Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Макрофагов Холестерин истощение и ее влияние на фагоцитоз

12.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52432

⸱

19 декабря 2014 г.

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics and Microbiology, Stony Brook University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье описан протокол заражения макрофагов Cryptococcus neoformans. Также объясняется метод истощения стеринов из макрофагов. Эти протоколы содержат руководство по изучению грибковых инфекций in vitro и изучению роли стеринов в таких инфекциях.

Аннотация

Криптококкоз является опасным для жизни инфекция, вызываемая патогенными грибами рода Cryptococcus. Заражение происходит при вдыхании спор, которые способны к репликации в глубоко в легкие. Фагоцитоз Cryptococcus макрофагами является одним из способов, что болезнь является возможность распространяться в центральной нервной системе, чтобы вызвать летальный менингоэнцефалит. Таким образом, изучение связи между Cryptococcus и макрофагов важно для понимания прогрессирование инфекции. Настоящее исследование описывает шаг за шагом протокол для изучения макрофагов инфекционность через С. neoformans в пробирке. Используя этот протокол, роль хозяина стеринов на хозяин-патоген взаимодействий изучается. Различные концентрации метил - циклодекстрина (MCD) были использованы, чтобы истощить холестерин из мышиного ретикулум саркомы макрофагов, как клетки линии J774A.1. Истощение Холестерин был подтвержден и количественно, используя как коммерчески availablе холестерина количественное комплект и тонкослойной хроматографии. Холестерин истощены клетки активировали с помощью липополисахарид (ЛПС) и гамма-интерферона (IFN,) и инфицировали антител опсонизированным Cryptococcus neoformans дикого типа H99 клеток при соотношении эффектор-к-цели 1: 1. Инфицированные клетки были проверены после 2 часов инкубации с С была рассчитана neoformans и их фагоцитарного индекса. Истощение Холестерин приводит к значительному снижению фагоцитарного индекса. Представленные протоколы предлагают удобный способ имитировать начало инфекционного процесса в лабораторных условиях и изучение роли хозяина липидного состава по инфекционной.

Введение

Фагоцитоз является процесс, при котором внеклеточные лица усваиваются клетками-хозяевами. Это основным оружием в арсенале иммунной системы к защите от патогенных микроорганизмов, но процесс часто может быть нарушена патогенами, чтобы обеспечить интернализации и распространяется по всему телу 1. Фагоцитоз опосредуется несколькими сигнальными событий, которые приводят в приложении и охвату через перестроек цитоскелета клетки-хозяина. Фагоциты «профессиональный» способны распознавать и связываться с опсонинов на поверхности вторжения возбудителя сигнал для крепления и формирования ламеллиподий, которые охватывают возбудителя и образовывать фагосомы 2. Среди так называемых "профессиональных" фагоцитов макрофаги. Макрофаги являются высоко специализированные клетки, которые выполняют защитные функции, которые включают в себя поиск и устранение возбудителей болезней, восстановления поврежденных тканей и посредничество воспаление, большинство изони в процессе фагоцитоза 1,2.

Cryptococcus neoformans является одним из видов патогенной дрожжей, что вызывает серьезное заболевание, известное как криптококкоз. Cryptococcus споры вдыхают хозяина и привести к легочной инфекции, которая, как правило, протекает бессимптомно. Считается, что воздействие чрезвычайно распространены; Образец 61 детей из детских инфекционных болезней клиники в Бронксе Ливан больницы Центра обнаружили, что все опрошенные были обнаружены антитела к криптококковым полисахарида глюкуроноксиломанну и других исследований показали, распространенность в обоих вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) неинфицированных и инфицированных взрослых 3, 4. альвеолярные макрофаги первая линия ответ на легких инфекции и в большинстве случаев успешно четкой возбудителя. Тем не менее, у ослабленных лиц (пациенты например, ВИЧ и СПИД) дрожжи способны выжить в макрофагах. В нихслучаях, макрофаги могут служить ниши для репликации возбудителя и может способствовать ее распространению в центральной нервной системе (ЦНС), где болезнь становится фатальным 5 - 8. Считается, что макрофаги могут даже доставить дрожжи непосредственно в мозговые оболочки, помогая дрожжи, чтобы пересечь гематоэнцефалический барьер с помощью "троянского коня" модели 3,9 - 11. Таким образом, важно понять процесс фагоцитоза и факторы, влияющие на это, особенно в криптококковых инфекций.

