализа системной биологии. Эти тест-системы имеют преимущества перед традиционными токсикологических исследований, требующих больших объемов животных. Тестовые системы могут способствовать снижению затрат на разработку лекарств и оценки химической безопасности. Их сочетание проливает свет на особенности соединений, которые могут повлиять на развитие нервной системы в частности.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Способность человеческих эмбриональных стволовых клеток (чЭСК), чтобы дифференцироваться в различные типы клеток открыл новую эру тестирования в пробирке токсичность 1, моделирования болезни и регенеративной медицины 2. Стволовые клетки наделены способностью к самовоспроизведению, чтобы сохранить их плюрипотентных состояние и дифференцироваться в специализированные клетки 3,4. Свойства чЭСК (способностью дифференцироваться во все основные типы клеток) находятся также в других человеческих плюрипотентных стволовых клеток, таких как человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) или клеток, полученных с помощью ядерного переноса 5. Например, много различных линий чЭСК были дифференцированы в нейроны 6, 7 клеток почек, клеток нервного гребня 8, 9-12 кардиомиоцитов, или гепатоцитов, как клетки 13,14. Кроме того, чЭСК могут спонтанно дифференцироваться в клетки всех трех зародышевых листков 15-18 в эмбриональных телец (EBS) 19,20. ЕАрли эмбриональное развитие регулируется с помощью дифференциальной экспрессии различных генов, связанных с различными зародышевых листков, которые были захвачены на уровне мРНК в транскриптомики использованием микрочипов технологии 15. Эти усилия привели к созданию органов конкретных токсикологических моделей, основанных на чЭСК / hiPSC и анализа транскриптомика (для обзора см 21,22). Эти модели имеют преимущества по сравнению с традиционным использованием лабораторных животных для токсикологических исследований, как доклинических исследований с использованием лабораторных животных не всегда прогнозирования человеческой безопасности. Препарат индуцированной токсичности, возникающие у пациентов часто связаны с метаболическими или сигнальных процессов, отличающихся между людьми и экспериментальных животных. Разница виды помешала надежное раннее обнаружение развития токсичности в организме человека, и, например, препаратов, таких как талидомид 23,24 и 25,26 диэтилстильбэстрола были изъяты с рынка из-за тератогенного. ТалиDomide не проявил никакого токсического воздействия на развитие крыс или мышей. Окружающей среды химических веществ, таких как метил ртути привело к 27 пренатального развития токсичности по отношению к нервной системы у различных видов, но человека проявления было трудно смоделировать на животных. Для решения этой проблемы вопросов видовой, ученые, работающие в различных проектах на основе стволовых клеток, как ReProTect, ESNATS, детектив и т.д. занимаются развитием различных моделей для эмбрионального токсичности, нейротоксичности, кардиотоксичности, гепатотоксичность и нефротоксичность, используя человеческие токсикантов, подозреваемых в влиять на людей. В соответствии с Европейской консорциум проекта «Эмбриональные стволовые клетки на основе романа альтернативной тестирования стратегий (ESNATS)" пять тест-системы были созданы. Одно испытание системы так называемый УКК (U niversitäts к linikum К OLN) Тест-система частично захватывает раннего эмбрионального развития человека. В этом System человеческие эмбриональные клетки H9 дифференцированы в трех зародышевых листков (эктодермы, энтодермы и мезодермы) 15 и зародыш слой конкретные подписи были захваченных транскриптомики профиль с помощью микрочипов платформу Affymetrix. Различные токсиканты развития как талидомид 28, вальпроевой кислотой, метилртути 16,17, или цитозинарабинозидом 15 были протестированы в этой системе, и ядовитых конкретных генов подписи были получены. Во втором тестовой системе, так называемый UKN1 (U niversity из К onsta п г) тест-системы 1, клетки H9 дифференцированы в клетки-предшественники нейроэктодермальная (NEP) в течение 6 дней. Это свидетельствует высокий уровень экспрессии нейронных маркеров генов, таких как Pax6 и Otx2. Во дифференциации в течение 6 дней, НЭП клетки были подвержены развития нервно-токсикантов, таких как VPA, метилртути. Токсикант конкретных де-регулируется профили транскриптомика были obtaiопределяется как хорошо с помощью микрочипов платформу Affymetrix 16,29.

Новое видение токсикологии 21-го века предусматривает, что тест-системы не только дать фенотипические описания как гистопатологии в естественных условиях, или изменения транскриптом в конце долгосрочных ядовитых инкубации. Это предполагает, что, скорее анализы обеспечивают механистической информации 3, и что эта информация может быть отображена в так называемые неблагоприятные исходы пути (АОП), которые обеспечивают научное обоснование для опасных последствий 30. Для обеспечения такой информации, тест-системы, применяемые должны быть высоко контроль качества 31, как, например, документально надежных стандартных операционных процедур. Кроме того, время-зависимые изменения должны быть отображены с высоким разрешением. Это требует тестирования систем с синхронизированными изменений 32. Тестовые системы UKN1 и УКК, описанные здесь, были оптимизированы для этих требований.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Следующий протокол был выполнен с помощью линии эмбриональных стволовых клеток человеческого (чЭСК) H9. Эта клеточная линия была постоянно культивируют на митотически инактивированной мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ) в чЭСК культуры среде с оФРФ, а затем культивируемых в среде стволовых клеток на 6 см чашки Петри с покрытием базальной мембраны матрице, такой как матригеле, чтобы избавиться от MEFs. В H9 клетки> 80% сливающихся пластин были использованы для дальнейшего прохождения. H9 клетки, культивируемые на матричных пластин базальной мембраны были использованы для формирования ЭТ. Все процедуры, указанные в следующей протокола были выполнены с использованием стандартных методов асептики и передовой практики культивирования клеток.

