Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Генерация CAR Т-клеток в усыновители терапии в контексте глиобластомы стандарт медицинской помощи

20.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52397

⸱

16 февраля 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Duke Brain Tumor Immunotherapy Program, Department of Neurosurgery, Duke University, 2Department of Biomedical Engineering, Duke University, 3Department of Pathology, Duke University

В этой статье

Краткое содержание

Лимфодеплетивные и иммуномодулирующие эффекты химиотерапии и лучевой терапии могут быть использованы для повышения противоопухолевой эффективности иммунотерапии Т-клетками. Мы описываем метод получения EGFRvIII-специфичных химерных антигенных рецепторов (CAR) Т-клеток и их введения в контексте стандартного лечения глиобластомы.

Аннотация

Адоптивная иммунотерапия Т-клетками предлагает многообещающую стратегию для целенаправленного нацеливания и устранения злокачественных глиом. Т-клетки могут быть сконструированы ex vivo для экспрессии химерных антигенных рецепторов, специфичных для глиомных антигенов (CAR-Т-клеток). Экспансия и функция адоптивно переносимых CAR-Т-клеток могут быть потенцированы лимфоделтивными и опухолецидными эффектами стандартной химиотерапии и лучевой терапии. Мы описываем метод получения CAR-Т-клеток, нацеленных на EGFRvIII, глиомо-специфический антиген, и оценку их эффективности в сочетании со стандартной моделью глиобластомы у мышей. Т-клетки конструируются путем трансдукции с помощью ретровирусного вектора, содержащего ген анти-EGFRvIII CAR. Опухоленосные животные подвергаются обусловливанию хозяина путем курса темозоломида и облучения всего мозга в дозах, разработанных в соответствии с клиническим стандартом лечения. Затем CAR-Т-клетки доставляются внутривенно к праймированным хозяевам. Этот метод может быть использован для оценки противоопухолевой эффективности CAR-Т-клеток в контексте стандартного лечения.

Введение

Глиобластома (GBM) является наиболее распространенной первичной злокачественной опухоли головного мозга и приводит к летальному исходу. Хирургическая резекция в сочетании с неспецифической стандарт медицинской помощи химиотерапии и лучевой терапии не удается полностью устранить злокачественные клетки, в результате чего плохим прогнозом менее 15 месяцев у пациентов с этим заболеванием 1. В отличие от этого, иммунотерапия предлагает точный подход специально для ориентации опухолевые клетки, и, таким образом, имеет потенциал, чтобы служить в качестве весьма эффективного лечения платформе с уменьшенным риском побочного токсичности 2-4. Т-клетки инженерии экс естественных условиях, чтобы выразить химерных рецепторов антигена (автомобили) предлагают универсальный стратегии иммунотерапии опухолей. ЦАР формируются путем слияния внеклеточный вариабельный участок антитела с сигнальной молекулы одного или более внутриклеточный Т-клеток (ов), вместо полноразмерного главного комплекса гистосовместимости (MHC) -ограниченных Т-клеточный рецептор 5. Этот режим антитело-антиген, как ждут победитна позволяет реактивные антиген-специфические Т-клетки, чтобы распознавать и реагировать на опухолевых антигенов в отсутствие МНС и может быть адаптирована для практически бесконечного антигена репертуара.

CAR Т-клетки инженерии против различных опухолевых антигенов показали доклинические эффективность и высокую обещание в клинике 6-9. В частности, в контексте GBM, ориентации АВТОМОБИЛЯ Т платформа клеток рецептор эпидермального фактора роста вариант III (EGFRvIII), мутация опухоли конкретных экспрессируется на клеточной поверхности 10, как было показано, продлить выживание в глиомы мышей, несущих 11. Несмотря на универсальность, однако, клиническая польза CAR приемной терапии не были полностью реализованы, отчасти из-за опухоли связано иммуносупрессии и иммунной уклонения 12-16, а также проблемы в установлении и поддержании антиген-специфические Т-клетки в живом организме. Используя стандарт медицинской помощи (SoC) с иммунотерапии потенциально может преодолеть некоторые из этих лимитации, приводит к повышению эффективности в обоих доклинических и клинических условиях.

