Использование Cell-субстрата сопротивление и живых изображений сотовый измерить в реальном времени изменения в клеточной адгезии и Де адгезии, индуцированной Matrix модификации

Краткое содержание

Здесь мы приводим протокол постоянно количественно клеточной адгезии и де-адгезионные процессы с высоким временным разрешением в неинвазивным способом импедансными клеток-субстрат и изображений живых клеток анализов. Эти подходы выявить динамику клеточной адгезии / де адгезии процессов, вызванных модификацией матрицы и их временных отношений к адгезии зависит от сигнальных событий.

Аннотация

Cell-матрица адгезии играет ключевую роль в контроле клеточной морфологии и сигнализации. Стимулы, которые разрушают клетки-матрица адгезии (например, миелопероксидазы и другие матричные модифицирующие ферменты окислители / Наличие при воспалении) участвуют в вызове патологические изменения в клеточной функции, фенотип и жизнеспособность в ряде заболеваний. Здесь мы опишем, как сопротивление ячейки-субстрат и живые подходы изображений клетка может быть легко использована для получения точных количественных изменений в режиме реального времени в клеточной адгезии и де адгезии, вызванной модификации матрицы (с использованием эндотелиальных клеток и миелопероксидазы в патофизиологической матрицы, модифицирующие стимула) с высоким временным разрешением и в неинвазивным способом. Система сопротивление клеток подложки xCELLigence непрерывно количественно площадь клеток-матрицы адгезии путем измерения электрического импеданса на поверхности клетки с субстратом в клетках, выращенных на золотых массивов микроэлектродов. Анализ изображений в заданный промежуток времени дифферециал интерференционный контраст фильмы количественно изменения в области проекции отдельных клеток с течением времени, представляя изменения в области клеточной матрицы контакта. Оба метода точной количественной быстрые изменения в клеточной адгезии и де-адгезионных процессов. Cell-подложка сопротивление на микроэлектрод биосенсоров массивов обеспечивает платформу для измерений надежный, с высокой пропускной способностью. Изображений живых клеток анализирует обеспечить дополнительные сведения о характере и динамике морфологических изменений количественно измерения импеданса клетки с субстратом. Эти дополнительные подходы обеспечивают новые ценные знания о том, миелопероксидазы, катализируемых окислительной модификации субклеточных компонентов внеклеточного матрикса вызывает быстрые изменения в клеточной адгезии, морфологии и сигнализации в эндотелиальных клетках. Эти подходы также применимы для изучения динамики клеточной адгезии в ответ на другие матрицы, модифицирующие раздражителей и в смежных адгезивных клеток (например, эпителиальных клеток).

Введение

Стабильные клеевые контакты между клетками и их окружающей внеклеточного матрикса необходимы для поддержания гомеостаза ткани. Например, эндотелиальной клеточной адгезии к субэндотелиального матрицы в кровеносных сосудах играет важную роль в поддержании целостности эндотелия слоя и его гомеостаза функцию в качестве регулирующего, полу-проницаемой сосудистой барьер ^1. Актинового цитоскелета механически соединен с адгезивных молекул матрицы на участках клеток-матрицы адгезии и адгезионных контактов на границе ячейки матрицы играют важную роль в определении положения клеточной мембране с помощью сопротивление центрально-направленного актомиозинового растягивающие усилия. Внеклеточные стимулы, которые изменяют клетка-матрикс адгезии обязательно изменить баланс сил на границе ячейки матрицы, событие, которое быстро "почувствовал" по механо-чувствительных сигнальных белков, в результате чего в трансдукции "снаружи-внутрь сигнализации". Это перекрестные помехи ставкаWEEN клетки и окружающей их внеклеточный матрикс, играет ключевую роль в контроле формы клеток, подвижность, функцию, пролиферации и выживания ^2.