Часть 1. Проверка системы УКК

1. человеческих эмбриональных стволовых клеток Культивирование

  1. Расщепление и обслуживание H9 на фидерных клеток
    1. Пипетка 2 мл 0,1% желатина в каждую 6 см планшета и инкубируют в течение 30 мин в клеточной культуре incubATOR (37 ° С и 5% СО 2). Аспирируйте раствор желатина стерильной пипетки Пастера.
    2. Добавить 2 мл MEF среды, содержащей 0,1 × 10 6 клеток / MEF мл в двух покрытые желатином пластин и инкубируют их в инкубаторе для клеточных культур (37 ° С и 5% CO 2) O / N.
    3. На следующий день, удалите клетки H9 флакон из бака хранения жидкости азота с помощью щипцов и оттаивать флакон в водяную баню при 37 °, используя длинные щипцы.
    4. Удалить флакон из водяной бане, бане с 70% этанола, сухой воздух в шкафу биобезопасности в течение 15 до 30 сек, и передавать ячейки 15 мл трубки сокола.
    5. Добавить 9 мл культуральной среды H9 медленно на внутренней стенке и центрифугировать клетки при 200 х г в течение 5 мин.
    6. Аспирируйте супернатант и повторно приостанавливать клеток в 6 мл культуральной среде, содержащей ингибитор ROCK (10 мкм, Y27632) и осторожно пипеткой перемешать. Аспирируйте MEF среды от 6 см пластины и добавить суспензию 3 мл клеток в каждой чашке. Изменение среды на Dай 3, а затем каждый день. Субкультура> 80% сливной пластины клетки с раздельным соотношении 1: 3.
      Примечание: Обычно от 5 до 7 дней пластина становится вырожденная. Кормушки используются получаются из CF1 мышей эмбриона и инактивируется под воздействием γ-излучения.
  2. H9 культивирование клеток на пластинах базальной мембраны матрица с покрытием
    1. Оттепель среднего стволовых клеток (5x) добавка при комнатной температуре и добавить 100 мл в 400 мл базальной среды в области биобезопасности кабинета.
    2. Оттепель базальной мембраны матрица на льду. Добавить предложенный объем базальной мембраны матрицы (см сертификате анализа для каждой партии) в 24 мл охлажденного DMEM / F-12 базальной среде в течение двенадцати 6 см пластинах. Смешайте с помощью пипетки вверх и вниз.
    3. Добавить 2 мл в каждом 6 см пластины. Хранить пластину при КТ в течение 1 ч. Удалить среду и добавьте 2 мл стволовых клеток среды.
    4. Возьмите четыре сливной Н9 пластины на MEFs. Удалить дифференцированные колонии с 1 мл пипетки под стереомикроскопа хранится в шкафу биобезопасности.
    5. Придыхательныйсредних и мыть клетки с 4 мл PBS и добавьте 2 клеток среду в каждой чашке мл стволовых клеток. Вырезать недифференцированных колоний с 26 G иглой в от 6 до 9 штук в каждой.
    6. Осторожно собрать клетки в 50 мл трубки сокола. Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин.
    7. Аспирата супернатант и повторно приостанавливать в 12 мл клеточной среде стволовые. Граф сгустки, поставив 20 мкл на стекле под микроскопом и регулировки громкости на 150 сгустки на мл. Добавить 2 мл суспензии в каждом 6 см пластины.
    8. Перемещение пластин назад и вперед и из стороны в сторону движения для равномерного распределения комок и инкубировать пластин в культуре клеток инкубатора (37 ° С и 5% СО 2).
    9. Удалить дифференцированных колонии и дать сменой среды каждый дополнительный день.

2. эмбриональных телец (ЭТ) Формирование

Выполните все процедуры, упомянутые ниже, в асептических меры предосторожности и биобезопасности кабинета.

  1. День 0 & #8212; Покрытие из клеток Н9 на нижних пластин V
    1. Подготовьте блок-сополимера 5%, такой как Pluronic F 127 в PBS и фильтруют через вакуум-приводом системы фильтрации с использованием 0,22 мкм стерильный фильтр.
    2. Шерсть В нижней 96-луночные планшеты с 40 мкл 5% блок-сополимера на лунку и инкубируют при комнатной температуре в течение 45 мин.
    3. Снимите сливной базальной мембраны матричные пластины с H9 клеток из инкубатора и удалить дифференцированные колонии с 1 мл пипетки в стереомикроскопом в области биобезопасности кабинета.
    4. Аспирируйте среду и промыть клетки с 4 мл PBS. Добавить 2 мл случайным дифференциация среднего (Н9 культуральной среде без оФРФ, РД среда) в каждой пластине. Использование проход инструмента и сократить H9 клеточных колоний в сгустки однородного размера и формы, наблюдая при стереомикроскопа в биозащитой а затем аккуратно очистить с клеточным скребком.
    5. Сбор сгустки в 50 мл трубки сокола и центрифуге при 200 мкг в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант и вновь приостановить CELл в РД среды, чтобы получить 1000 глыбы на мл.
    6. Аспирируйте блок-сополимер с V нижней пластин. Налейте сгустки в стерильной квадратной пластины и с помощью многоканальной пипетки добавить 100 мкл суспензии в каждую лунку V нижней пластине.
    7. Для силового агрегации комков, центрифуги В нижние пластины при 4 ° С в течение 4 мин при 400 х г. Планшеты инкубируют в культуре клеток инкубатора (37 ° С и 5% CO 2) в течение четырех дней.
  2. День 4 - Коллекция ЭТ
    1. Сбор ЭТ в стерильной квадратной пластины из донных плит V с использованием многоканальной пипетки и широкие отверстия 200 мкл советы.
    2. Сбор ЭТ из стерильных квадратной пластины в 15 мл трубки сокола с 10 мл стерильной серологических пипетки. Разрешить ЭТ поселиться в течение 2 мин. Аспирируйте супернатант и мыть ЭТ с 5 мл PBS.
    3. Разрешить ЭТ поселиться в течение 2 мин и аспирации супернатант. Повторное приостановить ЭТ в 5 мл среды РД.
    4. Внесите из 10 мл РД среднего 10 смбактериологические пластины. Передача ЭТ в 10 см бактериологических пластин.
    5. Инкубируйте бактериологических пластины на горизонтальном шейкере (50 возвратно-поступательное движение / мин) хранятся в инкубаторе для клеточных культур (37 ° С и 5% CO 2) в течение требуемого периода времени. Дайте среднего изменения (15 мл РД средний) каждый дополнительный день.
      Примечание: Бережное обращение требуется, а культивирование ЭСК. Размер ЭТ меняется на день 4. Выберите единые ЭТ размер (± 20%), наблюдая при стереомикроскопом для дальнейшего эксперимента. Примерно 50% ЭТ, образованные с помощью этого метода имеют однородными по размеру. Перевод ЭТ на результатах шейкер в едином форме.