SOC для Пострезекционные GBM состоит из высоких доз темозоломида (ТМЗ), ДНК алкилирующим агентом 17, и облучения всего головного мозга (ИВБ) 1. Эти процедуры, как предполагается, быть согласованы с противоопухолевых вакцин с помощью повышающей регуляции опухолевого МНС выражения 18-20 и пролития антигенов мертвых опухолевых клеток 17,19,21,22. Действительно, добавление ТМЗ 20,23 или 18,24 ИВБ приводит к повышенной противоопухолевой эффективности иммунных основе процедуры в доклинических настройки. Кроме того, как много неспецифических цитотоксических химиотерапевтических, ТМЗ, как известно, вызывают системное лимфопения 25,26, которые могут быть использованы в качестве средства принимающей кондиционирования для приемных платформ терапии 27-29. ТМЗ-опосредованной lymphodepletion было показано, что повышение частоты и функцию антиген-специфических Т-клеток, что приводит к увеличению эффективности в adopный платформа терапия против внутричерепных опухолей 30. В контексте CAR терапии, lymphodepletion служит в качестве средства для кондиционирования принимающей стороны и уменьшения количества эндогенного супрессоров Т-клеток 31 и индуцирующий пролиферацию гомеостатической 32 с помощью пониженном конкуренции за цитокинов 33, таким образом, повышение противоопухолевой активностью 11,34. Учитывая синергетический отношения между GBM ШОС и иммунотерапии платформ, оценивая новые приемных терапии и платформы вакцины в контексте ШОС имеет решающее значение для привлечения значимых выводов относительно эффективности.

В этом протоколе мы опишем метод генерации и внутривенного введения мышиных EGFRvIII-конкретного автомобиля Т-клеток наряду с TMZ и ИВБ в мышей, несущих EGFRvIII-положительные внутричерепных опухолей (рис 1 для лечения сроки). Вкратце, CAR Т-клетки сделаны экс естественных условиях на ретровируса трансдукции. Человек эмбриональной почки (НЕК) 293T клетки трансфицируют с использованием ДНК / липидный комплекс (содержащий вектор машину и PCL-Eco плазмиды), чтобы получить вирус, который затем используется для трансдукции активированных мышиных спленоцитов, которые собирали и культивировали в параллель. В ходе поколение автомобиля, мышиные хозяева, несущие EGFRvIII-положительные внутричерепных опухолей вводят фракционированного всего головного мозга рентгеновского излучения и системное лечение ТМЗ в дозах, сопоставимых с клинической SOC. CAR Т-клетки затем доставляются внутривенно lymphodepleted хозяев.

Следующая процедура описана в семи отдельных фаз: (1) Администрация Темозоламид для мышей с опухолями, (2) весь мозг Облучение опухоли мышей (3) трансфекции, (4) спленэктомия и Т-клеток Подготовка, (5 ) трансдукция, (6) Культура CAR Т-клеток и урожай, и (7) управление CAR Т-клеток в опухоли мышей. Эти фазы состоят из нескольких этапов, которые охватывают 6-7 дней и выполняются одновременно.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол основан на экспериментальной конструкции, где 10 мышей обрабатывают 10 7 CAR Т-клеток в каждой. Это означает, что 10 8 АВТОМОБИЛЯ Т-клетки будут необходимы; выход должен быть завышены 5 х 10 7 -1 × 10 8 для учета потери жизнеспособности. Следующий протокол масштабируется для получения примерно 200 х 10 6 клеток. Затем клетки вводили внутривенно женского C57BL / 6 мышей с 9-й день, установленных сингенных EGFRvIII-положительных внутричерепными опухолями, разработаны на основе существующих KR158B астроцитомы или В16 линий клеток меланомы. Одновременно с автомобилем Т поколения клеток, опухоль мышей вводят клинически значимых доз lymphodepletive ТМЗ (60 мг / кг) и Институтом Всемирного банка (16,5 Гр).

Мыши были сохранены и выращивают в свободных от патогенов условиях в Университете Дьюка Медицинского центра (DUMC). Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с процедурами, утвержденными Университета Дьюка институтааль Уход за животными и использование комитета (IACUC).

1. Администрация Темозоламид для мышей с опухолями

Дни от 0 до 4:

  1. Рассчитать общее количество мышей, который будет введен и умножить это на 0,5, чтобы определить объем ТМЗ решения, необходимого (например, 30 мышей х 0,5 мл = 15 мл ТМЗ) и добавить 1,5 мл до этого объема для учета перетекания (16,5 мл TMZ ).
  2. Умножьте это общий объем на 3 мг / мл для определения веса лиофилизированного TMZ необходимости (например, 16,5 х 3 = 49.5 мг ТМЗ). Взвешивание это в 50 мл коническую.
    ВНИМАНИЕ: ТМЗ является токсичным при вдыхании, попадании внутрь и контакте с глазами, кожей и слизистой оболочки. Проконсультируйтесь с охраны труда учреждения и / или окружающей среде, здоровья и благополучия отдела рекомендаций по снижению риска заражения.
  3. Умножьте общий объем на 0,15, чтобы определить объем диметилсульфоксида (ДМСО), которые необходимы (например, 16,5 х0,15 = 2,475 мл ДМСО). Фильтр стерилизовать такой объем ДМСО (плюс дополнительные 2 мл для учета трансмиссионные) через 0,2 мкм фильтр в стерильную пробирку. Добавить 2,475 мл стерильной ДМСО к порошку ТМЗ.
  4. Поместите раствор ТМЗ / ДМСО в химический стакан с водой над горячей плите при 65 ° С в течение 10-15 мин. После того, как ТМЗ полного растворения, раствор должен стать бледно-желтого цвета; Если раствор становится розовым, то ТМЗ ухудшается, и новое решение должно быть подготовлено со свежим много TMZ.
  5. Рассчитать соответствующий объем стерильного физиологического раствора, необходимого путем умножения 0,85 от общего объема (0,85 х 16,5 мл = 14,025 мл физиологического раствора). Добавить 15 мл стерильного физиологического раствора к 50 мл коническую. В то время как ТМЗ растворяется в ДМСО, тепла солевым раствором до 65 ° С.
  6. Вихревой / ДМСО раствора ТМЗ, чтобы гарантировать, что порошок ТМЗ полного растворения и медленно добавляют подогретое физиологический раствор в / ДМСО раствора ТМЗ.
  7. Сразу же после приготовления, полностью загрузить 15 х 1 мл туберкулина SyringES ТМЗ решения для введения 4 дня, установленного с опухолью мышей.
  8. Повторите эту процедуру в дни с 1 по 4 на общую сумму пять ТМЗ администраций.

2. весь мозг Облучение опухоли мышей

Дни со 2 по 4:

  1. Включите рентгеновского излучателя и дайте ему прогреться до полного напряжения. Убедитесь, что соответствующий фильтр на месте и ввода нужного напряжения и текущих настроек (Рисунок 2А).
    ПРИМЕЧАНИЕ: дозиметрии облучателя должны быть установлены заранее определить соответствующие параметры напряжения и сетка макета (2А, Б).
  2. Рассчитать продолжительность времени, которое необходимо, чтобы привести в 5,5 Гр рентгеновского облучения. Например, если Х-лучи доставляются в размере 2 Гр / мин, затем 2,75 мин необходимо доставить в общей сложности 5,5 Гр. Вход необходимости длительность.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В таблице 2 приведены мыши ИВБ дозыой их клинические эквиваленты в организме человека. В контексте высококачественных глиомы, 60 Гр фракционированию WBI (2 Гр фракции, 5 дней / неделю в течение 6 недель) является клинический стандарт медицинской помощи, и мышиный эквивалент, используемый здесь, 16,5 Гр (5,5 Гр х 3).
  3. Подготовка свежий раствор кетамина / ксилазина для системного анестезии путем добавления 2 мл кетамина и 1 мл ксилазина к 17 мл физиологического раствора таким образом, что конечный раствор 10 мг / мл кетамина и 1 мг / мл ксилазина.
  4. Взвешивание мышей и управлять 10 мкл кетамина / ксилазина внутрибрюшинно на грамм веса тела таким образом, что животные получали дозу кетамина в дозе 100 мг / кг и 10 мг / кг ксилазина. Мыши должны быть полностью в отключке и заметно дыхание в течение 2 мин кетамина администрации / ксилазина.
  5. Для поддержания глазной влаги в седативных животных, мягко втирать небольшое количество искусственных слез мази на каждый глаз.
  6. Поместите седации мышей на сетке, так что головки позиционируются в области, которая получает наибольшее рентгеновского излучения винтенсивность (фиг.2В, С). Щит органы от шеи вниз с соответствующим размером ведущую трубу, чтобы заблокировать системную доставку X-лучей (рис 2D).
  7. Поместите расположенные мышей под рентгеновского луча таким образом, что лазерный обозначающий фокус на рентгеновского пучка в начале координат (0,0) на макет сетки. Начните доставку X-Ray.
  8. При подаче Рентгеновский удалим животных от облучателя и место на теплую грелку. Не дом седации животных с сознательными животных, пока животные не восстановили достаточно сознания, чтобы сохранить грудины отдохновение. После того, как животные могут поддерживать грудины отдохновение, место сознательные животных обратно в их соответствующих клетках.
  9. Повторите эту процедуру на 3 и 4 на общую сумму три фракционированных доз радиации.

3. Трансфекция

День -1:

  1. Подготовка D10 носитель путем добавления 50 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) к 500 мл Дульбекко Мodified Eagle Medium (DMEM).
  2. Подготовка Т-клеток носитель (TCM), добавляя 5,5 мл L-глутамина, 5,5 мл пируват натрия, 5,5 мл несущественные аминокислоты и 5,5 мл pencillin / стрептомицин (ручка / стрептококк) с 500 мл среды RPMI-1640. Затем добавьте 550 мкл 2-меркаптоэтанола и 550 мкл гентамицина. И, наконец, добавляют 50 мл FBS.
  3. Урожай в пробирке, культивируемые клетки HEK293T и довести до концентрации 7,5 х 10 6 клеток / мл в D10 СМИ.
  4. Пластина 10 мл D10 медиа и добавьте 1 мл суспензии HEK293T клеток в каждом из 16 х 10 см поли-D-лизина (PDL) Плиты покрытием.
  5. Инкубируют в течение ночи при 37 ° С с 5% СО 2.