Разнообразные патофизиологических процессов (эмбриональное развитие, воспаления, заживления ран и метастазирования рака) характеризуются динамической реконструкции клейкой матричных субстратов матрикс окислителей и / или ферментов ^3,4. Например, клейкие субэндотелиальных матричные белки в кровеносных сосудах (например, фибронектин) участвуют в качестве основных целей для модификации или деградации при воспалительных заболеваниях человека из-за локализованного производства реактивных оксидантов (например, хлорноватистой кислоты, HOCl) на производный лейкоцитов фермента миелопероксидаза (MPO), который накапливается в субэндотелию при воспалительных сосудистых заболеваний (рис 1) ^5-9. Изменения в клеточной матрицы адгезии, вызванные МПО, полученных из окислителей и других матричных изменения раздражителей ЛикЭли, играют важную роль в изменении сосудистой гомеостаза во различных патологических процессов: например, путем изменения сигнализации эндотелиальных клеток, морфологии и жизнеспособности, который, в свою очередь возмущает функцию эндотелия и целостности барьера. Тем не менее, морфологические и клеточные ответы сигнализации прикрепленных клеток на внеклеточные изменения матричных только начинают понимать.

Чтобы понять, как изменения матричные езды изменения в динамике клеточной адгезии и адгезии зависит от клеточных сигнальных путей, методы требовали, чтобы точно определить их изменения в клеточной матрицы адгезии в режиме реального времени, с высоким временным разрешением. Здесь мы опишем дополнительную сопротивление клетки с субстратом и живыми методы визуализации клеток, которые отвечают этим критериям и обеспечить платформу для количественной оценки адгезии клеток и де-адгезионные процессы в неинвазивным способом.

Мы покажем, как эти импеданс клетки с субстратом и живая соответствую изображений клетокболи могут быть легко использованы для (I) отслеживать динамику прикрепление клеток и распространения (т.е. заново клеточной адгезии) на нативных и модифицированных матричных субстратов и (II), чтобы измерить динамику клеток-матрицы отряда (т.е. де-адгезии ) по прикрепленных клеток, подвергшихся воздействию матричных изменения стимулов. Система xCELLigence клеток подложки сопротивление биосенсор обеспечивает непрерывное измерение области клеточной матрицы контакте с количественной электрического импеданса на поверхности массивов золота микроэлектродов 96-луночных и выражает эти электрические измерения импеданса, как «индекс клеток", безразмерная величина, которая в значительной степени пропорционально площади клеточной подложки контакта ¹⁰ (рисунок 2), в то же время будучи чувствительным к изменениям среднего расстояния между (изолирующего) клеточной мембраны и поверхности электрода ^11. Дальнейшее увеличение значений индекса клеток достигается также при образовании плотного межклеточных контактов Тат ограничить парацеллюлярная течет ток, ¹¹ условий, которые не преобладают в экспериментах, описанных в данном исследовании. Измерение площади проекции отдельных клеток с течением времени путем анализа изображения в заданный промежуток времени дифференциально-интерференционного контраста (DIC) фильмы обеспечивает дополнительную меру изменений в области клеточной подложки контакта и обеспечивает дополнительную информацию о точной природе и динамике морфологические изменения в количественном подходом импеданса клетки с субстратом.

В частности, мы опишем применение этих подходов для мониторинга, как МПО-перекисного окисления клеевых субэндотелиальных матричных белков (например, фибронектин) (I) снижает De Novo адгезии взвешенных эндотелиальных клеток на очищенной фибронектина и (II) вызывает клеток матрицы де -adhesion в эндотелиальных клетках с установленным сцепления на фибронектина. Выполняя сигнализации параллельной клеток анализирует более времени, используя соответствующую Biochemческие анализы (например, Вестерн-блоттинга), временные и причинно-следственные связи между адгезии / де-адгезии процессов и связанных с ними изменений в клеточных сигнальных событий в зависимости от адгезии может быть определена.

Эти подходы были использованы недавно, чтобы продемонстрировать, что внеклеточный матрикс окисления катализируется субэндотелиальных месторождений MPO вызывает быструю потерю в клетки-матрицы адгезии эндотелиальных клеток, который приводится в уже существующих актомиозин сократительных сил ^9. Важно отметить, что, позволяя временную связь между изменениями как клеточной адгезии и адгезии зависимой клеточной сигнализации должны быть определены, эти подходы установлено, что МПО-индуцированной модификации матрицы и сотовой де-адгезия вызывает изменений в важных адгезии зависит от клеточных сигнальных путей, включая Src киназы -зависимой паксиллина фосфорилирования и легкой цепи миозина II фосфорилирования (рис 1) ^9. Этот режим окислительно-восстановительной зависит сигнализации, инвolving активацию внутриклеточных сигнальных событий внеклеточными окислительных реакций, которые разрушают клетки-матрикс адгезии, представляет роман режим клеточной сигнализации называют "вне-в окислительно-восстановительных сигнализации" (Рисунок 1) ^9.

