Экспериментальная Глаукома индуцированная глазной инъекций магнитных микросфер

Краткое содержание

Мы представляем метод индуцирования повышенного внутриглазного давления (ВГД) путем введения магнитных микросфер в глаз крысы для моделирования глаукомы. Это приводит к сильному повышению давления и обширной гибели нейронов. Этот протокол прост в выполнении, не требует повторных инъекций и дает стабильные длительные подъемы ВГД.

Аннотация

Прогресс в понимании патофизиологии и предоставлении новых методов лечения глаукомы зависит от хороших животных моделей заболевания. Мы представляем здесь протокол повышения внутриглазного давления (ВГД) у крыс путем введения магнитных микросфер в переднюю камеру глаза. Использование магнитных частиц позволяет пользователю манипулировать шариками в иридокорнеальном угле, тем самым обеспечивая очень эффективную блокировку оттока жидкости из трабекулярной сетки. Это приводит к длительному повышению ВГД и, в конечном итоге, к гибели нейронов в слое ганглиозных клеток (GCL), а также к патологии зрительного нерва, как это наблюдается у пациентов с этим заболеванием. Этот метод прост в выполнении, так как для его совершенствования не требуется оборудование, специальные хирургические навыки или многочасовая практика. Кроме того, повышение давления очень надежное, и повторная инжекция магнитных микросфер обычно не требуется, в отличие от некоторых других моделей, использующих пластиковые шарики. Кроме того, мы считаем, что этот метод подходит для адаптации под мышиный глаз.

Введение

Первичная глаукома является разрушительной болезни глаз влияет оценкам 60500000 людей во всем мире ^1, что может привести к изменяющие жизнь потери зрения и слепоты ^2. Исследование механизмов заболевания и разработка новых терапевтических средств для лечения глаукомы, зависят от хороших моделей болезни, которая повторю некоторые из признаков патологии.

Мы представляем здесь модель крысы глаукомы на основе метода Samsel и др. ³ Общая цель этого метода состоит в повышении внутриглазного давления (ВГД) в глаза путем введения магнитных микросфер в переднюю камеру, и с помощью магнитного кольца, прямой их в передней камеры глаза углом. Это препятствует оттоку, что увеличивает ВГД, что приводит к повреждению нейронов и гибели клеток. Протокол был разработан, чтобы попытаться обеспечить более простой, индуцируемый модель глаукомы.

Этот протокол может иметь некоторые преимуществапо сравнению с существующими методами. Генетические модели мыши, такие, как DBA / 2J доступны, которые не требуют процедуры, чтобы инициировать; Однако они могут иметь непредсказуемый начало прогрессирования заболевания ^4. В отличие от этого, индуцируемые модели, большинство из которых опираются на хирургическое подъемные ВГД у грызунов, имеют то преимущество, что инициирование может управляться пользователем. Некоторые из этих методов может иметь недостатки самостоятельно однако, в том числе технически сложной ^5, и может потребоваться несколько процедур, чтобы поддерживать повышенным ВГД ^6.

В отличие от этого, индуцируемый метод подробно в этой рукописи простым, эффективным и воспроизводимым методом, который производит Стабильная, устойчивая увеличение давления, с минимальной потребностью для обратной закачки. Кроме того, он не предполагает дорогостоящего оборудования, и требует только основные хирургические навыки для выполнения. Этот протокол может быть целесообразным для читателей, которые хотят создать менее технически сложных индуцибельныйглаукома модель в своей лаборатории.

Протокол

Этика заявление: Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с уходу и использованию комитета Институциональная животных (IACUC), и они были одобрены в соответствии с руководящими принципами внутренних дел Великобритании ( http://goo.gl/FLkirW , в последний раз обращались 10 ^июня , 2014) и себе ARVO для использования животных в офтальмологических и Vision Research ( http://goo.gl/4LFOjD , в последний раз обращались 10 ^июня 2014 года).