День 0:

  1. Замените носитель с 10 мл свежего D10, по крайней мере 30 минут до трансфекции клеток.
  2. Определить количество векторной плазмиды, PCL-Eco вектор, липосомной трансфекции реагента, необходимого для трансфекции путем умножения общего количества пластин + 1 (16 + 1 = 17) 14,1 мкгплазмидный вектор (14,1 х 17 = 239,7 мкг), 9,9 мкг PCL-Eco вектор (9,9 х 17 = 168,3 мкг) и 60 мкл липосомальной трансфекции реагента (60 х 17 = 1020 мкл). Все реагенты должны быть комнатной температуры перед приготовлением растворов.
  3. Этикетка две трубки А и В. В трубе А, добавьте 239,7 мкг векторной плазмиды и 168,3 мкг PCL-Eco вектора (1,5 х 17) мл, с пониженным содержанием сыворотки модифицированной среде орла (RS-MEM). В трубе Б, добавить 1020 мкл липосомальной трансфекции реагента (1,5 х 17) мл RS-MEM.
  4. Инкубируйте А и В по отдельности в течение 5 мин при комнатной температуре.
  5. Смешайте А и В вместе аккуратно (вихрь в течение 1-2 сек или инвертировать несколько раз) и инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре с образованием липидов / комплекса ДНК.
  6. Добавить липид / ДНК падение сложную стрелке, чтобы HEK293T клеток в 10 см блюдо.
  7. Выдержите при 37 ° С в течение 6-8 ч или на ночь (не более 24 ч).
  8. После 6-8 часов инкубации, заменить среду с 12 мл свежего TCM для вирусного производства. Это покрыло СМИбудет использоваться на 2-й день, как вирусный супернатант для Т-клеток трансдукции.

4. спленэктомия и Т клеточный препарат

День 0:

  1. Налейте 10 мл TCM в коническую 50 мл и место на льду для сбора селезенки.
  2. Жертвоприношение соответствующее количество животных СО 2 удушья и среднего обезглавливания: Место животных в клетке принимающей CO 2 при расходе 10-30% клетки объем / мин, в руководящих Американская ветеринарная медицинская ассоциация (не более 5 животных не может быть не приносится в жертву одновременно) до тех пор, дыхания прекращается и в течение двух минут после этого. Удалить животных из CO 2 камеры и обезглавить.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Один селезенка 6-12 недельных самок C57BL / 6 мыши получается примерно 4,5-5 х 10 7 спленоцитов. Здесь четыре селезенки будет собрано около 200 × 10 6 клеток.
  3. Положите мышь так, чтобы его правая сторона обращена вверх, испрей с 70% этанола. С помощью пинцета, возьмите тонкую складку кожи под левой грудной клетки и вырезать небольшой разрез с помощью ножниц. Отогните кожи, тщательно захватить тонкую складку брюшины щипцами, и вырезать небольшое углубление.
  4. Селезенка небольшой, удлиненные, темно-красный орган, который напоминает сплюснутый боб; деликатно захватить селезенки с пинцетом и акциза путем срезания окружающую соединительную ткань. Поместите вырезали селезенки в коническую, содержащей 10 мл TCM на льду.
  5. Налейте селезенки более сито сетка клетки 70 мкм с разбивкой по признаку пюре с тупым концом внутренней 5 мл шприц, чтобы создать один-клеточной суспензии. Не более двух селезенки должны быть разбиты на сито петли.
  6. Используйте небольшой объем TCM тщательно мыть сито следующий разбивку собрать все оставшиеся спленоцитов. Бассейн все разукрупненные селезенки в одной клеточной суспензии. Доведите конечного объема до 50 мл на один TCM стирки сбы вращаться на 300 мкг в течение 10 мин.
  7. Приготовьте раствор 1x буфера для лизиса путем добавления 5 мл буфера для лизиса 10x в 45 мл стерильной воды. Для устранения красных кровяных клеток, ресуспендируют осадок в 5 мл 1x буфера для лизиса в селезенке в 50 мл конические, хорошо перемешивая, осторожно пипеткой вверх и вниз. Если более 5 раздражительность, используйте 250 мл центрифужную пробирку. Поместите коническую центрифужную пробирку или в C водяной бане 37 ° С в течение 5 мин.
  8. Удалить реакцию лизиса из водяной бани и добавить TCM в соотношении 1: 1 с буфером для лизиса для нейтрализации реакции. Вымойте спиннинг в 300 мкг в течение 10 мин.
  9. Отберите супернатант и полностью ресуспендируют осадок в традиционной китайской медицине (2 мл / селезенка, 8 мл Всего за 4 селезенки) с помощью пипетки вверх и вниз.
  10. Количество клеток путем добавления 10 мкл клеточной суспензии в 190 мкл трипанового синего (1:20 разбавление). Умножьте полученную в одном из четырех сетчатых квадратов 20 х 10 4 х общего объема (8 мл) номер, чтобы получить общее количество клеток (например, 125 клеток х 20 х 10 4 х 8 мл = 200 х 10 6 спленоцитов).
  11. Развести клетки в концентрации 2 × 10 6 клеток / мл в TCM, с добавлением 2 мкг / мл конканавалин (ConA) и 50 МЕ / мл рекомбинантного человеческого интерлейкина-2 (чрИЛ-2). Таким образом, для 200 х 10 6 спленоцитов, добавить 92 мл средства массовой информации в 8 мл клеток, 200 мкг coña и 5000 МЕ рИЛ-2.
  12. Добавить 2 мл клеток в каждую лунку 24-луночных тканевых культур, обработанных пластин, таким образом, что 4 × 10 6 клетки в каждой лунке (например, 100 мл клеток потребуется примерно 4 пластины).
  13. Инкубируют в течение ночи при 37 ° С с 5% СО 2.