В общем, эти комплементарной биосенсора клеток подложки сопротивление и живые клетки подходы изображений должно быть ценным в выявлении, как различные матричные модифицирующие агенты или раздражители привод изменения в динамике клеточной адгезии, морфологии и сигнализации в различных адгезивных типов клеток, подлежащих широкого спектра экспериментальные установки.

Следующий протокол описывает, как количественно оценить влияние МПО-опосредованной матрицы окисления на де Ново эндотелиальной клеточной адгезии (эксперимент 1) и эндотелиальных клеток-де-адгезии (эксперимент 2) процессов. МПО связывается жадно фибронектина и других клейких субэндотелиальных белков внеклеточного матрикса и насES перекись водорода (H ₂ O _2), чтобы конвертировать ионы хлорида (Cl ^-) к высокой реакционной хлорирования окислителя хлорноватистой кислоты (HOCl), который реагирует на местах с этих матричных белков и нарушает их адгезионные клетки свойствами (рис 1) ^{8,9, 12.}

Протокол

1. Общие эндотелиальных клеток Культура

1. Культура крупного рогатого скота: клетки эндотелия аорты (переходы 4-9) на покрытые желатином колбу с тканевой культурой (покрытие поверхности тканевой культуры с 0,1% вес / об желатин в PBS при комнатной температуре в течение 15 мин) в EGM-2 СМИ (с EGM-2 пули набор, содержащий 5% эмбриональной телячьей сыворотки, факторы роста и все дополнения, предоставленные производителем, для гидрокортизона, кроме).
2. Когда клетки являются почти сливающийся (около 3 дней после посева после 1: 4 раскола), урожай клеток путем обработки 0,05% вес / об трипсина / 0,02% вес / объем ЭДТА в PBS при 37 ° С. После большинство клеток были отключены, добавьте полные EGM-2 СМИ, чтобы утолить трипсина, а затем центрифуги (100 XG, 5 мин).
3. Подготовка клеток для исследований по де Ново адгезии эндотелиальных клеток к фибронектина (эксперимент 1: Раздел 2) и последующее де адгезии эндотелиальных клеток с установленным сцепления на этой подложке (эксперимент 2: раздел 3).
   1. Вымойте собираютКлетки один раз бессывороточной среде 199, содержащей 1% вес / объем бычьего сывороточного альбумина (BSA) и снова центрифуге (100 мкг, 5 мин).
   2. Повторное приостановить клеток в бессывороточной среде 199, содержащей 1% вес / объем BSA в 2,5 × 10 ⁵ клеток / мл (клетки измерения импеданса-подложки) или 5 × 10 ⁵ клеток / мл (изображений живых клеток анализы) и выдерживают при 37 ° С до использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: адгезионные ответы клетки очень чувствительны к температурным перепадам (например, из-за эффектов конвекции), так что все оборудование и решения используются для обработки и лечения клетки в течение следующих протоколов должны храниться при постоянной температуре 37 ° С.

2. Эксперимент 1: Количественная De Novo эндотелиальных клеток Сцепление на отечественных и MPO-окисленного фибронектина (Cell-подложка импеданс)

Примечание: Эксперимент 1 рассматривает степень, в которой МПО-опосредованного окисления фибронектина ухудшает его способность поддерживать заново Адгезии взвешенных эндотелиальных клеток.