1. глазной гипертензии индукции

1. Вызвать экспериментальной глаукомы путем повышения внутриглазного давления (ВГД) с помощью одностороннего введения парамагнитных микросфер в переднюю камеру Коричневый Норвегии крыс, основанный на методе Samsel и др. ³ Другие пигментированные крысы могут быть пригодны, но они должны быть проверены первый пользователем.
2. Дом 250-300 г женщинаэкс-селекционер Браун Норвегия крысы в постоянном условиях низкой освещенности (40-60 люкс) для сведения к минимуму суточные колебания ВГД ^7, с доступом к пище и воде вволю.
3. Возьмем измерения базовых IOP у бодрствующих животных ⁸ до анестезии и инъекции шарика, используя тонометр отскока калиброванный для использования в глаза крыс ^9. ВГД берется как среднее из пяти измерений.
4. Анестезировать крыс с 37,5 мг / кг кетамина и 0,25 мг гидрохлорида кг / медетомидина поставляемого внутрибрюшинно. Подтвердите глубины анестезии путем тестирования задние рефлексы ног животного, до йодповидон приложения (см шаг 1,5), и инъекции шарик (см шаг 1,8). Администрирование гидрохлорид пропаракаина 0,5% для обезболивания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не расширить зрачок на любом этапе. Это поможет шарики для урегулирования лучше в передней камеры глаза углом, и предотвращения связывания с объективом. Применить глазной мази, чтобы предотвратить роговицы сушки на неоперированного противоположной глаза.
5. Wпепел оперативную глаз с 5% повидон йода в воде ¹⁰ 5 мин до инъекции.
6. После 5 мин, фитиль повидон йод выключить, используя стерильную марлю и промыть глаза 0,9% стерильного физиологического раствора. Держите глаза влажные во время анестезии при регулярном применении стерильного физиологического раствора.
7. Поставьте тороидальный магнит вокруг глаз.
8. Вводят 25 мкл раствора, содержащего 30 мг / мл гамма-облучения стерилизованный 8 мкм магнитные микросферы Хэнка в сбалансированном солевом растворе (HBSS) в переднюю камеру, используя 33 г скошенную иглу.
   1. Для подготовки бусы, мыть с помощью повторного приостановления, то центрифугирования 3 раза при 10000 мкг в течение 5 мин с 1 мл HBSS, прежде чем принять окончательное 30 мг мл раствора /. Поддержание стерильных условий во всем.
   2. Для инъекций, будьте осторожны, чтобы избежать введения иглы в радужной оболочке, чтобы свести к минимуму риск диафрагмы травмы. Это можно предотвратить, ориентируясь иглу по касательной к поверхности роговицы, а параллельнодиафрагма, как это возможно. Это также поможет свести к минимуму потери шарик из места инъекции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вводите шарики с большой скоростью, чтобы обеспечить равномерное распределение вокруг передней камеры глаза углом, что имеет решающее значение для повышения ВГД. Кроме того, магазин бусин, иглы и магнитные кольца отдельно, чтобы шарики не образуют кластеры, что затрудняет их загрузить в шприц и впрыснуть, и игла не намагничивается.
9. Оставьте иглу на месте в течение 1 мин после инъекции для того, чтобы шарики поселиться в передней камеры глаза углом, чтобы воспрепятствовать водный дренаж из трабекулярной сети. Немного угол иглы после бисера изначально поселились, чтобы некоторые утечки водных, чтобы свести к минимуму кратковременное повышение ВГД. В конце операции промывки иглу через с первой фосфатным буферным раствором (PBS), а затем 70% -ным этанолом, а затем дистиллированной водой, чтобы обеспечить дальнейшее использование иглы в отдельных процедур. В качестве альтернативы, можно использоватьодноразовые иглы, если правильно калибра и шприц сочетание доступно. Дополнительно: иглы могут быть заточены с помощью станокТокарный продлить их использование.
10. На этом этапе, если это необходимо, уберите магнит, и с его помощью нарисуйте бусы в областях неполного охвата.
11. Оставьте магнит на месте вокруг глаз в течение еще 10 мин после инъекции, чтобы обеспечить гранулы оседают и в углу передней камеры глаза.
12. Обратный анестезии с использованием гидрохлорида 0,25 мг / кг atipemezole.
13. Администрирование хлорамфеникол, или другой антибиотик мазь, например гентамицином или террамицина местно, чтобы предотвратить инфекцию и 0,5% пропаракаина, гидрохлорид для обезболивания. Оставьте животных, чтобы восстановить на тепловой мат, пока они не восстановить движение, а затем перенести в теплом ящике и предложения с дополнительными питания, таких как пищевая добавка или смоченной обычной диете, пока восстановление не будет завершено. Системное или местное обезболивание должно быть уделено животных, отображающих признаки боли 24 ч после операции. Если Фесе симптомы сохраняются, несмотря на лечение, животные должны быть гуманно забито.
14. Используйте контралатеральной глаз, как неоперированных контроля.
15. Проведите измерения ВГД каждые 2-3 дней после введения борта, и каждые 2-3 дня после использования возвратным тонометром быть откалиброван для использования в глазе крысы ^9.
16. Критерии для включения глаза в учебе могут быть: если 1) ВГД повышается выше противоположной контроля давления в 5 мм рт.ст., и 2) не превышает 60 мм рт.
17. Глаза, где давление возвращается к исходному уровню (обычно 1 недели после инъекции) не должны быть включены в исследованиях, однако можно снова залить шарики в глазах, которые не при желании развивать высокую ВГД.
18. Эвтаназии животных СО ₂ удушья в конце эксперимента.
19. Проанализируйте глаза и зрительных нервов, и зафиксировать в 4% параформальдегида (PFA) в течение ночи для дальнейшего гистологического анализа.