Предыдущая работа в других системах патогенных указывают на уровень холестерина и липидов плоты, образованных холестерина как имеющие важную роль в фагоцитозе 12 - 15. Холестерин является наиболее распространенным видом липидов в клетках млекопитающих и включает в себя 25 - 50% от млекопитающих клеточной мембраны 16. Было обнаружено, играют важную роль в модуляции BioPhysical свойства мембран, изменяя их жесткость 17. Холестерин и сфинголипидов вместе образуют липидные микродомены в пределах мембраны, известной как липидов плоты. Липидные плоты были обнаружены участвовать в образовании кавеол, а также обеспечивает изолированный домен для некоторых типов сигналов 16 - 18. Из-за их малого размера, что трудно изучить липидов плоты в естественных условиях. Один полезный способ изучения роли липидных плотах является изменение своих избирателей. Метил-β-циклодекстрин (MβCD) представляет собой соединение, которое было установлено, разрушают холестерин из мембран млекопитающих и обычно используется, чтобы исследовать роль липидов плоты 18.

В этом протоколе, мы представляем метод истощить холестерин из мембран клеток-хозяев, и количественно эффект истощения от способности клеток-хозяев фагоцитировать С neoformans в пробирке. Эта процедура делает использование культуры клеток TechniqЕЭС по иммортализованной макрофагов, как клеточной линии (J774A.1) в качестве модели для инфекции. Истощение Холестерин было достигнуто путем воздействия MβCD, который имеет гидрофобную сердцевину, относящуюся к размеру стеринов и способен действовать как поглотитель холестерина, чтобы сделать его из мембраны 19. Истощение Холестерин был измерен количественно с использованием коммерчески доступного набора и качественно, используя модифицированный Блай-Dyer экстракции липидов с последующим тонкослойной хроматографии (ТСХ) 20. . Фагоцитоз измеряли путем инфицирования клеточной линии с культурой опсонизированного дрожжей, смешанной с коктейлем интерферона-γ и липополисахарида для активации макрофагов Cryptococcus был опсонизированным использованием глюкуроноксиломанну (GXM) антитела 21 - 23. Окрашивание и микроскопия эксперименты позволили для визуализации клеток и расчета фагоцитарного индекса для оценки степени фагоцитоза. Взятые вместе, этот протокол describes основной метод, который интегрирует изменение липидного состава с физиологическим процессом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Холестерин Истощение J774A.1 клеток с MβCD

  1. В стерильной камере биологической безопасности, семена 10 5 J774A.1 макрофагами, как клетки на лунку на 96-луночный планшет для культивирования клеток в 200 мкл Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина / стрептомицина (P / S). Инкубируют при 37 ° С и 5% СО 2 O / N.
  2. Удалить носитель из клеточный монослой и промыть клетки дважды 1x фосфатным буферным раствором (PBS), который был фильтрованной или в автоклаве.
  3. Добавить 200 мкл раствора MβCD в нужной концентрации (10 мМ или 30 мМ в PBS) или 1X PBS в качестве контрол и инкубировали в течение 30 мин при 37 ° С при встряхивании. Удалить супернатант и резерв при комнатной температуре в течение количественного анализа с коммерчески доступного набора сразу же после процедуры.
  4. Вымойте клетки два-три раза с 1x PBS или свободного DMEM сыворотки и продолжить с инфекцией или LYSE клеток по pipettiнг 2:58 раз деионизированной H 2 O для анализа с тонкослойной хроматографии или с комплектом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После истощения холестерина в продаже комплект холестерина количественное могут быть использованы. Смотрите раздел Материалы для деталей. Следуйте инструкциям производителя, как написано.

2. Наблюдение содержании холестерина с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ)