3. цитотоксичности для IC 10 Определение

  1. Передача ЭТ на нижних пластин оптических
    1. Разморозить 0,1% желатин на водяной бане при 37 ° С в течение 15 мин и нижней пластин покрытия оптических с 50 мкл 0,1% желатина на лунку помощью многоканальной пипетки. Инкубируйте пластин при комнатной температуре в течение45 мин. После инкубации аспирации желатин из нижних пластин оптических.
    2. Выньте ЭТ, собранных на 4 дня в 10 см бактериологического пластины, содержащие среду RD.
    3. Держите нижнюю пластины оптические в наклонном положении в области биобезопасности кабинета. Передача двух одинакового размера ЭТ в 100 мкл среды РД на лунку в оптическом нижней 96-луночного планшета, наблюдая под стереомикроскопа. Держите 12-е колонки пуст.
    4. Планшеты инкубируют в инкубаторе для клеточных культур (37 ° С и 5% CO 2) в течение 24 ч.
  2. Воздействием наркотиков из 5 день 14 день
    1. Взвесьте испытуемое соединение и сделать высокую концентрацию в известном растворителе.
    2. Провести полулогарифмических разбавлени тестируемого соединения последовательно до 8 разведений в растворителе, содержащем пронумерованные пробирки Фалкон с Н, держать трубку не. Я, как контроль транспортного средства, Tube Нет. J в качестве отрицательного контроля (РД) и среднего трубы не. К положительным (этанол 70%) контроль.
    3. Разморозить RD среды в водяной бане при 37° C в течение 15 мин. Выньте 5 мл RD среду каждый в 11 стерильных сокола труб помеченных от 1 до 11.
    4. Передача 5 мкл раствора из трубки от А до трубки K в к трубе 1 до 11 соответственно и вихрь трубы. Выньте оптический нижнюю пластину из инкубатора и осторожно снимите СМИ с использованием многоканальной пипетки.
    5. Добавить 200 мкл среды из трубки числа от 1 до 11 в соответствующих колонках оптического нижней пластине. Дайте смены среды / препарата через день.
      Примечание: Для половиной логарифмические разведения принять 6,48 мкл растворителя в 7 труб помеченных от 2 до 8. С самой концентрации труба № 1 передачи 3 мкл в пробирку №2, вихря и последовательной передачи 3 мкл к следующему трубки. Держите трубку № 9 для контроля транспортного средства и трубки №10 по отрицательного контроля. Труба No.11 70% этанола.
  3. День 14: ресазурин экспозиции и флуоресценции Измерение
    1. Оттепели РД среднего водяной бане при 37 ° С в течение 15 мин. Выполните все процедуры mentioп ниже в отсутствие света в шкафу биобезопасности.
    2. Возьмите 10 мл RD среду в 15 мл трубки (A) и добавить Рекомендуемый объем резазурин реагента и перемешать с помощью пипетки. Выньте оптический нижнюю пластину из инкубатора и тщательно удалить все средние с многоканальной пипетки.
    3. Добавить 100 мкл среды из трубы А в каждую лунку. Инкубируйте планшет в культуре клеток инкубатора (37 ° C и 5% CO 2) в течение 90 мин.
    4. Измерьте с помощью спектрофотометра флуоресценции (560 Экс / 590 Эм).
  4. СК определение 10 стоимость
    1. Импорт значений в графе площадки призму после вычитания пустые значения. Набор оси Х в дозе и оси у как флюоресцентный единиц.
    2. Нормализовать значения, чтобы получить процент на оси у и преобразования значения (ось х, как логарифмической шкале). Рассчитать IC 50 значение с помощью реакции сигмоидальное дозы параметр (переменная наклона). Рассчитать войти IC 10 значений, используя следующиеУравнение:
      F = 10 LogEc 50 = logECF - (1 / HillSlope) * журнала (F / (100-F))
      Y = Низ + (верх-низ) / (1 ​​+ 10 ^ ((LogEc 50 -X) * HillSlope))
    3. Определить ИК 10 значений должны быть приняты для дальнейших исследований.