2. Оценка нейрона сетчатки повреждения с помощью TUNEL SМодельный ряд

1. Для количественной оценки апоптоза клетки в целом горе retinasuse клеммной дезоксинуклеотидтрансферазу-опосредованной дУТФ ник-маркировка (TUNEL) анализа, в соответствии с инструкциями изготовителя.
2. Рассеките сетчатку от чашки глаз, промыть в течение 3 х 5 мин в 0,3% Triton X-100 в фосфатном буферном растворе (Т-PBS).
3. Проницаемыми ткани в 3% T-PBS в течение 2 часов.
4. Предварительно равновесие сетчатки в уравновешивающим буфером в течение 10 минут, перед инкубацией в TUNEL реакционного раствора в течение 1 ч при 37 ° С.
5. Вымойте ткань для 3 х 5 мин в 0,3% Т-PBS, промыть в 0,3% T-PBS, содержащий 5 мкМ DAPI, и телевизор с плоским установки в монтажных средств массовой информации.
6. Для количественной оценки TUNEL положительных ядер с помощью конфокальной микроскопии принять 10 мкм Z-стеки через ганглиозных клеток слоя при 20-кратным увеличением. Принимать 3 изображений на каждой из 4 лепестков, на участках, близких к зрительному нерву, в середине периферии, и на дальнем периферии сетчатки, что в общей сложности 12 изображений в целом Моунт, отбора проб приблизительно 7000 клеток. Морфологические критерии дискриминации ненейронных (эндотелиальных и глиальных) клеток от нервных клеток.
7. Выберите области для работы с изображениями, используя только DAPI канал, и маска следователей по группам лечения.

3. Оценка зрительного нерва повреждения с помощью толуидиновым синим окрашиванием

1. Исправить зрительные нервы в течение ночи в растворе Карновского в при 4 ° С.
2. Treat образцов в течение 2 ч в 1% (вес / объем) осмия, а затем обезвоживают в 100% -ном этаноле.
3. Выдержите зрительные нервы в окиси пропилена в течение 30 мин, и поместите в 50:50 оксида пропилена: ARALDITE ночь.
4. Изменение этого раствора до 100% Araldite с последующей инкубацией в течение ночи при 60 ° С.
5. Cut полутонких секции (толщиной 0,75 мм) и пятно с 1% толуидина синий / буры (ТБ) в 50% -ном этаноле до рассмотрения световой микроскопии.