  1. Промыть ТСХ бак дважды ацетоном и один раз раствором петролейный эфир: диэтиловый эфир: уксусную кислоту (65: 30: 1 по объему). Насыщение бак с петролейным эфиром: диэтиловый эфир: уксусна кислота (65: 30: 1 по объему) раствора и оставить O / N.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Органические растворители должны всегда использоваться под вытяжкой, во избежание вдыхания паров. Перчатки и халат нужно носить в любое время. Уксусная кислота является сильной кислотой и должны быть использованы с осторожностью.
  2. В стерильной камере биобезопасности, семян 10 6 J774A.1 макрофагами, как клетки на лунку на CE 6-аLL культуральный планшет в объеме 5 мл теплой DMEM с добавлением 10% FBS и 1% P / S. Инкубируют при 37 ° С, 5% СО 2 O / N.
  3. Разрушающим макрофаги холестерина, выполнив действия 1,2 - 1,4, подставляя 1 мл на 200 мкл, где это применимо для объяснения большого размера скважины.
  4. Добавить 500 мкл трипсина-ЭДТА в каждую лунку, инкубируют в течение 3 мин при 37 ° С и осторожно очистить клетки с клеточным скребком.
  5. Передача в пробирке и добавить дополнительные 500 мкл теплой DMEM с добавлением 10% FBS и 1% P / S.
  6. Спин клеток в течение 5 мин при 300 х г и удалить супернатант.
  7. Добавить дополнительные 500 мкл теплой DMEM с добавлением 10% FBS и 1% P / S к осадку клеток и ресуспендируют, осторожно пипеткой вверх и вниз.
  8. Удалить 10 мкл клеток и подсчета клеток на гемоцитометра. Нормализация клеточные концентрации от каждого образца и добавляют равное количество клеток в стеклянных трубках.
    Примечание: На этом этапе, можновыбрать комбинацию клеток из тех же лечебных группах, чтобы получить более концентрированный экстракт окончательное окисление липидов.
  9. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре и не извлекайте носитель.
  10. Добавить 2 мл метанола и вихря. Затем добавляют 1 мл хлороформа и вихря. Проверьте состояние фазы, что обеспечивает решение в Монофазные.
    Примечание: Трубки можно хранить при 4 ° CO / N.
  11. Центрифуга при 1700 х г в течение 10 мин при комнатной температуре и передавать супернатант в новую пробирку
  12. Добавить дополнительные 1 мл хлороформа, затем 1 мл дН 2 O. Вихревой два раза в течение 30 сек. Центрифуга при 1700 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
  13. Взвешивание стеклянную трубку на чувствительной баланса и использовать стекло пипетки Пастера перенести нижнюю фазу в стеклянную трубку с известной массой.
  14. Сухая вниз липидов в центробежной испарителя до сухого (примерно 2 часа). Взвесьте трубку с сушеными липидов и рассчитать сухой липидной массы.
    Примечание: Сухие липидов не могут быть сохранены в -20 ° С до готовности для выполнения ТСХ,
  15. Развести высушенные липиды в хлороформе достаточно, чтобы нормализовать концентрацию липидов (обычно 20 - 50 мкл) и нагрузки 20 мкл разбавленного липида на силикагеле ТСХ пластине. Нагрузка 20 мкг холестерина, разведенного в 20 мкл хлороформа в качестве стандарта.
  16. Добавить сушат пластины тонкослойной хроматограммы, насыщенного ТСХ резервуара и позволит растворитель для переноса до 1 см до края пластины. Удалить TLC пластинку из бака и дайте ему высохнуть около 5 мин.
  17. Представьте липидов путем размещения в йод бака паров и проверить миграцию. Удалить и разрешить пятна исчезают в течение 10 - 15 мин под капотом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Йод вдыханием. Всегда используйте под вытяжкой.
  18. Готовят раствор для окрашивания нейтрального липида путем объединения 60 мл метанола с 60 мл деионизированной H 2 O, 4 мл серной кислоты, и 630 мг хлорида марганца.
  19. Осторожно и медленно опустить пластинки ТСХ в нейтральное окрашивание липидов раствора в лоток и удалить без сбрасывая диоксида кремния лАйер.
    ПРИМЕЧАНИЕ: нейтральный раствор окрашивание липидов могут быть повторно использованы несколько раз, и поэтому он может быть извлечен из лотка и поместить обратно в бутылку для последующего использования.
  20. Разрешить пластина для сушки под капотом при комнатной температуре, пока все пузырьки не исчезнут. Тепло пластины тонкослойной хроматограммы на множестве тепла блока до 160 ° С и полукокса в желаемый цвет.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программа денситометрия, такие как видение Работы LS могут быть использованы для количественной оценки обугленные полосы сравнить образцы липидов.