5. Трансдукция

День 1:

  1. Рассчитать количество не тканевой культуры рассматриваются 24-луночных планшетах, необходимые для трансдукции путем умножения количества селезенки собирали 2 (8 пластин, необходимых для 4 селезенки).
  2. Затем вычислите необходимый объем рекомбинантный фрагмент человеческого фибронектина решения (RHFF)необходим для покрытия пластин путем умножения (общее количество скважин + 3) х 0,5 мл (8 пластин х 24 скважины = 192 + 3 = 195) х 0,5 мл = 97,5 мл.
  3. Подготовьте 97,5 мл фосфатно-солевом буфере (PBS), содержащего RHFF в концентрации 25 мкг / мл путем умножения суммарного объема на 25 мкг (97,5 х 25 = 2437,5 мкг). Добавить такое количество RHFF 97,5 мл PBS.
  4. Шерсть без тканевой культуры обрабатывают 24-луночных планшетах путем добавления 0,5 мл PBS / RHFF решение на лунку.
  5. Инкубируют в течение ночи при 4 ° С.

День 2:

  1. Кузов раствор PBS / RHFF от не-культуре ткани обрабатывают 24-луночных планшетах.
  2. Добавить 1 мл / лунку 2% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в PBS и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин.
  3. Удалить BSA, крепко переворачивая плиту. Промыть добавлением 2 мл PBS.
  4. Сбор вируса супернатант перенос носитель из каждого HEK293T PDL пластины в 250 мл центрифужную пробирку и спин 10 мин при 500 х г.
  5. Тщательно передачи вируса SUpernatant в свежем 250 мл центрифужную пробирку, будучи уверенным, чтобы не нарушить клеточный осадок, которые могли образоваться.
  6. Добавить свежий TCM к вирусным супернатантом, так что конечный объем 3 мл больше, чем количество, необходимое для RHFF покрытием скважин. Например, для 192 скважин RHFF покрытием, довести объем вирусного супернатанта с 192 мл + 3 = 195 мл.
  7. Удалить культивируемые спленоциты из инкубатора и ресуспендируют, осторожно пипеткой вверх и вниз 2 - 3 раза в каждую лунку. Переход к 250 мл конической. При использовании многоканальной пипетки, используя стерильный резервуар перед передачей поможет ускорить этот шаг. Граф, как описано выше, и спина при 300 мкг в течение 10 мин.
  8. Добавить чрИЛ-2 вирусной супернатанта при концентрации 50 МЕ / мл. Например, добавьте 50 х 195 = 9750 МЕ чрИЛ-2 до 195 мл вирусной супернатант.
  9. Ресуспендируют спленоцитов вирусной супернатанта на 1 х 10 6 клеток / мл
  10. Добавить 1 мл / лунку спленоцитов суспензии RHFF покрытием 24-луночных планшетах.
  11. Спин в течение 90 мин в соответствии со следующими настройками: 770 мкг, ускорение = 4, тормоз / торможение = 0, 32 ° C.
  12. Подготовьте TCM решение с 50 МЕ / рИЛ-2 мл. Например, приготовить раствор 200 TCM добавлением 10000 МЕ чрИЛ-2. Добавить 1 мл рИЛ-2 / TCM в каждую лунку после центрифугирования.
  13. Культура в течение ночи при 37 ° С в 5% СО 2.