4. Статистический анализ

1. Провести статистическую анализирует с помощью соответствующего пакета статистических программ. Двусторонний ANOVA с тестом после специальной Ньюмена-Keul может быть использована для расчета статистической значимости для IOP изменяется с течением времени.
2. Значение р менее 0,05 может быть значительными.

Результаты

Введение магнитных шариков в угол передней камеры глаза последовательно индуцирует длительную и надежную повышение давления (фиг.1), который был легко наблюдаемые в первой временной точке, 3 дня после инъекции. Кроме того, повышение давления поддерживают в течение всего периода эксперимента, и, хотя в наше время, конечно закончил в 18 дней после инъекции, другие сообщали, что давление сохраняется долгосрочный ^3. Среднее ВГД в среднем по всей длине эксперимента для контроля, не шарик впрыском глаз был 19,7 ± 0,3 мм рт.ст., по сравнению с 40,5 ± 2,8 мм рт.ст. для бортовых впрыском глаз (P <0,001). Кроме того, пик IOP увеличилась с 22,8 ± 0,3 мм рт.ст. до 49,9 ± 2,3 мм рт.

Чтобы определить, приводит ли повышение ВГД до смерти ганглиозных клеток сетчатки, мы провели TUNEL окрашивание на сетчатке, и гистологии на поперечных оптических секций нерва (рис 2). В сетчатке мы наблюдали увеличение TUNEL окрашивания (рис 2А) в бортовых впрыском глаз с повышенным ВГД. Количество апоптотических ядер вырос примерно в 15 раз, с 1,6 ± 0,5 клеток в контралатеральной управления, до 24,5 ± 0,5 клеток у больных гипертонической сетчатки (рис 2b; р <0,05). Кроме того, в глаза, в которые вводили магнитные шарики, но давление не увеличилось (вероятно, из-за неполного блокирования угла передней камеры глаза), количество TUNEL-положительных клеток существенно не отличались от тех, неинъецированных управления (р> 0,05). Это говорит о том, что гибель клеток связана с ростом давления, не из-за прямого токсического магнитных микросфер. Наконец, мы исследовали зрительного нерва патологии в модели глаукомы, и увидели накопление толуидиновым синим во многих аксонов, что указывает на дегенерацию этих клеточных процессов (фиг.2с).

Юр 1 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 52400 / 52400fig1highres.jpg "/>
Рисунок 1. Повышение внутриглазного давления с использованием магнитных микросфер. Введение магнитных микросфер в переднюю камеру вызывали надежные, значительное повышение внутриглазного давления (ВГД) в сравнении с противоположной контроля, неинъекционные глазами. Y-ось единиц = миллиметры ртутного столба (мм рт.ст.). Данные = средний ± SEM. * = P <0,001; N = 12. Эта цифра была изменена с Фокстон и др., Am. J. Pathol 182 (4):. 1379-1390.

Рисунок 2. Отметка ВГД путем инъекций магнитных микросфер в передней камеры глаза угол, индуцированной гибели нейронов в ганглиозных клеток слоя (GCL). () Типичные изображения сетчатки с контролем (слева) и глаукомы (справа) глаз окрашиваются по апоптоза ядер TUNEL (зеленый;белые стрелки) и DAPI (синий), что указывает на количество апоптотических ядер увеличилось IOP розы. (B) Количественная оценка TUNEL-позитивных клеток в GCL, показывая, что глаза с повышенным ВГД (в центре), имели значительно более апоптоза клеток по сравнению с управления (слева). В отличие от этого, в бортовых впрыском глаз, где давление не поднималась (справа), не наблюдалось значительное увеличение окрашивани TUNEL. Данные = средний ± SEM. * = P <0,05; N = 7 - 8 (C) Типичные изображения окрашивания зрительного нерва, демонстрируя увеличение толуидиновым синим накопления (черные стрелки) в поврежденных аксонов от глаукомы (справа), но не контролирует глаза (слева).. Масштабные полоски = 50 мкм. Эта цифра была изменена с Foxton и др., Am. J. Pathol 182 (4):. 1379-1390.