3. Заражение макрофагов с С. neoformans (H99)

  1. В стерильной камере биологической безопасности, семена 10 5 макрофагов как клеток на лунку на 96-луночный планшет для культивирования клеток в 200 мкл среды DMEM с добавлением 10% FBS и 1% P / S. Инкубируют при 37 ° С, 5% СО 2, 5% СО 2 O / N.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инфекция также может быть сделано в стекле дном конфокальной блюда для облегчения визуализации; Все суммы остаются одинаковыми.
  2. Вырастить культуры C. neoformans (H99)путем инокуляции 10 мл YNB с одной колонии, полученной из пораженный пластины и инкубации его O / N при 30 ° C при встряхивании.
  3. Вымойте и рассчитывать C. neoformans (H99) клетки.
    1. Центрифуга C. neoformans O / N культуры в 1700 мкг в течение 10 мин при 4 ° С.
    2. Удалить СМИ и выбросить. Промыть клетки с 5 мл 1x PBS. Центрифуга при 1700 мкг в течение 10 мин при 4 ° С.
    3. Удалить PBS и промывают 5 мл фильтрованной 1x PBS. Центрифуга при 1700 мкг в течение 10 мин при 4 ° С. Повторите этот шаг еще 2 раза.
    4. Удалить PBS и ресуспендируют в 5 мл 1x PBS.
    5. Сделать серийное разведение в PBS, чтобы получить разведение 1: 500 из промытого культуры.
      1. Добавить 100 мкл исходного образца с 900 мкл 1х PBS, чтобы получить разбавление 1:10.
      2. Добавить 100 мкл 1:10 разбавленной пробы 900 мкл 1x PBS, чтобы получить 1: 100 разведения.
      3. Добавить 200 мкл 1: 100 разведенного образца до 800 мкл 1х PBS с получением 1: 500 dilutiна
    6. Возьмите 10 мкл 1: 500 разбавления и рассчитывать на гемоцитометра для подсчета числа клеток.
  4. Подготовка рабочего раствора для активации макрофагов и opsonizing С neoformans.
    1. Развести LPS и IFN, 100x из маточных растворов путем добавления 10 мкл 990 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: LPS и IFN, используются для улучшения фагоцитарную поглощение, но не являются обязательными для фагоцитоза. Если есть интерес к фунгицидной активности макрофагов, выполнить активацию O / N при 37 ° С при встряхивании до заражения.
    2. На образец объединить 7,5 мкл разбавленных LPS, 1,25 мкл разбавленного IFN & gamma;, 1,25 мкл антител и GXM объем С neoformans культура, которая дает 1,25 х 10 5 клеток. Доведите объем до 250 мкл, умноженное на число образцов с DMEM с добавлением 10% FBS и 1% P / S.
    3. Вихревой и инкубировать решение в течение 20 мин при 37 ° С при встряхивании.
      ПРИМЕЧАНИЕ:Холестерин истощение (шаги 1,2 - 1,4), может быть сделано одновременно с шагом опсонизация. Будьте уверены, чтобы лечить макрофаги до объединения рабочего раствора, так как опсонированных клетки оптимально следует использовать не более 20 мин, после стадии 3.4.3 инкубации.
  5. Инфекция макрофаги
    1. Вымойте макрофаги дважды с бесплатным DMEM сыворотки и добавьте 200 мкл опсонизированного С neoformans рабочего раствора в каждую лунку.
    2. Инкубируют в течение 2 часов при 37 ° С.
  6. Fix и пятна Клетки
    1. Удалить СМИ и мыть клетки 2 раза DMEM.
    2. Воздух сухой клеточный монослой в течение 10 мин и добавляют 200 мкл охлажденного льдом метанола, чтобы зафиксировать клетки.
    3. Выдержите в течение 15 мин при комнатной температуре и удалить все оставшиеся метанол.
    4. Добавить 200 мкл 10Х Гимза и инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре.
    5. Вымойте 2 - 3 раза дистиллированной водой и высушить O / N с шапку.
      Примечание: изображений может быть сделано на следующий день или до недели followiнг окрашивание.
  7. Визуализация и граф
    1. С помощью микроскопа, рассчитывать 300 клеток на точке данных (если есть 2 из той же обработке рассчитывать 150 на лунку) и обратите внимание на количество зараженных макрофагов и количество поглощенных клеток Cryptococcus.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения равномерного отбора проб за использование точки данных 2 пластины в состоянии, выбрать 3 непересекающихся областей на чашку и считать 50 клеток на области.
    2. Рассчитать фагоцитарную индекс путем умножения процент инфицированных макрофагах среднего числа С neoformans в макрофагах. Нормализация фагоцитарную индекс, выражающий ценности, как процент от 1x PBS лечить контроль. После нескольких попыток вычислить среднее значение и стандартное отклонение от среднего значения для определения тенденций в фагоцитарного индекса. Используйте Стьюдента-тест, чтобы определить значение.
    3. Возьмите микрофотографии клеток в 1,000X или 400X увеличении.