1. Пальто фибронектин на 96-луночных золотых клетки с субстратом массивов сопротивление микроэлектродов. Добавить 80 мкл / лунку очищают бычий фибронектин на 5 мкг / мл в PBS, инкубируют в течение 2 ч при 37 ° С и удалить раствор.
2. Инкубируйте фибронектина покрытием поверхности с MPO, чтобы позволить связывание MPO к поверхностно св занному фибронектина. Добавить 80 мкл / лунку очищенного нейтрофилов человека МРО при 20 нМ в сбалансированном солевом растворе Хенкса (HBSS) и инкубируют в течение 0,5 ч при 37 ° С.
3. Вымойте поверхности дважды HBSS для удаления несвязанного MPO.
4. Добавить H ₂ O ₂ (0-10 мкМ конечная концентрация) в лунки микроэлектрода массива пластину, содержащую 80 мкл / лунку, чтобы инициировать HBSS MPO катализируемой, HOCl в зависимости от фибронектина к окислению и инкубируют в течение еще ​​0,5 ч при 37 ° С.
5. Для изучения влияния соответствующих ингибиторов или модуляторов МПО-катализируемых реакций (например, альтернативная МПО ферментасубстраты, ингибиторы ферментов или антиоксиданты; см ⁹ для деталей), добавить их в HBSS непосредственно перед H ₂ O ₂ сложения.
6. Через 0,5 ч, лечения поверхностей с метионином, чтобы утолить остаточных поверхностно-граница окисляющие видов, то есть реактивного белка связанного хлораминов, которые могут оказать смешанные клеточную активность. Добавить 10 мМ метионин в 80 мкл HBSS на лунку и инкубировали в течение 10 мин при 37 ° С.
7. Блок поверхности с BSA. Добавить 80 мкл / лунку BSA в 0,2% вес / объем в ФБР, инкубировали в течение 2 ч при 37 ° С и удалить раствор.
   Примечание: Остаточные непокрытые участки поверхности будет поддерживать клеточную адгезию и блокирование их с неклейкой белка (то есть, BSA) гарантирует, что клеточные ответы адгезии строго зависит от очищенного клеточного клей матрицы, используемой, в этом случае фибронектина.
8. Вымойте поверхности дважды HBSS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ни один из предыдущих поверхностных обработок значительно не влияет на клетки с субстратом читаешьGS.
9. Семенной подвесные эндотелиальные клетки (200 мкл / лунку при приблизительно 2,5 × 10 ⁵ клеток / мл, приготовленные в бессывороточной среде 199, содержащей 1% BSA, см 1,3) на родных или МПО-окисленных фибронектина покрытием поверхностей.
10. Сразу после посева клеток (т.е. до какого-либо прикрепление клеток и распространение), установите микроэлектродного массива пластину на инкубаторе порт (размещается в 37 ° C инкубаторе в присутствии 5% CO _2).
    1. Использование программного обеспечения прибора немедленно "пустым" чтение для нормализации последующего импеданса клеток-субстрат ("индекс клеток ') значения начальных фоновых значений, полученных в отсутствие клеточной адгезии.
    2. Инициировать приобретение непрерывных данных индекса клеток (минимум одной ячейки индекса чтения / мин).
11. Инкубируйте клетки при 37 ° С и 5% СО ₂ в течение 2 ч, период времени, в течение которого максимальное вложение клеток и распространение достигается; это отражено вна плато значений индекса клеток (рис 3а).
    ПРИМЕЧАНИЕ: предыдущий опыт (эксперимент 1) рассматривает, каким образом первоначальные МПО-перекисного окисления липидов фибронектина ограничивает способность эндотелиальных клеток, чтобы установить клеточную адгезию на этой подложке. Следующий эксперимент (эксперимент 2) рассматривает, как МПО-опосредованной фибронектин окисление способствует снижение в клеточной матрицы адгезии (т.е. де-покрытием) в эндотелиальных клетках с установленным адгезии к этой подложке. Лечение в этих двух экспериментов по существу идентичны, за исключением времени МПО-опосредованной фибронектина окисления, кроме (т.е. до клеточной адгезии - Эксперимент 1, после клеточной адгезии - Эксперимент 2).

3. Эксперимент 2: Количественная эндотелиальных клеток De адгезии из фибронектина в ответ на МПО-опосредованной фибронектина окисления (Cell-подложка сопротивление и живых изображений сотовый)