Обсуждение

Здесь показано, к способу индукции повышенным ВГД у крыс, путем введения магнитных микросфер в переднюю камеру глаза. Этот метод прост для выполнения, и не требует особой хирургической опыт, или часов практики и изысканности. Кроме того, эта процедура эффективна; редко требует более одной инъекции шариков, чтобы вызвать сильное, крепкое повышение давления (примерно 10% скорости закачки). Это может обеспечить преимущество над существующими индуцируемых методами, такими как технически сложной episceral вены склероза ¹¹ модели, или протокол коагуляция лазерный ^6, который может потребовать нескольких процедур, чтобы сохранить поднятые ВГД.

Для того, чтобы метод был успешным, однако, есть некоторые небольшие критические шаги, которые необходимо предпринять. Во-первых, это полезно использовать тороидальную-образный магнит, чтобы сделать шарики в угол передней камеры глаза. Этот шаг является модификацией оригинального протокола, порогае гранулы были введены в переднюю камеру, а затем перемещается от руки вокруг глаз ^3. С помощью тороидального магнита означает, что микросферы должны располагаться равномерно вокруг угла, требующий минимального ручного перераспределения. Во-вторых, скорость инъекции должна быть быстрой - слишком медленно и гранулы будут преимущественно накапливаются на одной стороне угла, что приводит к неполным охватом, и потенциально не повышения давления. Вообще говоря, хотя, метод достаточно прост, что пользователь может легко внести изменения в протокол, такие как изменение размера или объема частиц микросфер, возможно, попытаться изменить степень возвышения ВГД.

Тем не менее, один потенциальный недостаток метода в том, что один имеет мало контроля над степенью гипертонии, которые примерно в 5-10% случаев мы наблюдали возвышались над 60 мм рт. Чрезмерное поднимается ВГД может быть очень разрушительным для ткани сетчатки, и может сделать изучение механизмов и биологии клеточной смерти вызов. Тем не менее, этот метод производит последовательный нейронов патологии, как в сетчатки и зрительного нерва, который можно манипулировать фармакологически ^12. Это может сделать модель привлекательной для разработки новых терапевтических средств для лечения глаукомы. Кроме того, так как гранулы будут направлены в угол передней камеры глаза, это оставляет зрительной оси свободный для живых изображений сетчатки или диска зрительного нерва. Мы ожидаем, что эта модель будет адаптирована и для будущих применений в других видах, в том числе мыши.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
250 - 300 г самка коричневой норвежской экс-племенной крысы	Harlan UK	203
Tonolab Rebound Tonometer	Tiolat	TV02
Кетасет (кетамин)	Fort Dodge Animal Health	BN1000118	37,5 мг/кг
Domitor (медетомидина гидрохлорид)	Orion Pharma	140-999	0,25 мг/кг
Повидон йод	Ecolab	BN4369LE10	5% в H2O
Minim's Salt Solution	Bausch and Lomb	PL00033/5017
Тороидальный магнит	Supermagnete	R-10-07-03-N
Магнитные микросферы	Bangs Laboratories	UMC4N/9692
HBSS	Invitrogen	14025
33 G скошенная игла	Hamilton	7747-01	Шприц
иглой Люэра на заказ	Hamilton	80601
Antisedan (атипемезола гидрохлорид) Orion	Pharma	141-003	0,25 мг/кг
Мазь с хлорамфениколом	Medicom	18956-0005
TUNEL набор для окрашивания	Promega	G3250
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Vectashield монтажный носитель	Vector Labs	H-1000