4. трипанового синего

  1. В стерильной камере биологической безопасности, семена 10 6 макрофагами, как клетки на лунку на 6-луночный культуральный планшет в объеме 5 мл минимальной необходимой среде Игла (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллина / стрептомицина , Инкубируют при 37 ° С, 5% СО 2 O / N.
  2. Разрушающим макрофаги холестерина, выполнив действия 1,2 - 1,4 подставляя 2 мл на 200 мкл, где это применимо для объяснения большого размера скважины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте включить контроль, обработанный 1x PBS, а в качестве контроля, который Царапины до какого-либо лечения.
  3. Добавить 500 мкл 1х PBS в каждую лунку и осторожно очистить клетки с клеточным скребком. Трансфер в пробирке и приостановить клетки осторожно пипеткой вверх и вниз.
  4. Удалить 10 мкл клеток и пятна с 1 мкл 4% трипанового синего.
  5. Количество клеток на гемоцитометра и рассчитать жизнеспособность с помощью следующего уравнения:% Жизнеспособность = [1 - (синий клеток / клеток всего)]Х 100. Значения нормализовать управления, который был лечить. После нескольких попыток вычислить среднее значение и стандартное отклонение, чтобы определить тенденции в жизнеспособности. Используйте Стьюдента-тест, чтобы определить значение.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Холестерин Истощение