6. CAR Т-клеток Культура и урожай

Дни 3 и 4:

  1. Если Т-клетки достичь> 80% слияния, клетки могут быть разделены (обычно это происходит в день 3 или 4 день). Чтобы разделить клетки, осторожно пипеткой вверх и вниз в каждой лунке 2-3 раза, а двигаться 1 мл из каждой лунки в новые лунки свежего 24-луночного культурального-обработанной пластины. Затем добавляют 1 мл свежей TCM 50 МЕ / мл IL-2 в каждую лунку так, чтобы конечный объем составляет 2 мл во всех скважинах.
  2. Если клетки не достигают> 80% слияния, выполнить половину изменение медиа медленно пипетки с 1 мл среды из каждой лунки. Избегайте Disturbing клетки оседали на дно, удаляя СМИ. Добавить 1 мл свежей TCM, содержащей 50 МЕ / мл чрИЛ-2.

День 5:

  1. Ресуспендируйте CAR Т-клетки, осторожно пипеткой вверх и вниз 3 раза в каждую лунку и перенести в 250 мл центрифужную пробирку. Спин клетки при 300 мкг в течение 10 мин.
  2. Полностью аспирация супернатант, не нарушая гранул. Промывают один раз PBS, рассчитывать клеток, как описано ранее, и промывали PBS во второй раз. Типичный выход CAR Т-клеток составляет примерно 1 × 10 6 клеток на лунку (8 пластин х 24 скважин = 192 х 10 6 CAR Т-клетки).
  3. Ресуспендируют клеток в PBS в концентрации 5 х 10 7 / мл для инъекции 1 × 10 7 в объеме 200 мкг (например, для 192 × 10 6 CAR Т-клеток, ресуспендируют осадок промывали в 3,84 мл PBS).

7. CAR T Администрация ячейка мышей с опухолями

День 5:

  1. TranspoRT клетки на льду за животными для внутривенных инъекций. Добавить 500-1000 мкл в инсулиновый шприц с 27 - 31 г иглы, гарантируя, что все пузырьки исключен.
  2. Возьмите мыши в основание хвоста и разместить в трубе фиксатор.
  3. Потяните хвост в натянутом состоянии, с вены обращена вверх, и скользить иглу примерно 1-2 мм под кожу в вену, вставив его параллельно в хвостовую вену. Медленно высылать 200 мкл в вену. Если игла вставлена ​​правильно в вену, объем будет легко течь в; в противном случае будет сопротивление и игла должны быть удалены из хвоста и вновь установлена ​​правильно.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

CAR Т-клетки генерируются трансдукции ретровируса вектора EGFRvIII CAR 11. Этот вектор, MSGV1, был разработан на основе SFGtcLuc_ITE4 вектора 35, который содержит вирус мышиного стволовых клеток (MSCV) длинные концевые повторы, расширенный кляп область и конверт сайта сплайсинга (разъем доноров, SD, и сплайс-акцептор, SA) и вирусной сигнал упаковки (ψ). EGFRvIII АВТОМОБИЛЯ, содержащее человеческого анти-EGFRvIII вариабельный фрагмент одной цепи (ScFv) 139, в тандеме с мышиным CD8TM, CD28, 4-1BB и C...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Лечение график описано здесь был разработан, чтобы моделировать клинический стандарт медицинской помощи и использовать его последствий для автомобиля приемной терапии. CAR Т-клеток дозы, ТМЗ схемы, и администрация лучевая терапия могут быть изменены для повышения в естественных условиях Т активности клеток, lymphodepletion и опухоли убийства. ТМЗ схемы может быть увеличена, чтобы получить хост myeloablation и повышенную расширение адаптивно переданных элементов 30. Кроме того, lymphodepletive эффекты...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

