Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

36.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52411

⸱

9 октября 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Liver Diseases, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Department of Otolaryngology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Division of Nephrology, Columbia University College of Physicians and Surgeons, 4Departments of Medicine, Hematology and Medical Oncology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Bobby R. Alford Department of Otolaryngology - Head and Neck Surgery, Baylor College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Хориоаллантоисная мембрана цыпленка (CAM) иммунодефицитна и сильно васкуляризирована, что делает ее естественной моделью роста опухоли и ангиогенеза in vivo. В этом протоколе мы описываем надежный метод выращивания трехмерных васкуляризированных опухолей гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) с использованием анализа CAM.

Аннотация

Хорионалантоисной мембрана (CAM) начинает развиваться на 7 день после оплодотворения и созревает день 12. САМ естественно иммунодефицитом и высокой васкуляризации, что делает его идеальной системой для имплантации опухоли. Кроме того, CAM содержит белки внеклеточного матрикса, таких как фибронектин, ламинин, коллаген, интегринового альфа (v) Beta3 и ММР-2, что делает его привлекательным модель для изучения опухолевой инвазии и метастазированию. Ученые давно воспользовались физиологии CAM, используя его в качестве модели ангиогенеза. Совсем недавно, САМ-анализ был изменен, чтобы работать, как в естественных условиях ксенотрансплантанта модельной системы для различных видов рака, что устраняет разрыв между основной работой в пробирке и более сложных моделях рака животное. Анализе САМ позволяет для изучения роста опухоли, противоопухолевых терапий, и про-опухолевых молекулярных путей в биологически соответствующей системы, которая одновременно экономически и время эффективным. Здесь мы опишем развитие CAM Xenograft модель гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) с эмбриональными выживаемости до 93% и надежной опухоли занимают ведущие к росту трехмерных, васкуляризированных опухолей.

Введение

Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) является 3-й ведущей причиной смертности от рака в мире 1. В настоящее время только 30% пациентов с ГЦК из имеют право на потенциально лечебных хирургических методов лечения 2 и системная химиотерапия не эффективна 3. Таким образом, существует настоятельная неудовлетворенная клиническая необходимость в новых ГЦК терапии, и развитие модельных систем, пригодных для эффективного тестирования новых агентов. Хорионалантоисной мембрана (CAM) анализ обеспечивает воспроизводимое, экономически эффективной, и быстрый метод средней пропускной тестирования потенциальных лекарств против опухолевых в естественных условиях.

САМ тест широко используется для изучения ангиогенеза 4. Это также успешно превратилась в модели ксенотрансплантата опухоли раковых заболеваний, в том числе глиобластомы 5, рак поджелудочной железы, меланомы 6 7-9 и 10-11 остеосаркомы. И в яйце 12 и экс ово13 методы были использованы в литературе, с деталями из различных протокола для протокола. Одна из основных задач в модели CAM ксенотрансплантанта является относительно высокий уровень эмбриональной смерти после манипуляций с яйцом, с опубликованным тарифам куриных эмбрионов смертности, начиная от 25 - 50 процентов 11-14.

В этой статье мы опишем разработку ин ово модели ксенотрансплантата ГЦК, которые надежно производит рост трехмерных, васкуляризированных опухолей, которые гистологически напоминают недифференцированные HCC. Мы адаптировали протокол, впервые описанного Ossowski соавт. 14 и добились куриных эмбриональных выживаемости до 93% с чрезвычайно высокой приживления опухоли.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Яйцо Инкубационный

  1. Получить 8 день старые конкретного патогена яиц с эмбрионами.
  2. Поместите яйца в яйца лоток вращения, штампованные концы вверх, и поместите поднос вращающийся внутри яичной инкубатора. Выдержите яйца в течение 48 ч при 36 ° С и 50% влажности.

2. Падение CAM и открытие яйца

  1. Соберите яйца из инкубатора. Место яйца в яйца стойки, штамп стороной вверх, и довести до ламинарный.
  2. Выключите в комнате и капот фары.
  3. Держите штамп конец яйца слегка яйца Кандлер подвергать сосудистой САМ, а также воздушный мешок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: яйцо Кандлер является источником света для визуализации развивающийся эмбрион и связанного воздушный мешок и сосудистую.
  4. Поставьте карандашом отметку в между двумя крупными кровеносными сосудами.
  5. Включите свет и использовать стерильные толчок булавку, чтобы сделать одно отверстие на кончике над воздушный мешок (отметка конца) яйца и одно отверстие в реncil знак. Не нажимайте нажимной штифт весь путь через; отверстие около 3 мм глубиной, как правило, достаточно.
  6. Выключите свет. Сожмите безопасности лампы, нажав открытый конец плотно к отверстию над воздушным мешком. Применить всасывания тянуть воздух в отверстие на карандаш марки, в результате чего САМ отказаться от оболочки на карандаш марки.
  7. Убедитесь, что воздушный мешок переехала из штампованной конце яйца в карандашом отмечены отверстие с помощью Candler. Если это не так, используйте толчок штифт, чтобы оба отверстия чуть глубже, а затем повторно применить всасывание с помощью безопасности лампу.
  8. Включить свет. Проведение яйцо в одной руке, включите Dremel вращающегося инструмента с 15/16 дюйма светотеневой колесо, прикрепленное и сделать два поперечных разрезов только достаточно глубоко, чтобы прорезать оболочку, но не достаточно глубоко, чтобы сократить весь путь вниз к депрессии CAM. Сделать разрезы около 2 см в длину и 1 см друг от друга. Сделайте разрезы достаточно широк, так что силиконовые кольца на 1 см в диаметре может пройти черезно тоньше, чем ширина стандартной скотча.
  9. Далее, чтобы сократить 1 между продольной и на концах двух поперечных разрезов, слегка касаясь отрезной круг к оболочке.
  10. Slide стерильного пинцета под оболочки элемента и параллельно к корпусу. Возьмите кусок раковины с пинцетом и удалить весь кусок чисто.
  11. Поместите скотч на вновь открытом окне, убедившись, что складывать один конец более на себе для простоты удаления.
  12. Место яйца в инкубаторе назад в яичном лотке (а не в вращающихся стоек яиц) до времени прививки.