Анализ супернатанта защищены в шаге 1.3 протокола в соответствии с инструкциями изготовителя в Холестерин набор для анализа Amplex Красной дает повышенное содержание холестерина в MβCD обработанного образца по сравнению с контролем 1x PBS. В зависимости от типа клеток и используемого концентрация MβCD истощения холестерина может изменяться. Для J774, обработанной 10 мМ MβCD, наблюдалось истощение примерно на 50%. Истощение может быть вычислена с использованием значений, пол...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В работе с этим протоколом важно, чтобы получить точные числа клеток при покрытие клетки млекопитающих и opsonizing С neoformans клеток. Это сводит к минимуму различия между испытаний и обеспечивает точную 1: 1 цель соотношение эффектора на протяжении всего исследования. Важно также, чтобы координировать синхронизацию с истощением холестерина и инфекции, чтобы предотвратить опсонированных дрожжевых клеток, или лечение макрофагов клетки от отдыха при комнатной температуре в период между процедурами. Длительные п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана NIH гранты AI56168, AI71142, AI87541 и AI100631 для MDP. Маурицио дель Поэта является Burroughs Wellcome Следователь по инфекционным болезням.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Класс II тип A2 Шкаф биобезопасностиLabconco3460009
J774A.1 клеточной линииATCCTIB-67поставляется в замороженном виде. Смотрите инструкции ATCC по выращиванию.
Дульбекко s Модифицированный Eagle MediumGibco11995-065Магазин в 4 ° С и прогреть до 37°С; C Перед применением
HI Фетальная бычья сыворотка Performance PlusGibco10082-147Хранить в замороженном виде при температуре -20 °°С; C и размораживание перед добавлением в DMEM
пенициллин-стрептомицин (10 000 ЕД/мл)Gibco15140-122Используется для питания
инкубатора клеточных культур DMEM IsotempFisher ScientificModel # 3530
96-луночная чашка для культивированияCorning Inc. Costar3595
10x Фосфат буферизованный физиологический растворFisher Scientific BioReagentsBP3994Разбавьте до 1x и отфильтруйте или отфильтруйте в автоклаве перед использованием.
Метил-&бета;-циклодекстринSigma Life ScienceC4555-10GРастворить в 1x PBS для получения растворов концентраций 10 мМ и 30 мМ
Орбитальный шейкерLabline
Amplex Набор для анализа красного холестеринаLife Technologies Молекулярные зондыA12216Все реагенты для анализа холестерина содержатся в наборе. Следуйте инструкциям производителя.
96-луночная черная пробирная пластинаCorning Inc. Costar3603
Считыватель микропланшетов FilterMaxМолекулярные устройстваМодель F5
Камера TLCSigma-AldrichZ126195-1EA
ХлороформSigma-Aldrich650498-4L
МетанолSigma-Aldrich34860-2L-R
TLC БумагаВатман3030917Уменьшен до размера, необходимого для
вытяжного шкафаЛюбой вытяжной шкаф, соответствующий стандартам AIHA/ANSI
6-луночный планшетCorning Inc.Costar 3506
Trypsin-EDTAGibco25300-054
Скребок для клетокCorning Inc. Costar3010
ГемоцитометрHausser Scientific1490
ЦентрифугаBeckman CoulterМодель Alegra x-30R
Votex миксерFisher Scientific12-812
BalanceMettler ToledoМодель # MS104S измеряет до 0,1 мг
Стеклянная пипетка ПастераFisherbrand13-678-20A
ХолестеринAvanti Polar Lipids700000
Концентратор SpeedVacThermo ScientificModel # SPD2010
Петролейный эфирFisher ScientificE139-1
Диэтиловый эфирSigma-Aldrich309966
Уксусная кислотаSigma-Aldrich320099
TLC Silica Gel 60 с зоной концентрацииАналитическая хроматография Millipore1.11845.0001
Йодная крошкаSigma-Aldrich376558-50G
Серная кислотаSigma-Aldrich320501
хлорид марганцаSigma-Aldrich244589
UVP EC3 Imaging SystemUltra-Violet Products Ltd.Используйте программное обеспечение Vision Works LS для денситометрического анализа
Стеклянная конфокальная чашка с дномMatTekP35G-1.5-10Cwww.glassbottomdishes.com
Cryptococcus neoformans (H99)Получено в Медицинском центре Университета Дьюка
YNBBD239210Инструкции по приготовлению см. у производителя. Используйте концентрацию глюкозы 20 г/л.
ЛипополисахаридSigmaL4391-1MGРастворите в 1x PBS до получения 1 мг/мл бульона. Хранить при температуре -20 °C.
Интерферон гаммаSigmaI4777Растворить в 1x PBS для получения 0,1 мг/мл стокового раствора
Антитело к глюкуроноксиломаннану (анти-GXM)Подарок от лаборатории Артуро Касадеваля концентрация составляет 1,98 мг/мл
GiemsaMP Biomedicals194591Растворить 0,8 г Giemsa в 25 мл глицерина и нагреть до 60 °°; C в течение 1 ч. Добавьте в раствор 25 мл метанола и дайте состариться при комнатной температуре не менее 1 месяца.
МикроскопZeissObserver.D1 Микроскоп с AxioCam MRm для съемки
TLC