1. Пальто фибронектин на 96-луночного золото микроэлектродов аrrays для измерения клетки-подложки импеданса (добавить 80 мкл / лунку фибронектина на 5 мкг / мл в PBS и инкубировали в течение 2 часов при 37 ° С) или 35 мм стеклянным дном чашки для культивирования клеток для анализа изображений живых клеток (добавить 2 мл / блюдо из фибронектина на 5 мкг / мл в PBS и инкубировали в течение 2 часов при 37 ° С).
2. Блок поверхности с BSA. Добавить BSA в 0,2% вес / об в PBS в объемах, указанных в 3,1 и инкубируют в течение 2 ч при 37 ° С.
3. Инкубируйте поверхности с MPO, чтобы позволить связывание с фибронектином MPO. Добавить 20 нМ очищенного человеческого MPO в HBSS при объемах, указанных в 3,1 и инкубируют в течение 0,5 ч при 37 ° С.
4. Вымойте поверхности дважды HBSS для удаления несвязанного MPO.
5. Семенной подвесные эндотелиальные клетки (полученного в бессывороточной среде 199, содержащей 1% вес / объем BSA, см 1,3) на нативных или МПО-несущих поверхностей, покрытых фибронектином.
   1. Добавить 200 мкл / лунку в 2,5 × 10 ⁵ клеток / мл в 96-луночные клеток подложки массивов сопротивление микроэлектродов.
   2. Добавить 2 мл / чашку на 5 х 10 ⁵ клеток / мл до 35 мм стекла дном чашки для культивирования клеток.
6. Сразу же после посева клеток (то есть, до любого прикрепление клеток и распространение):
   1. Гора 96 а микроэлектрод массива пластины на клетки с субстратом сопротивление инкубатора порт (размещается в 37 ° C инкубаторе в присутствии 5% CO ₂₎ и принимает "пустые" показания, чтобы начать непрерывное получение данных индекса клеток (см Раздел 2.10 ).
   2. Передача 35 мм стекла дном чашки для культивирования клеток в 37 ° C инкубаторе в присутствии 5% СО _2.
7. Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение 2 ч, чтобы позволить прикрепление клеток и максимальный распространения (см раздел 2.11).
8. Кратко удалить (показания индекса пауза клеток в этой точке) на 96-луночный планшет микроэлектрод массив или 35 мм стекла дном клеток блюдо культуры от 37 ° С инкубатор, удаления клеточного супернатанта и добавить утепленные (37 ° C) ОБД (объемы, как рэ шаг 3.1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: HBSS используется при изучении МПО, катализируемых окислительных реакций вместо полной культуральной СМИ последний содержит окисляемых видов, которые мешают реакций окисления.
9. Для изучения влияния ингибиторов / модуляторы МПО-катализируемых реакций (альтернативных ферментных, ингибиторы АПФ или антиоксиданты) или ингибиторов клеточной сигнализации (например, 40 мкм blebbistatin ингибировать актомиозина сократимость), добавьте эти.
10. Сразу же место микроэлектрод массива пластину обратно в (показания индекса вновь приступят к ячейке на данный момент) на 37 ° C инкубатор порта или 35 мм стекла дном блюдо культуре клеток обратно в 37 ° C инкубатора и позволяют клеткам, чтобы уравновесить в HBSS в течение 0,5 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После 0,5 ч уравновешивания в HBSS, значения индекса клеток стабилизируется на уровне чуть более низкими значениями; при предварительной инкубации клеток с ферментные субстраты, и ингибиторов клеточной сигнализации или антиоксиданты, первый обеспечить тHESE существенно не влияет на значения, полученные после уравновешивания.
11. Инициировать МПО, катализируемых, HOCl-зависимую окисление фибронектина и де-адгезию.
    1. Для исследований импеданса клеток с использованием пластин микроэлектрод массива 96 а:
       1. Удалить Микроэлектрод блока плиты из инкубатора и пауза измерения индекса клеток.
       2. Добавить H ₂ O ₂ (конечная концентрация 0-10 мкМ) в HBSS и осторожно перемешать путем многократного пипетки.
       3. Сразу же, перемонтировать массив микроэлектродного обратно на 37 ° C инкубатора порт и вновь начать приобретение показаний индекса клеток.
    2. Для живых визуальных исследований клеток с использованием 35 мм стекло дном культуре клеток блюдо:
       1. Удалить культуры блюдо из инкубатора и смонтировать на 37 ° C нагретого стадии перевернутой конфокальной микроскопии, снабженную 63X воды объектива с подходящими ОПК оптики для записи живых клеток фильмы.
       2. Сосредоточьтесь на клетки иоптимизировать DIC оптики (Kohler освещение, задержка смещения и камеры смещения / усиления; подробнее см ^13).
       3. Инициировать DIC фильм и записать исходные показания с необработанными клетками в течение 1 мин.
       4. Добавить H ₂ O ₂ (конечная концентрация 0-10 мкм) и аккуратно перемешать путем многократного пипетки. Re-фокус микроскопа (при необходимости) и продолжить запись ОПК фильмы обработанных клеток на требуемый период времени.