4. биомаркеров исследование, основанное на микрочипов

  1. День 0 до 5-й день:
    1. Эмбриоидов тело и трансфер в 10 см бактериологические плиты - выполните следующие действия, указанные в пункте 2 для формирования эмбриоидном тела.
      Примечание: Используйте три биологические повторяет для каждого исследования. Разделите каждый биологический репликации на две части - Медикаментозное лечение в ИК 10 концентрации и контроля над автомобилем. Подготовка концентрация лекарственного 10000 раз выше концентрации IC 10 в транспортном средстве и от этого добавить 10 мкл до 100 мл РД среде с клеточными сгустки Н9 в 50 мл пробирку Эппендорф хорошо перемешать и семян его на V нижней пластин. Выполните ту же процедуру для контрольной группой.
  2. Для воздействия наркотиков на 5-й день до 14, собрать EB's и передавать их в 10 см бактериологического пластин на 4-й день, как за шагов, указанных в пункте 2. Передача пластины на горизонтальном шейкере (возвратно-поступательное движение 50 / мин) в клеточной культуры инкубатор (37 ° С и 5% СО 2) в течение 14 дней. Дайте среды меняются каждый дополнительный день.
  3. Для сбора проб, на 14 день, собирать ЭТ от 10 см пластин в 15 мл трубки сокола стерильной пипеткой серологического. Разрешить ЭТ поселиться в течение 2 мин. Аспирируйте супернатант и мыть ЭТ с 5 мл PBS. Разрешить ЭТ поселиться в течение 2 мин и аспирации супернатант. Повторное приостановить ЭТ в 1 мл раствора RNAlater или реагентом TRIzol, вихря и хранить пробу при -80 ° С до дальнейшей обработки.
    Примечание: Выполните все процедуры в области биобезопасности шкаф как надлежащей лабораторной практики. Поворот пластины в круговом движении вокруг центра, чтобы привести все в ЭТ центра, аспирация среды от окружающих с помощью стерильного стеклянного paštuRe пипетки, добавьте 15 мл RD среду, а затем добавить 15 мкл препарата / транспортного средства для соответствующей группы.

5. Выделение РНК и целостность тестирование

  1. Выделение РНК:
    Большинство шагов, указанных ниже, должны быть выполнены для очистки РНК с использованием RNeasy Mini Kit согласно инструкции по эксплуатации. Всегда используйте нуклеазам бесплатно трубки, наконечники и воду. При работе с TRIzol провести всю процедуру в химической безопасности капотом и носить защитные очки, а также химические защитные перчатки.
    1. Оттепель образцы на льду. Если образцы хранятся в растворе RNAlater, центрифугировать пробирки при 12000 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Удалите супернатант и добавьте 1 мл TRIzol реагента.
    2. Растирают образцы с использованием 24 г иглу и шприц емкостью 1 мл. Примерно в 15 раз растирание достаточно для разрушения ЭТ, клеточной стенки и мембран плазмы.
    3. Добавить 200 мкл хлороформа в каждом образце. Вихревой смешивать содержимое равномерно. Центрифугапри 12000 х г в течение 15 мин при 4 ° С. Удалить спиновые колонки RNeasy мини, 1,5 мл трубки и маркировать их должным образом.
    4. Соберите супернатант в 1,5 мл пробирки (время сбора супернатанта не беспокоить середину или нижний слой). Добавить равный объем охлажденного 70% этанола. Смешайте содержимое, осторожно встряхивая.
    5. Применить 700 мкл из пробирок с соответствующими мини спиновых столбцов и центрифуги их при 12000 х г в течение 20 сек при комнатной температуре. Выполните все дальнейшие шаги при комнатной температуре.
    6. Отменить фильтрата и применять оставшийся раствор в соответствующих столбцов и центрифуги их при 12000 х г в течение 20 сек. Откажитесь от фильтрата.
    7. Применить 350 мкл буфера RW1 на колонку и центрифугировать их при 12000 х г в течение 20 сек. Отменить фильтрата и применить 10 мкл ДНКазы и 70 мкл RDD буфера в колонку.
    8. Инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин. Применить 350 мкл буфера RW1 на колонку и центрифугировать их при 12000 х г в течение 20 сек. Откажитесь от фильтрата. Применить 500 мклНПП промывочный буфер на колонку и центрифугировать их при 12000 мкг в течение 20 сек. Откажитесь от фильтрата. Опять Применить 500 мкл промывочного буфера RPE к колонке и центрифуги их при 12000 х г в течение 2 мин. Откажитесь от фильтрата.
    9. Сдвиг колонки на новые 2 мл пробирки для сбора и центрифуге их при 12000 мкг в течение 1 мин. Перевести столбцы с надписью 1,5 мл пробирку и применять 22 мкл нуклеазы свободной воды. Центрифуга трубки при 12000 мкг в течение 1 мин.
    10. Снимите трубку сбора и положить их на льду. Количественно РНК с помощью автоматизированной системы электрофореза.
  2. Концентрация РНК, чистота и проверки целостности.
    Для чистоты и целостности РНК тестирования использование автоматизированной системы электрофореза и соответствующей комплект 33.

6. микрочипов Исследования

  1. Выполните транскрипции профилирование с использованием коммерческих доступные чипы человека массива. Для приготовления РНК-мишени, фрагментации, гибридизации 34 и массиваЧип окрашивание, стиральная использовать коммерческие 35 доступные наборы.
  2. Выполните сканирование массива чип и проверку контроля качества, используя стандартные струйной станции, сканеры и массива стандартных операционных программного обеспечения 36. Для анализа экспрессии генов импортировать файлы, созданные из сканеров в стандартной коммерческой доступно программное обеспечение 37, фоновую коррекцию, обобщение и нормализации с Прочная нескольких массива анализа (RMA).
  3. Для получения списка дифференциально выраженных генов (DEG в) выполнить одну сторону ANOVA анализ. Из этого списка отфильтровать гены, основанные на изменении раза (± 2) и ФРГ, контролируемой р-значение (<0,05). Получить главных компонент (PCA), тепловая карта, и т.д., используя это программное обеспечение.