Ссылки

  1. Sarantis, H., Grinstein, S. Subversion of phagocytosis for pathogen survival. Cell Host & Microbe. 12 (4), 419-431 (2012).
  2. Rougerie, P., Miskolci, V., Cox, D. Generation Of Membrane Structures During Phagocytosis And Chemotaxis Of Macrophages: Role And Regulation Of The Actin Cytoskeleton. Immunological Reviews. 256 (1), 222-239 (1111).
  3. Liu, T., Perlin, D. S., Xue, C. Molecular Mechanisms Of Cryptococcal Meningitis. Virulence. 3, 173(2012).
  4. Abadi, J., Pirofski, L. A Antibodies Reactive With The Cryptococcal Capsular Polysaccharide Glucuronoxylomannan Are Present In Sera From Children With And Without Human Immunodeficiency Virus Infection. The Journal Of Infectious Diseases. 180 (3), 915-919 (1999).
  5. Kechichian, T. B., Shea, J., Del Poeta, M. Depletion Of Alveolar Macrophages Decreases The Dissemination Of A Glucosylceramide-Deficient Mutant Of Cryptococcus Neoformans In Immunodeficient Mice. Infection And Immunity. 75 (10), 4792-4798 (2007).
  6. Casadevall, A. Cryptococci At The Brain Gate: Break And Enter Or Use A Trojan Horse. The Journal Of Clinical Investigation. 120 (5), 1389-1692 (1172).
  7. Chrétien, F., et al. Pathogenesis Of Cerebral Cryptococcus Neoformans Infection After Fungemia. The Journal Of Infectious Diseases. 186 (4), 522-530 (2002).
  8. Luberto, C., Martinez-Mariño, B., et al. Identification Of App1 As A Regulator Of Phagocytosis And Virulence Of Cryptococcus Neoformans. The Journal Of Clinical Investigation. 112 (7), 1080-1094 (1172).
  9. Mcquiston, T. J., Williamson, P. R. Paradoxical Roles Of Alveolar Macrophages In The Host Response To Cryptococcus Neoformans. Journal Of Infection And Chemotherapy: Official Journal Of The Japan Society Of Chemotherapy. 18 (1), 1-9 (2012).
  10. García-Rodas, R., Zaragoza, O. Catch Me If You Can: Phagocytosis And Killing Avoidance By Cryptococcus Neoformans. FEMS Immunology And Medical Microbiology. 64 (2), 147-161 (2012).
  11. Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. The Intracellular Life Of Cryptococcus Neoformans. Annual Review Of Pathology. 9. 219, 10-1146 (2014).
  12. Rao, M., Peachman, K. K., Alving, C. R., Rothwell, S. W. Depletion Of Cellular Cholesterol Interferes With Intracellular Trafficking Of Liposome-Encapsulated Ovalbumin. Immunology And Cell Biology. 81, Doi. 415-423 (2003).
  13. Sein, K. K., Aikawa, M. The Prime Role Of Plasma Membrane Cholesterol. In The Pathogenesis Of Immune Evasion And Clinical Manifestations Of Falciparum Malaria. Medical Hypotheses. 51 (2), 10-1016 (1998).
  14. Pucadyil, T. J., Tewary, P., Madhubala, R., Chattopadhyay, A. Cholesterol Is Required For Leishmania Donovani Infection: Implications In Leishmaniasis. Molecular And Biochemical Parasitology. 133, 145-152 (2004).
  15. Tagliari, L., et al. Membrane Microdomain Components Of Histoplasma Capsulatum Yeast Forms, And Their Role In. Alveolar Macrophage Infectivity. Biochimica Et Biophysica Acta. 1818 (3), 458-466 (2012).
  16. Crane, J. M., Tamm, L. K. Role Of Cholesterol In The Formation And Nature Of Lipid Rafts In Planar And Spherical Model Membranes. Biophysical Journal. 86 (5), 2965-2979 (2004).
  17. Brown, D. A., London, E. Functions Of Lipid Rafts In Biological Membranes. Annual Review Of Cell And Developmental Biology. 14, 111-136 (1998).
  18. Simons, K., Toomre, D. Lipid Rafts And Signal Transduction Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 1 (1), 31-39 (2000).
  19. Ilangumaran, S., Hoessli, D. C. Effects Of Cholesterol Depletion By Cyclodextrin On The Sphingolipid Microdomains Of The Plasma Membrane. The Biochemical Journal. 335 (Pt 2), 433-440 (1998).
  20. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A Rapid Method Of Total Lipid Extraction And Purification). Canadian Journal Of Biochemistry And Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
  21. Mukherjee, S., Lee, S., Casadevall, A. Antibodies To Cryptococcus Neoformans Glucuronoxylomannan Enhance Antifungal Activity Of Murine Macrophages. Infect. Immun. 63 (2), 573-579 (1995).
  22. Deshaw, M., Pirofski, L. A. Antibodies To The Cryptococcus Neoformans Capsular Glucuronoxylomannan Are Ubiquitous. In Serum From HIV+ And HIV- Individuals. Clinical And Experimental Immunology. 99 (3), 425-432 (1995).
  23. Tripathi, K., Mor, V., Bairwa, N. K., Del Poeta, M., Mohanty, B. K. Hydroxyurea Treatment Inhibits Proliferation Of Cryptococcus Neoformans In Mice. Frontiers In Microbiology. 3, 187(2012).
  24. Chaka, W., et al. Quantitative Analysis Of Phagocytosis And Killing Of Cryptococcus Neoformans By Human Peripheral Blood Mononuclear Cells By Flow Cytometry. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2 (6), 753-759 (1995).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Фагоцитоз Cryptococcus neoformansметил-бета-циклодекстриннабор для количественного определения холестеринатонкослойная хроматографияактивация LPS IFN-гаммаопсонизация антителамирасчет фагоцитарного индексафлуоресцентная световая микроскопиялипидный состав организма хозяина
Макрофагов Холестерин истощение и ее влияние на фагоцитоз
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.