Вся камера bioreporter проба с Burkholderia sartisoli RP037-МКТО был разработан для обнаружения фракции органического загрязнителя (т.е. флуорена) Доступные для бактериального разложения после активного транспорта по мицелия, соединяющих заполненные воздухом поры в ненасыщенной модели водной системы.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Всего сотовый Bioreporter подход к оценке переноса и биодоступности органических загрязнителей в ненасыщенных систем водоснабжения
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Биодоступность загрязнителей является предпосылкой для их эффективной биодеградации в почве. Однако средняя объемная концентрация загрязнителя не является подходящим показателем его наличия; Биодоступность скорее зависит от динамического взаимодействия потенциального массопереноса (потока) соединения к микробной клетке и способности последней разрушать соединение. Было показано, что в ненасыщенных водой частях почвы мицелий преодолевает ограничения биодоступности, активно транспортируя и мобилизуя органические соединения в диапазоне сантиметров. В то время как степень переноса мицелия может быть легко определена химическими средствами, проверка биодоступности загрязняющих веществ для бактериальных клеток требует биологического метода. Чтобы устранить это ограничение, мы выбрали флуорен ПАУ (FLU) в качестве модельного соединения и разработали ненасыщенный водой модельный микромир, связывающий пространственно разделенный точечный источник FLU и разрушающую FLU бактерию Burkholderia sartisoli RP037-mChe мицелиальной сетью Pythium ultimum. Поскольку биорепортер экспрессирует eGFP в ответ на поток ПАУ в клетку, воздействие и деградация бактериального ГРИППа могут контролироваться непосредственно в микромире с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM). CLSM и анализ изображений показали значительное увеличение экспрессии eGFP в присутствии P. ultimum по сравнению с контрольной группой без мицелия или гриппа, что указывает на биодоступность ГРИПП для бактерий после опосредованного мицелием транспорта. Результаты CLSM были подтверждены химическим анализом в идентичных микромирах. Разработанный микромир оказался пригодным для исследования биодоступности загрязняющих веществ и одновременной визуализации вовлеченных бактериально-мицелиальных взаимодействий.
Введение
Почва густонаселенных от широкого спектра микроорганизмов, таких как 1,2 бактерий. Однако условия в этой среде обитания являются сложными, особенно с точки зрения наличия воды 3. Бактерии постоянно нужно искать оптимальных условий в гетерогенных средах 4, но отсутствие непрерывных водных пленок приводит к ограничению подвижности 5 препятствуя им свободно распространяться. Кроме того, скорость диффузии растворенных веществ (например, питательных веществ) снижены при ненасыщенных условиях 6. Таким образом, бактерии и питательные вещества часто физически разделены и питательных доступность ограничивается
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка посуды, горки и инкубаторе
- Подготовьте следующие материалы для каждого микрокосма: одна большая пластиковая чашка Петри дно (d = 10 см), один модифицированный (см шаг 1,2) маленький пластиковый чашку Петри дно (d = 5 см) с крышками и один Счетной палаты слайд с тремя полостями.
- Взять нужное количество чашек Петри нижней части (D = 5 см). Удаление части краев с пилой точно соответствовать слайд (26 мм длиной ребра). Для стерилизации системы, впитать чашку Петри днища и крышки в 70% этаноле O / N и высушить их, по крайней мере, 2 ч в шкафу потока под УФ-светом. Храните чашки Петри в плотно закрывающийся пластиковый контейнер, который ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Представленные здесь результаты уже опубликованы ранее 15. Пожалуйста, обратитесь к статье для детального механистического и экологической обсуждения.
После записи изображения с помощью CLSM, максимальный выступ интенсивность может быть проведено с использованием соответствующего программного обеспечения микроскопа или ImageJ, чтобы получить первый визуальное впечатление образца и контроля (рисунок 2). Позже, наборы данных могут быть спроектирован по-другому, чтоб.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Представлены настройки микрокосм зарекомендовали себя для изучения биодоступности пространственно разделенных химических веществ, унижающему человеческое достоинство организмов после поглощения и транспорта по мицелия. Потенциал в газовой фазе перенос частично летучих соединений предотвращается и бактериальные клетки bioreporter могут быть визуализированы без сложной подготовки проб и, таким образом, с минимальным нарушением чувствительной системы. В то же время, химический анализ образца может быть легко проведена позв.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Финансирование от Немецкого экологического фонда (DBU) подтверждено. Авторы благодарят Уте Кулике за техническую помощь в анализе CLSM, а также Биргит Вюрц, Риту Ремер и Яну Райхенбах за квалифицированную экспериментальную помощь. Авторы хотели бы выразить особую благодарность профессору Яну Рулофу ван дер Мееру и доктору Робину Текону за плодотворную дискуссию и предоставление биорепортерного штамма. Компания вносит свой вклад в исследовательскую программу «Химические вещества в окружающей среде» (CITE) Объединения им. Гельмгольца.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