Часть 2. UKN 1 Тестовая система

1. Техническое обслуживание ЭСК

  1. Посев MEFs
    1. Для дифференциации используют НСКС # 8534 (H9) клеточной линии. Культура CEзаполняет на мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ), как фидерных клеток. Шерсть T25 колбу с 4 мл 0,1% желатина и инкубируют в течение 30 мин при 37 ° С.
    2. Оттепель МЭФ в С водяной бане 37 ° и передать клеток в предварительно нагретой DMEM / 10% FBS.
    3. Спин 3,5 мин с 500 мкг, удалить супернатант и повторно приостанавливать клеток, чтобы получить 1 × 10 7 клеток / мл. Пластинчатые МЭФ 4 х 10 4 / см 2 в колбы Т25 на желатин. При желании, использовать MEFs в течение следующих двух дней. Качество MEF партий являются очень важным вопросом для обеспечения чЭСК. Поэтому желательно, чтобы выяснить лучшую компанию и способ получения для клеток H9. Мы используем ПМЭФ P3.
  2. Расщепление и обслуживание H9
    1. Добавить 1 мл подогретого диспазу за T25 колбу H9 и инкубировать 9 мин при 37 ° С.
    2. Добавить 2 мл мыть среды в диспазу обработанные клетки и пипетки в 5 раз вверх и вниз с 5 мл пипетки и решения передачи клеток к сокола трубки.
    3. Вымойте колбу с 9 мл среды мытьи добавить клеток к другим. Спин 3,5 мин с 500 мкг, удалить супернатант и вновь приостановить клеток в 10 мл среды чЭСК.
    4. Спин 3,5 мин с 500 мкг, удалить супернатант и вновь приостановить клеток в 4 мл чЭСК среде. Добавить 0,5 мл суспензии клеток и 4,5 мл чЭСК среды и пластины в новом (PBS) промывают T25 колбу с MEFs. Изменение всю чЭСК среды (5 мл) в колбу каждый день.

2. Дифференциация ЭСК к нейроэктодермальных клеток-предшественников (НЭП)

  1. Подготовка чЭСК среды и КСМ среду. Шерсть один 10-см чашку с желатином (0,1% в ПБС) на T25 колбу и инкубируют в течение 30 мин при 37 ° С. Удалить среду из чЭСК и добавить достаточно Accutase, чтобы покрыть всю нижнюю часть колбы (1 мл на колбу Т25) и инкубируют 25 до 30 мин при 37 ° С.
  2. Подготовка пластин, покрытых базальной мембраны матричные во Accutase инкубации. Добавить холодную DMEM / F12, чтобы замороженные базальной мембраны матрицы гранул и решить ее 1:20. Фильтровать базальной мембраны матричные Солуние через сито 40 мкм клетки. Добавить отфильтрованного раствора с пластиной, вся нижняя должна быть покрыта (1 мл на 6-луночных требуется) и инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре.
  3. После инкубационного периода удалите базальной мембраны матрицу супернатант и семян клетки на лунки, покрытые. После Accutase стадии (2.1) остановить реакцию добавлением 1,5 мл HES среды. Собрать клетки из колбы, добавляют 8 мл чЭСК среды и производить одно решение клеток с помощью пипетки с 10 мл пипеткой тщательно. Фильтровать клетки через сито 40 мкм клетки.
  4. Спин клетки 3 мин с 500 мкг, удалить супернатант и повторно приостанавливать клеток в 10 мл чЭСК. Спин клетки снова 3 мин с 500 мкг, удалить супернатант и повторно приостанавливать клеток в чЭСК, содержащие ингибитор ROCK Y-27632 до конечной концентрации 10 мкМ.
  5. Удалить супернатант желатина покрытием блюдо. Подвеска плиты клеток на покрытые желатином блюдо, чтобы удалить MEFs и оставить в инкубаторе в течение 1 часа ровно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этого этапа МЭФ будет SЭттле на желатиновой покрытием пластины, в то время как чЭСК не можете прикреплять желатина. Поэтому это очень важно для получения подачи свободной дифференциации. Это важный шаг, как слишком длинные Результаты инкубации в чЭСК сгустки и слишком короткий инкубационный в неэффективной удаления MEFs. Через 45 мин инкубации пластина должна быть исследована уже поселились MEFs и чЭСК сгустки.
  6. Когда МЭФ приложил, аккуратно мыть неадгезированных клетки (чЭСК) с после инкубации со средой уже в тарелке. Если несколько Т25 были использованы, чтобы получить больше клеток, отдельные клетки теперь могут быть объединены. Вымойте пластину один раз чЭСК среде.
  7. Спин клетки 3 мин с 500 мкг, удалить супернатант и повторно приостанавливать клетки в примерно 4 мл КСМ, содержащих ингибитор ROCK 10 мкМ Y-27632 и 10 нг / мл FGF-2.
  8. Граф клеток в гемоцитометра, используя трипанового синий. Пластина 18 х 10 3 клеток / см 2 на базальной мембране матрицы с покрытием пластин в КСМ, содержащие ингибитор ROCK 10 мкМ Y-27632 и10 нг / мл FGF-2 (для 6 также использовать 1,5 мл на лунку). Это имеет решающее значение для пластины клеток в правильном плотности дифференцировать их успешно в ПОШ.
  9. Через 24 часа, изменить среду на свежую КСМ, содержащей 10 мкМ ингибитора ROCK Y-27632 и 10 нг / мл FGF-2. После дальнейшего 24 часов, изменить среду на свежую КСМ, содержащей 10 нг / мл FGF2.
  10. 72 ч после посева клеток, дифференциация начинается с изменения средней к КСР среды. Этот момент времени, называется день дифференциации (0 DoD0). Добавление тестируемых веществ в настоящее время это возможно.
  11. На DoD1 и DoD2 среда изменилась так, как на DoD0. Следующее изменение среда в DoD4, содержащий 25% N 2-S и 75% KSR. В DoD6 дифференциация прекращается и клетки собирают для анализа.