Авторы хотели бы выразить признательность доктору Лоре Джонсон и доктору Ричарду Моргану за предоставление ретровирусной конструкции CAR. Авторы также благодарят Гяо Нгуэнь за помощь в дозиметрии для облучения всего мозга. Эта работа была поддержана грантом NIH NCI 1R01CA177476-01.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
pCL-Eco Упаковочный вектор для ретровирусаImgenex10045PВспомогательный вектор для генерации ретровируса CAR
Concanavalin ASigma AldrichC2010Неспецифический митоген для индукции пролиферации Т-клеток и вирусной трансдукции
РетронектинClonTech/TakaraT100BОблегчает ретровирусную трансдукцию Т-клеток
Lipofectamine 2000Life Technologies11668-019Реагент для трансфекции
DMEM, с высоким содержанием глюкозы, пируватLife technologies11995-065HEK293 питательные среды
RPMI 1640Life Technologies11875-093Питательные среды для T-клеток
Opti-MEM I Восстановленная сыворотка MediumLife technologies11058-021Трансфекционные среды
200 мМ L-глютаминLife technologies25030-081Т-клеточная культура
100 мМ ПируватLife technologies11360-070Т-клеточная культура
100X MEM Раствор заменимых аминокислотLife technologies11140-050Т-клеточная культура 55
мМ 2-меркаптоэтанолLife technologies21985-023Восстановитель для удаления свободных радикалов
Пенициллин-стрептомицин (10,000 U/ml)Life technologies15140-122Т-клеточная культурная добавка
Гентамицин (50 мг/мл)Life technologies15750-060Т-клеточная культурная добавка
GemCell U.S. Origin Фетальная бычья сывороткаGemini Bio Products100-500Обеспечивает факторы роста и питательные вещества для in vitro роста клеток
Бычья сыворотка Альбумин (BSA), фракция V– Стандартный сортGemini Bio Products700-100PБлокирует неспецифическое связывание ретровируса с пластинами, покрытыми ретронектином
Pharm Lyse (10x концентрат)BD Biosciences555899Лизирует эритроциты во время обработки спленоцитов
70 мкм; m Стерильные клеточные фильтрыCorning352350Отфильтровывает крупные частицы тканей во время обработки спленоцитов
100 мм Чашки для культур BioCoat с поли-D-лизиномCorning356469Способствует адгезии клеток HEK293 для максимизации пролиферации после трансфекции
[header]
TemozolomideBest PharmatechN/AЛиофилизированный порошок, приготовленный в день введения
ДиметилсульфоксидSigma Life SciencesD2650Необходим для полного растворения темозоломида
Физиологический растворHospiraIM 0132 (5/04)Растворитель для темозоломида и кетамина/ксилазина
Ketathesia HClHenry Schein Animal Health11695-0701-1Раствор кетамина
AnaSedLloyd IncN/AСтерильный раствор ксилазина 100 мг/мл
натрия