3. Прививка

  1. Держите базальную мембрану белка смесь, например, матригеле, на льду (для предотвращения полимеризации) и место в шкафу.
  2. Использование 2 мМ ЭДТА, чтобы отделить клетки (4 - 5 мл на колбу Т75) и поместите в колбах культуры тканей инкубаторе в течение 5 мин.
  3. Ресуспендируют отдельные клетки в средствах массовой информации и рассчитывать с использованием гемоцитометра и трипановым синим. Используйте между 500000 тO 2000000 клеток для прививки на САМ, в зависимости от клеточной линии. Оптимизация нужное количество в предварительных экспериментах.
  4. Измерьте объем требуется для соответствующего числа клеток и центрифуге при 500g в течение 5 мин.
  5. Удалите супернатант и затем ресуспендируют осадок клеток в 40 μ л PBS ++ и 20 μ л базальной мембраны смеси.
    Примечание: В этот момент клетки могут лечить с помощью препаратов или других агентов испытаний при необходимости для экспериментов путем ресуспендирования клеток в / базальной мембраны смеси суспензии. Кроме того, агенты могут быть пипеткой на сотовый / базальной мембраны смеси суспензии после прививки.
  6. Получить яйцо стойку с яйцами из инкубатора и место в капюшоне ламинарного потока.
  7. Пил ленты от окна, получить 1 мм силиконовой кольцо с крышки криогенного флаконе с использованием стерилизованных пинцетом, и падение кольцо через окно.
  8. Внесите 60 μ л раствора ячейка PBS ++ и базальной мембраны Mixturе непосредственно в центре кольца силиконовой покоится на САМ.
  9. Re-лента окно и перейти яйцо стойку обратно в инкубатор. В этот момент, соблюдайте осторожность при перемещении яйца, как кольца и клеточной суспензии может легко стать перемещенными лицами.
  10. Разрешить опухоли расти в течение 5 до 7 дней.

4. Сбор Опухоли

  1. Место под-площадку в капот. Подготовка 35 х 10 мм пластин и ПАРАФОРМАЛЬДЕГИДОМ контейнеры по мере необходимости для гистологического исследования. Положите 1 мл PBS ++ в каждом 35 х 10 мм пластины.
  2. Поместите биологически опасных сумку в капот. Возьмите ножницы рассечение стерильные и вставьте заостренный конец в яйце в отверстие рядом с печатью конца.
  3. Сокращение вокруг всей яйца в продольном направлении.
    ПРИМЕЧАНИЕ: САМ, и опухоль с кольцом должны придерживаться верхней половине корпуса с окном.
  4. Использование рассечение ножницами и щипцами, рассекать опухоль от CAM и поместите опухоль в мм пластины 35 х 10. Измерьте и весят опухоли. Исправлены опухоли в paraformaldehyде, а затем парафин-вставлять их для использования в гистологии и иммуногистохимии экспериментов.