3. хроматина Иммунопреципитация (чип) из ЭСК и нэпа

  1. Подготовка ядер
    1. Добавить 500 мкл Accutase каждой скважине, которая 6 должны быть проанализированы и инкубировать в течение 25 до 30 мин. CouNT клетки в камере Neubauer использованием трипанового синий.
    2. Ресуспендируют клеток в 1% формальдегида в DMEM / F12 для сшивания. Добавить Трис, рН 7,5 до конечной концентрации 125 мМ через 10 мин, чтобы остановить сшивания.
    3. Спин клетки 3 мин с 500 мкг при 4 ° С, удалить супернатант и повторно приостанавливать клеток в холодном PBS.
    4. Спин клетки 3 мин с 500 мкг при 4 ° С, удалить супернатант и вновь приостановить клеток в 1 мл буфера / L1- 1 × 10 6 клеток.
    5. Инкубировать в течение 5 минут на льду. Спин 5 мин с 800 мкг при 4 ° С, удалить супернатант и повторно приостанавливать ядра в 1 мл буфера / L2- 2 × 10 6 клеток.
  2. Озвучивание и контроль качества
    1. Ультразвук так, что фрагменты ДНК длиной 300-700 п.н. генерируются. Спин 1 мин 10,000 мкг при 4 ° С. Передача супернатант в новую пробирку. Фрагменты должны иметь правильный размер, в противном случае иммунопреципитации будет неэффективной, а также с последующим КПЦР.
    2. Удалить 50 мклд смешать с 50 мкл буфера L2, чтобы проверить эффективность обработки ультразвуком, запустив в агарозном геле.
    3. Обратный сшивки путем инкубации при 65 ° С в течение 4 ч и 500 оборотов в минуту. Загружают образцы 1: 5 с оранжевый G красителем на 1,5% агарозном геле и запустить 45 мин при 110 В в буфере 1x КЭ. Размер фрагмента управления (должно быть между 300-700 б.п.).
  3. Хроматина Иммунопреципитация
    1. Развести образцы 1: 5 в буфере для разведения и аликвоты 1 мл на IP в силиконизированных пробирках.
    2. Удалить 5% (по объему) от разбавленного образца хроматина (шаг 3.3.1) и хранят при температуре 4 ° С, как "вход".
    3. Выдержите образцы с антителами на ваш выбор и с неспецифической IgG O / N при 4 ° С на ротатора.
    4. Добавить 50 мкл белка бисером / G сефарозы к каждому образцу, после иммунопреципитации. Инкубируйте образцы 3 ч при 4 ° С на ротатора. Спин 1 мин с 1500 мкг при 4 ° С и удаления надосадочной жидкости.
    5. Промыть 1 мл мытья шариков. Спин 1 мин с 1500 мкг в4 ° С и удаления надосадочной жидкости. Повторите шаг г до ч. Промыть 1 мл конечного буфера для промывки. Во время промывки не должна проиграть любой из бусин, так как это приводит к изменению количества элюата непосредственно.
    6. Центрифуга 1 мин с 1500 мкг при 4 ° С и удаления надосадочной жидкости. Добавить 125 мкл буфера для элюции и инкубируют 15 мин при 65 ° С при 1000 оборотах в минуту в шейкере.
    7. Спин 1 мин с 1500 мкг и передачи супернатант в новую трубку Повторите шаг к и л. Добавить 200 мкл буфера элюции для ввода (3.3.2). Добавить протеиназы К и РНКазы к каждому образцу и инкубировать 30 мин при 37 ° С при 500 оборотах в минуту в шейкере, а затем 4 ч при 65 ° С при 500 оборотах в минуту в шейкере.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для извлечения ДНК использование коммерческой доступно ДНК-чип Clean и концентратор Kit 38.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метил воздействие ртути в тестовой системе УКК