Ссылки

  1. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).
  2. Kantoff, P., Higano, C., Shore, N., Berger, E., Small, E. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer. N Engl J Med. (363), 411-422 (2010).
  3. Hodi, F. S., et al. Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma. N Engl J Med. 363 (8), 711-723 (2010).
  4. Schwartzentruber, D. J., et al. gp100 peptide vaccine and interleukin-2 in patients with advanced melanoma. N Engl J Med. 364 (22), 2119-2127 (2011).
  5. Gross, G., Gorochov, G., Waks, T., Eshhar, Z. Generation of effector T cells expressing chimeric T cell receptor with antibody type-specificity. Transplant Proc. 21 (1 Pt 1), 127-130 (1989).
  6. Pule, M. A., et al. Virus-specific T cells engineered to coexpress tumor-specific receptors: persistence and antitumor activity in individuals with neuroblastoma. Nat Med. 14 (11), 1264-1270 (2008).
  7. Kochenderfer, J. N., et al. B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19 chimeric-antigen-receptor-transduced T cells. Blood. 119 (12), 2709-2720 (2012).
  8. Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med. 365 (8), 725-733 (2011).
  9. Brentjens, R. J., et al. Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias. Blood. 118 (18), 4817-4828 (2011).
  10. Wikstrand, C. J., et al. Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas and malignant gliomas. Cancer Res. 55 (14), 3140-3148 (1995).
  11. Sampson, J. H., et al. EGFRvIII mCAR-modified T-cell therapy cures mice with established intracerebral glioma and generates host immunity against tumor-antigen loss. Clin Cancer Res. 20 (4), 972-984 (2014).
  12. Kuppner, M. C., Hamou, M. F., Sawamura, Y., Bodmer, S., de Tribolet, N. Inhibition of lymphocyte function by glioblastoma-derived transforming growth factor beta 2. J Neurosurg. 71 (2), 211-217 (1989).
  13. Wintterle, S., et al. Expression of the B7-related molecule B7-H1 by glioma cells: a potential mechanism of immune paralysis. Cancer Res. 63 (21), 7462-7467 (2003).
  14. Fecci, P. E., et al. Increased regulatory T-cell fraction amidst a diminished CD4 compartment explains cellular immune defects in patients with malignant glioma. Cancer Res. 66 (6), 3294-3302 (2006).
  15. Wilmotte, R., et al. B7-homolog 1 expression by human glioma: a new mechanism of immune evasion. Neuroreport. 16 (10), 1081-1085 (2005).
  16. Yang, B. C., et al. Mediation of enhanced transcription of the IL-10 gene in T cells, upon contact with human glioma cells, by fas signaling through a protein kinase A-independent pathway. Journal of Immunology. 171 (8), 3947-3954 (2003).
  17. Reilly, S. M., et al. Temozolomide: a new oral cytotoxic chemotherapeutic agent with promising activity against primary brain tumours. Eur J Cancer. 29A (7), 940-942 (1993).
  18. Newcomb, E., et al. The Combination of Ionizing Radiation and Peripheral Vaccination Produces Long-term Survival of Mice Bearing Established Invasive GL261Gliomas. Clin Cancer Res. 12, 4730-4737 (2006).
  19. Park, B., Yee, C., Lee, K. M. The effect of radiation on the immune response to cancers. Int J Mol Sci. 15 (1), 927-943 (2014).
  20. Fritzell, S., et al. Intratumoral temozolomide synergizes with immunotherapy in a T cell-dependent fashion. Cancer Immunol Immunother. 62 (9), 1463-1474 (2013).
  21. Park, S. D., et al. Cross-priming by temozolomide enhances antitumor immunity of dendritic cell vaccination in murine brain tumor model. Vaccine. 25 (17), 3485-3491 (2007).
  22. Emens, L. A., Jaffee, E. M. Leveraging the activity of tumor vaccines with cytotoxic chemotherapy. Cancer Res. 65 (18), 8059-8064 (2005).
  23. Murphy, K. A., et al. An in vivo immunotherapy screen of costimulatory molecules identifies Fc-OX40L as a potent reagent for the treatment of established murine gliomas. Clin Cancer Res. 18 (17), 4657-4668 (2012).
  24. Newcomb, E. W., et al. Radiotherapy enhances antitumor effect of anti-CD137 therapy in a mouse Glioma model. Radiat Res. 173 (4), 426-432 (2010).
  25. Su, Y. B., Krown, S. E., Livingston, P. O., Wolchok, J. D., Chapman, P. B. How lymphotoxic is dose-intensified temozolomide? The glioblastoma experience. J Clin Oncol. 23 (18), 4235-4236 (2005).
  26. Neyns, B., Tosoni, A., Hwu, W. J., Reardon, D. A. Dose-dense temozolomide regimens: antitumor activity, toxicity, and immunomodulatory effects. Cancer. 116 (12), 2868-2877 (2010).
  27. Muranski, P., et al. Increased intensity lymphodepletion and adoptive immunotherapy-how far can we go. Nat Clin Pract Oncol. 3 (12), 668-681 (2007).
  28. Wrzesinski, C., Restifo, N. P. Less is more: lymphodepletion followed by hematopoietic stem cell transplant augments adoptive T-cell-based anti-tumor immunotherapy. Current Opinion in Immunology. 17 (2), 195-201 (2005).
  29. Dudley, M. E., et al. Adoptive cell therapy for patients with metastatic melanoma: evaluation of intensive myeloablative chemoradiation preparative regimens. J Clin Oncol. 26 (32), 5233-5239 (2008).
  30. Sanchez-Perez, L. A., et al. Myeloablative Temozolomide Enhances CD8(+) T-Cell Responses to Vaccine and Is Required for Efficacy against Brain Tumors in Mice. Plos One. 8 (3), (2013).
  31. Su, Y. B., et al. Selective CD4+ lymphopenia in melanoma patients treated with temozolomide: a toxicity with therapeutic implications. J Clin Oncol. 22 (4), 610-616 (1200).
  32. Dummer, W., et al. T cell homeostatic proliferation elicits effective antitumor autoimmunity. J Clin Invest. 110 (2), 185-192 (2002).
  33. Gattinoni, L., et al. Removal of homeostatic cytokine sinks by lymphodepletion enhances the efficacy of adoptively transferred tumor-specific CD8+ T cells. J Exp Med. 202 (7), 907-912 (2005).
  34. Wrzesinski, C., et al. Increased intensity lymphodepletion enhances tumor treatment efficacy of adoptively transferred tumor-specific T cells. J Immunother. 33 (1), 1-7 (2010).
  35. Hughes, M. S., et al. Transfer of a TCR gene derived from a patient with a marked antitumor response conveys highly active T-cell effector functions. Hum Gene Ther. 16 (4), 457-472 (2005).
  36. Morgan, R. A., et al. Recognition of glioma stem cells by genetically modified T cells targeting EGFRvIII and development of adoptive cell therapy for glioma. Hum Gene Ther. 23 (10), 1043-1053 (2012).
  37. Kerkar, S. P., et al. Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies. J Immunother. 34 (4), 343-352 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Стандартная терапия глиобластомыоблучение с применением темозоломидаретровирусная трансдукцияинженерия Т-клеток мышитаргетирование антигена EGFRvIIIоблучение всего головного мозгапротокол кондиционирования реципиентаанализ методом проточной цитометрииадаптивная Т-клеточная терапия
Генерация CAR Т-клеток в усыновители терапии в контексте глиобластомы стандарт медицинской помощи
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.