5. (Необязательно): опухоль сотовый Диссоциация

  1. Используйте рассечение ножницами, чтобы фарш опухоль в мм пластины 35 х 10. Налейте измельченным опухоль в 15 мл центрифужную пробирку и удалить столько PBS ++, как это возможно через пипетки.
  2. Добавляют 2 мл коллагеназы (1 мг / мл в PBS ++), повернуть трубку несколько раз, и инкубируют трубку при 37 ° С в течение не менее 30 мин (до нескольких часов).
  3. Добавьте 5 мл средства массовой информации в каждую пробирку и ресуспендируют тщательно с помощью пипетки вверх и вниз 20 - 40х. Тщательное пипетки является критическим для полной диссоциации клеток.
  4. Разрешить оседать, и передавать супернатант в новую пробирку. Центрифуга при 500 мкг в течение 5 мин. Удалить супернатант, оставляя позади диссоциированного гранул клеток.
    Примечание: В этот момент, клеточные осадки могут быть использованы для различных экспериментов (проточной цитометрии, лизиса для использования в вестерн-блоттинга, выделения РНК, и т.д.), Общее количество опухолевых клеток может быть также получено с помощью гемоцитометра и окрашивания трипановым синим. Следует отметить, что мелкие, овальные клетки клетки кур от CAM и не должны считаться опухолевых клеток. Там должно быть минимальное количество загрязняющих неопухолевые (САМ) клетки, если опухоль отсечен от CAM тщательно.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Представительства фотографии основных этапов в протоколе приведены здесь. 1А демонстрирует использование Кандлер визуализации развивающийся эмбрион, воздушный мешок, и сосудистую САМ. 1В-1С показывают процесс падения CAM путем два отверстия, а затем применяя отрицательное давление с помощью предохранительного лампы, а на рис 1D показывает успешно упала CAM с большим пузырем воздуха под карандаш отмечены отверстия. Рис 1E и рис 1...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Несколько ключевых шагов в этом протоколе, скорее всего, приходится улучшенной эмбрионального выживания, а также повышенной надежностью роста опухоли. Падение CAM от оболочки путем применения всасывания воздуха мешка менее агрессивна, чем другие существующие методы (с помощью иглы для удаления альбумина из яйца, тупым и т.д.). Используя стерильный толчок булавку, чтобы создать два маленьких отверстия, необходимые для этого метода является наиболее сложной частью протокола. Использование слишком много сил может привести ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

A.S. получает финансирование от фармацевтической компании Advaxis для поддержки клинического исследования, инициированного исследователем.

Благодарности

A.S. был частично поддержан грантами от Национальных институтов здравоохранения (NIH), Национального института стоматологических и черепно-лицевых исследований (5R03DE021741-02) и Национального института рака (1K08CA154963-01A1).

Медицинский институт Говарда Хьюза предоставил финансирование для M.L. через программу HHMI Medical Research Fellows.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Инкубированные яйца премиум-классаCharles RiverN/Ahttp://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx
Инкубаторы для яицGQFHova-Bator 2362N
Вращающиеся лотки для яицGQF1611 Автоматический переворачиватель
яиц Свечник для яицLyonHi-Power 950-070
Dremel 100 Поворотный инструмент с отрезным колесом 15/16Dremel100-N/7
Стерильные щипцы, булавка, ножницы для вскрытия, скотч
MatrigelBD Biosciences356234
Криогенные флаконы, наружная резьба с силиконовой шайбойCorning430659
Коллагеназа от Clostridium histolyticumSigmaC9891

Ссылки

  1. Sangiovanni, A., et al. Increased survival of cirrhotic patients with a hepatocellular carcinoma detected during surveillance. Gastroenterology. 126 (4), 1005-1014 (2004).
  2. Lopez, P. M., Villanueva, A., Llovet, J. M. Systematic review: evidence-based management of hepatocellular carcinoma--an updated analysis of randomized controlled trials. Aliment Pharmacol Ther. 23 (11), 1535-1547 (2006).
  3. Llovet, J. M., Burroughs, A., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 362 (9399), 1907-1917 (2003).
  4. Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent. J Natl Cancer Inst. 82, 4-6 (1990).
  5. Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).
  6. Dumartin, L., et al. Netrin-1 mediates early events in pancreatic adenocarcinoma progression, acting on tumor and endothelial cells. Gastroenterology. 138 (4), 1595-1606 (2010).
  7. Aguirre-Ghiso, J. A., Estrada, Y., Liu, D., Ossowski, L. ERK(MAPK) activity as a determinant of tumor growth and dormancy; regulation by p38(SAPK). Cancer Res. 63 (7), 1684-1695 (2003).
  8. Baroni, T. E., et al. Ribonomic and short hairpin RNA gene silencing methods to explore functional gene programs associated with tumor growth arrest. Methods Mol Biol. 383, 227-244 (2007).
  9. Lopez-Rivera, E., et al. Inducible nitric oxide synthase drives mTOR pathway activation and proliferation of human melanoma by reversible nitrosylation of TSC2. Cancer Res. 74 (4), 1067-1078 (2014).
  10. Balke, M., et al. A short-term in vivo model for giant cell tumor of bone. BMC Cancer. 11, 241(2011).
  11. Balke, M., et al. Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. BMC Res Notes. 3, 58(2010).
  12. Sys, G. M., et al. The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. J Vis Exp. (77), e50522(2013).
  13. Dohle, D. S., et al. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J Vis Exp. (33), (2009).
  14. Ossowski, L., Reich, E. Experimental model for quantitative study of metastasis. Cancer Res. 40 (7), 2300-2309 (1980).
  15. Ghanekar, A., Ahmed, S., Chen, K., Adeyi, O. Endothelial cells do not arise from tumor-initiating cells in human hepatocellular carcinoma. BMC Cancer. 13, 485(2013).
  16. Ho, J. W., et al. Effects of a novel immunomodulating agent, FTY720, on tumor growth and angiogenesis in hepatocellular carcinoma. Mol Cancer Ther. 4 (9), 1430-1438 (2005).
  17. Hagedorn, M., et al. VEGF coordinates interaction of pericytes and endothelial cells during vasculogenesis and experimental angiogenesis. Dev Dyn. 230 (1), 23-33 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.