Цитотоксичности проводили с H9 ЭТ, чтобы получить значение IC 10 (снижение жизнеспособности на 10%) на цитотоксичность метилртути (фиг.1). Мы также провели микрочипов на основе (Affymetrix платформы) биомаркеров исследование. H9 ЭТ были подвержены метилртути (0,25 и 1 мкМ) в течение 14 дней. На 14-й день, образцы были собраны с использованием TRIzol и РНК выделяли. Транскрипции профилирование осуществляли с использова...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Традиционные подходы к токсикологической тестирования привлекать широкие исследования на животных, таким образом, делая тестирование дорого и отнимает много времени. Кроме того, из-за различий в межвидовых доклинические исследования безопасности животных не всегда справедливо для прогнозирования токсичности эффекты потенциальных лекарственных препаратов соответствующих для человека. Хотя нечеловеческие приматы являются наиболее предсказуемым, по-прежнему сильны этические и socioeconomical требования быстро поднимая совр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Благодарим М. Капицу, Маргит Генри, Тамару Ротштейн, Сьюзан Рохани и Корнелию Бёттингер за отличную техническую поддержку. Эта работа была поддержана грантами Немецкого научно-исследовательского общества (RTG 1331) и Министерства исследований Германии (BMBF).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DMEM/F-12Life Technologies11320082модифицированная среда Dulbecco's Eagle: смесь питательных веществ F-12
KOSRLife Technologies10828028Нокаутирующая замена сыворотки
GlutaMAXТехнологии35050061добавка GlutaMAX
NEAALife Technologies11140050MEM раствор
DPBSLife Technologies14190-0144Фосфатно-солевой буфер Дульбекко, без кальция, без магния
mTeSR средаStemcell Technologies5850
Pluronic F-127 SigmaP2443-250G
V нижняя пластинаVWR734-0483Пластина,Микролунка,V BTTM,96 Лунка,Стерильная 1 * 50 ST
V нижняя пластинакрышка VWR634-0011Крышка, микротитровые планшеты, конд. кольцо 1 * 50 ST
Pen/StrepLife Technologies15140-122Пенициллин-стрептомицин, жидкая
дистиллированная водаLife Technologies15230-089.Стерильная дистиллированная вода
Человеческий FGF-2 (bFGF)MilliporeGF003AF-100UGФактор роста фибробластов базовый, человеческий рекомбинантный, без животного происхождения
Фильтр 0,22 μ mMilliporeSCGPU02REStericup-GP, 0,22 μ m, полиэфирсульфон, 250 мл, радиостерилизованный
StemPro EZPassageTM DisposablteInvitrogen23181010
BD MatrigelTM, сертифицированный hESC MatrixStemcell Technologies354277флакон 5 мл
DMSOSigmaD-2650
RNAlater Stabilization SolutionLife TechnologiesAM7020Он стабилизирует и защищает целостность РНК в незамороженных образцах.
70 μ m Клеточный фильтрBecton Dickinson352350Клеточный фильтр с 70 μ m Нейлоновая сетка
35 μ m Ситечко с крышкой, 5  мл пробиркаBecton Dickinson3522355 мл полистирольная пробирка с круглым дном, с крышкой ситечка (35  μ m)
50 мл стерильная полипропиленовая тубаGreiner Bio-One22726150 мл Полипропиленовая туба с коническим дном, стерильная
колба T75Greiner Bio-One658175CELLSTAR Фильтр Колпачок Клеточная культура 75 см<суп>2 колбы
TRIzolLife Technologies10296010
96 луночных оптических донных пластинThermo Scientific165305
CellTiter-BluePromegaG8081
АккутазаPAAL11-007
АпотрансферинSigma-AldrichT-2036
ДиспазаWorthington BiochemicalsLS002104
дорсоморфинTocris Bioscience3093
ЭДТАРот8043.2
FBSPAAA15-101
FGF-2R& D Systems233-FB
ЖелатинSigma-AldrichG1890-100G
ГлюкозаSigma-AldrichG7021-100G
GlutaMAXGibco Invitrogen35050-038
HEPESGibco Invitrogen15630-056
ИнсулинSigma-AldrichI-6634
Knockout DMEMGibco Invitrogen10829-018
MatrigelBD Biosciences354234
NogginR& D Systems719-NG
PBSBiochrom AGL1825
ПрогестеронSigma-AldrichP7556
ПутресцинSigma-AldrichP-5780
Ингибитор ROCK Y-27632Tocris Biosciences1254
SB431542Tocris Biosciences1614
SDSBio-Rad161-0416
СеленSigma-AldrichS-5261
β-МеркаптоэтанолGibco Invitrogen31350-010
[header]
List of Kits
RNeasy Mini Kit (250)QIAGEN74106
Набор для гибридизации, стирки и окрашивания GeneChipAffymetrix900721, 22, 23Этот набор содержит все реагенты, необходимые для гибридизационной промывки и окрашивания микрочипов.
Набор ДНКазы без РНКАЗыQIAGEN79254
[header]
Список оборудования
Инвертированный микроскопOlympusIX71
- 645Affymetrix
Genechip Fluidics Station-450Affymetrix
Affymetrix Сканер генных чипов-3000-7 GAffymetrix
Spectramax M5Molecular Devices
 
 
 
[header]
List of software
Prism 4
Affymetrix GCOS
Partek Genomic Suite 6.25
Онлайн-инструменты для функциональной аннотации
DAVID
Onto-tools Интеллектуальные системы и биоинформатика Лаборатория
заменимых аминокислот IX71 Печь для гибридизации Olympus