4. Анализ и представление данных

1. Данные сопротивление Cell-подложка
   1. Экспорт необработанных данных (индекс в зависимости от времени клетка) в электронную таблицу.
   2. Для клеток де адгезии исследований (эксперимент 2: раздел 3), нормализуют данные путем установки значений, записанных непосредственно до начала MPO-опосредованной фибронектина окисления при значении 1 (то есть, непосредственно перед добавлением H ₂ O ₂ в 3,11 .1.1).
      Примечание: Это гарантирует, что относительнаяизменения в значениях индекса клеток, вызванными МПО-опосредованной фибронектина окисления не маскируется малых начальных различий в абсолютных значениях индекса клеток между скважинами.
      1. Представление данных в виде графиков нормализованного индекса клеток (Y-ось) от времени (ось х).
2. Данные изображений живых клеток (клеток-де-налипания исследования в эксперименте 2: раздел 3)
   1. Откройте DIC живого изображения клеток фильмы, записанные непосредственно до и после начала MPO-опосредованной фибронектина окисления в стандартной программе анализа изображения (например, ImageJ программного обеспечения).
   2. По крайней мере в двух отдельных ОПК фильмов случайным образом выбрать несколько ячеек и измерять их площадь проекции в виде последовательных кадров (например, в минутными интервалами 1) вручную прослеживая их мембраны край и количественной оценки количества закрытых пикселей.
   3. Экспорт необработанных данных (площадь проекции клеток в зависимости от времени) в таблицу Excel и нормализовать данные о площади клеток путем установки значений записываются непосредственно перединициирование МПО-опосредованной фибронектина окисления при значении 1 (то есть, непосредственно перед добавлением H ₂ O ₂ в 3.11.2.3).
   4. Представление данных в виде графика зависимости нормированного области клеток (ось у) от времени (ось х).

Результаты

В режиме реального времени количественная оценка эндотелиальных клеток-де-адгезии от фибронектина в ответ на МПО-опосредованной фибронектина окисления (эксперимент 2). Посева эндотелиальных клеточных суспензий на родном (МПО бесплатно) фибронектина или МПО, несущих фибронектина приводит к привязанности максимальной клеток и распространение течение 2 часов, о чем судили по на плато значений индекса клеток в клетки измерения импеданса подложки (фиг.3А). Этот начальный этап прикрепления кл...

Обсуждение

Cell-матрица адгезии и де-адгезионные процессы могут быть количественно точно в режиме реального времени с высоким временным разрешением, используя сопротивление клетки с субстратом и живого изображения клеток анализы. Эти реальном времени подходы обеспечивают большое преимущество над конечной точкой анализа клеточной адгезии, которые обеспечивают плохое временное разрешение. Благодаря точному количественного быстрого реагирования де-сцепления с высоким временным разрешением, эти анализы могут обеспечить критические пон...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
96 скважина золотая клетка-субстрат импедансная микроэлектродная матрица	ACEA Biosciences / Roche	E-Plate 96	одноразовая пластина, используемая для проведения клеточных анализов на системе xCELLigence
блеббистатин	Sigma	B0560	селективный ингибитор немышечных миозин-II
эндотелиальных клеток аорты крупного рогатого скота, криоконсервированный	Lonza	BW-6001
Бычий сывороточный альбумин	Sigma	05470
EGM-2 BulletKit	Lonza	CC-3162	набор питательных сред для эндотелиальных клеток
Фибронектин, лиофилизированный порошок	Sigma	F-4759	из плазмы крупного рогатого скота
Fluorodish 35 мм чашка для клеточной культуры со стеклянным дном	World Precision Instruments	FD35-100	Чашка для клеточной нарезки со стеклянным дном оптического качества для визуализации
желатина из кожи крупного рогатого скота	Sigma	G9391	субстрат клеточной культуры
Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14025076
перекиси водорода	Merck	107298
Medium-199	Life Technologies	11150-059	бессывороточная клеточная среда
Метионин	Sigma	M9500	гасит хлорирующие окислители, образующиеся на основе миелопероксидазы
, миелопероксидазы, полиморфноядерных лейкоцитов человека,	миллипор	475911
RTCA MP Instrument / xCELLigence система импеданса клеточного субстрата	ACEA Biosciences / Roche		состоит из анализатора RTCA, RTCA (многопланшетной) MP станции и блока управления RTCA
Trypsin-EDTA (0,5%)	Gibco	15400-054