Solution 3
colspan="4"> (pH 6,0) NaCl logi tool
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Конфокальный микроскоп | Leica | TCS SP5X, LAS AF - Version 2.6.1; или эквивалент CLSM | |
| GC HP 7890 Series GC и Agilent 5975C MSD | Agilent | или эквивалент GC/MS может быть использован | |
| GC капиллярной колонкой J& Ш 121-5522 | Agilent | ||
| Пробковый точильщик | Fisher Scientific | 12863952 | или любой другой |
| Крышка колпачка | Marienfeld | 107222 | Высокая производительность, No1.5H |
| GC/MS insterts | WICOM | WIC 47080 | |
| GC/MS флаконы 2 мл | WICOM | WIC 41150 | |
| Крышки/перегородки для флаконов с завинчивающейся крышкой | DIONEX | 49463 / 049464 | |
| Крышки для флаконов с ГХ/МС | WICOM | WIC 43948/B | |
| Объективные стекла | Menzel | обыкновенные | |
| стекловолокна с покрытием PDMS | Polymicro Technologies, Inc. | V (PDMS) = 13,55 ± 0,02 &микро; l m-1Petri | |
| Тарелки маленькие/большие | Greiner | 633-102 / 628-102 | |
| Флаконы с завинчивающейся крышкой 40 мл | DIONEX | 48783 | можно использовать другие стеклянные флаконы |
| Флаконы с завинчивающейся крышкой 60 мл | DIONEX | 48784 | можно использовать другие стеклянные флаконы |
| Аценафтилен d08 | Dr. Ehrenstorfer | C 20510100 | |
| Ацетон | Карл Рот | 9372.2 | |
| Активированный уголь | Сигма-Олдрич | 242276-1 кг | |
| Агароза Карл | Рот | 2267.4 | |
| Флуорена | Флюка | 46880 | |
| Канамицина сульфат | Карл | Рот T832.2 | 50 мг L-1 |
| Метанол | Carl Roth | P7171 | |
| Minimal Medium: 100 мл Solution 1 + 25 мл Solution 2 + 5 мл Solution 3 ad. 1,000 ml aqua dest | |||
| Solution 1 | |||
| Ammonium sulfate | Carl Roth | 3746.1 | 5 г L-1 |
| Магния хлорид x 6 H2O | Carl Roth | 2189.1 | 1 г L-1 |
| Нитрат кальция x 4 H2O | Карл Рот | P740.1 | 0,5 г L-1 |
| Solution 2 | |||
| Disodium phosphate | Карл Рот | P030.1 | 55,83 г L-1 |
| Монокалийфосфат | Карл Рот | 3904,1 | 20 г L-1 |
| Динатрий ЭДТА | MERCK | 1084180250 | 0,8 г L-1 |
| Iron(II) хлорид x 4 H2O | MERCK | 1038610250 | 0,3 г L-1 |
| Cobalt(II) хлорид x 6 H2O | Carl Roth | T889.3 | 4 мг L-1 |
| хлорид марганца(II) x 1 H2O | Carl Roth | 4320.2 | 10 мг L-1 |
| Copper (II) сульфат Carl | Roth | P023.1 | 1 мг L-1 |
| Молибдат натрия x 2 H2O | Carl Roth | 0274.1 | 3 мг L-1 |
| Хлорид цинка | MERCK | 1088160250 | 2 мг L-1 |
| Хлорид лития | Carl Roth | P007.1 | 0,5 мг L-1 |
| Оловянный (II) хлорид x 2 H2O | Carl Roth | 4473.1 | 0,5 мг L-1 |
| борная кислота | Riedel-de-Haen | 11606 | 1 мг L-1 |
| Калия бромид Carl | Roth | A137.1 | 2 мг L-1 |
| Йодид калия | Carl Roth | 6750.1 | 2 мг L-1 |
| хлорид бария | Carl Roth | 4453.1 | 0,5 мг L-1 |
| MMA | Минимальная среда + агароза 0,2% | ||
| Фенантрен d10 | Dr. Ehrenstorfer | C 20920100 | |
| Картофельная декстроза Агар: 24 г L-1 бульон + бакто-агар 1,5%; pH 6,8 | |||
| Картофельный бульон с декстрозой | Difco/ Beckton Dickinson | 254920 | |
| Бакто-агар | Difco/ Beckton Dickinson | 214040 | |
| Ацетат натрия x 3 hydr. | Carl Roth | 6779.1 | |
| Сульфат натрия | MERCK | 1066495000 | |
| толуол | MERCK | 1083252500 | |
| mTY среда: 3 г L-1 дрожжевой экстракт, 5 Г&нбсп; L-1 бактотриптон и 50 мМ | |||
| экстракт дрожжей | Merck | 1037530500 | |
| триптон | Serva | 4864702 | |
| хлоридом натрия | Carl Roth | 3957.1 | |
| ImageJ с плагином | http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html и http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10 | ||
| штамм Pythium ultimum 67-1 | Получен из лаборатории доктора Кристофа Киля; Кафедра фундаментальной микробиологии, Лозаннский университет, Швейцария | ||
| Burkholderia sartisoli RP037-mChe | Получено из лаборатории профессора Яна Рулофа ван дер Меера; Факультет фундаментальной микробиологии, Лозаннский университет, Швейцария |
Ссылки
- Holden, P. A., Fierer, N. Microbial processes in the vadose zone. Vadose Zone Journal. 4, 1-21 (2005).
- Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The unseen majority. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6578-6583 (1998).
- Kieft, T. L....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