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liu, W. W., Deng, Y. G., Liu, Y., Gong, W. R., Deng, W. B. Stem Cell Models for Drug Discovery and Toxicology Studies. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 27 (1), 17-27 (2013).
  2. Zuba-Surma, E. K., Jozkowicz, A., Dulak, J. Stem Cells in Pharmaceutical Biotechnology. Current Pharmaceutical Biotechnology. 12 (11), 1760-1773 (2011).
  3. Leist, M., Hartung, T., Nicotera, P. The dawning of a new age of toxicology. ALTEX. 25 (2), 103-114 (2008).
  4. Kuegler, P. B., et al. Markers of murine embryonic and neural stem cells, neurons and astrocytes: reference points for developmental neurotoxicity testing. ALTEX. 27 (1), 17-42 (2010).
  5. Yamada, M., et al. Human oocytes reprogram adult somatic nuclei of a type 1 diabetic to diploid pluripotent stem cells. Nature. , (2014).
  6. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  7. Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature cell biology. 16 (1), 118-126 (2014).
  8. Zimmer, B., et al. Evaluation of Developmental Toxicants and Signaling Pathways in a Functional Test Based on the Migration of Human Neural Crest Cells. Environmental Health Perspectives. 120 (8), 1116-1122 (2012).
  9. Bosman, A., et al. Molecular and Functional Evidence of HCN4 and Caveolin-3 Interaction During Cardiomyocyte Differentiation from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells and Development. 22 (11), 1717-1727 (2013).
  10. Sartiani, L., et al. Developmental changes in cardiomyocytes differentiated from human embryonic stem cells: A molecular and electrophysiological approach. Stem Cells. 25 (5), 1136-1144 (2007).
  11. Xu, X. Q., et al. Chemically defined medium supporting cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Differentiation. 76 (9), 958-970 (2008).
  12. Pal, R., Mamidi, M. K., Das, A. K., Bhonde, R. Comparative analysis of cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells under 3-D and 2-D culture conditions. Journal of Bioscience and Bioengineering. 115 (2), 200-206 (2013).
  13. Subramanian, K., et al. Spheroid Culture for Enhanced Differentiation of Human Embryonic Stem Cells to Hepatocyte-Like Cells. Stem Cells and Development. 23 (2), 124-131 (2014).
  14. Sivertsson, L., Synnergren, J., Jensen, J., Bjorquist, P., Ingelman-Sundberg, M. Hepatic Differentiation and Maturation of Human Embryonic Stem Cells Cultured in a Perfused Three-Dimensional Bioreactor. Stem Cells and Development. 22 (4), 581-594 (2013).
  15. Jagtap, S., et al. Cytosine arabinoside induces ectoderm and inhibits mesoderm expression in human embryonic stem cells during multilineage differentiation. British Journal of Pharmacology. 162 (8), 1743-1756 (2011).
  16. Krug, A. K., et al. Human embryonic stem cell-derived test systems for developmental neurotoxicity: a transcriptomics approach. Archives of Toxicology. 87 (1), 123-143 (2013).
  17. Leist, M., et al. Test systems of developmental toxicity: state-of-the art and future perspectives. Archives of Toxicology. 87 (12), 2037-2042 (2013).
  18. Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Molecular medicine. 6 (2), 88-95 (2000).
  19. Khoo, M. L. M., et al. Growth and differentiation of embryoid bodies derived from human embryonic stem cells: Effect of glucose and basic fibroblast growth factor. Biology of Reproduction. 73 (6), 1147-1156 (2005).
  20. Son, M. Y., Kim, H. J., Kim, M. J., Cho, S. Physical Passaging of Embryoid Bodies Generated from Human Pluripotent Stem Cells. Plos One. 6 (5), (2011).
  21. Winkler, J., Sotiriadou, I., Chen, S., Hescheler, J., Sachinidis, A. The potential of embryonic stem cells combined with -omics technologies as model systems for toxicology. Current medicinal chemistry. 16 (36), 4814-4827 (2009).
  22. Gunaseeli, I., Doss, M. X., Antzelevitch, C., Hescheler, J., Sachinidis, A. Induced pluripotent stem cells as a model for accelerated patient- and disease-specific drug discovery. Current medicinal chemistry. 17 (8), 759-766 (2010).
  23. Miller, M. T., Stromland, K. Teratogen update: Thalidomide: A review, with a focus on ocular findings and new potential uses. Teratology. 60 (5), 306-321 (1999).
  24. Newman, C. G. H. Teratogen Update - Clinical Aspects of Thalidomide Embryopathy - A Continuing Preoccupation. Teratology. 32 (1), 133-144 (1985).
  25. Stern, L. In vivo assessment of the teratogenic potential of drugs in humans. Obstetrics and gynecology. 58 (5 Suppl), 3S-8S (1981).
  26. Lynch, H. T., Reich, J. W. Diethylstilbestrol, Genetics, Teratogenesis, and Tumor Spectrum in Humans. Medical Hypotheses. 16 (3), 315-332 (1985).
  27. Satoh, H. Behavioral teratology of mercury and its compounds. Tohoku Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 1-9 (2003).
  28. Meganathan, K., et al. Identification of Thalidomide-Specific Transcriptomics and Proteomics Signatures during Differentiation of Human Embryonic Stem Cells. Plos One. 7 (8), (2012).
  29. Balmer, N. V., et al. Epigenetic changes and disturbed neural development in a human embryonic stem cell-based model relating to the fetal valproate syndrome. Human Molecular Genetics. 21 (18), 4104-4114 (2012).
  30. Smirnova, L., Hogberg, H. T., Leist, M., Hartung, T. Developmental neurotoxicity - Challenges in the 21st Century and In Vitro Opportunities. ALTEX. 31 (2), 129-156 (2014).
  31. Leist, M., Efremova, L., Karreman, C. Food for thought ... considerations and guidelines for basic test method descriptions in toxicology. ALTEX. 27 (4), 309-317 (2010).
  32. Zimmer, B., et al. Coordinated waves of gene expression during neuronal differentiation of embryonic stem cells as basis for novel approaches to developmental neurotoxicity testing. Cell Death and Differentiation. 18 (3), 383-395 (2011).
  33. Experion RNA StdSens Analysis Kit for RNA analysis by Electrophoresis. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10000976B%20%20RNA%20STDSENS%20MANUAL.PDF (2014).
  34. Affymetix GeneChip 3 IVT Express Kit for Target RNA preparation, Fragmentation and hybridization. , Available from: http://microarray.csc.mrc.ac.uk/downloads/3'%20IVT%20Express%20Manual.pdf (2014).
  35. Affymetrix GeneChip Hybridization, Wash and Stain Kit. , Available from: http://www.affymetrix.com/catalog/131467/AFFY/Hybridization,-Wash,-and-Stain-Kit#1_1 (2014).
  36. Affymetrix GeneChip Operating Software. , Available from: http://www.affymetrix.com/estore/partners_programs/programs/developer/gcos_sdk/gcos_sdk_overview.affx#1_1 (2014).
  37. Partek Genomics Suite. , Available from: http://www.partek.com/pgs (2014).
  38. ChIP DNA Clean and Concentrator. , Available from: http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/pcr-dna-clean-up-concentration/chip-dna-clean-concentrator (2014).
  39. Kraljevic, S., Stambrook, P. J., Pavelic, K. Accelerating drug discovery. EMBO Reports. 5 (9), 837-842 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи