В этой статье описан протокол заражения макрофагов Cryptococcus neoformans. Также объясняется метод истощения стеринов из макрофагов. Эти протоколы содержат руководство по изучению грибковых инфекций in vitro и изучению роли стеринов в таких инфекциях.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Макрофагов Холестерин истощение и ее влияние на фагоцитоз
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Криптококкоз является опасным для жизни инфекция, вызываемая патогенными грибами рода Cryptococcus. Заражение происходит при вдыхании спор, которые способны к репликации в глубоко в легкие. Фагоцитоз Cryptococcus макрофагами является одним из способов, что болезнь является возможность распространяться в центральной нервной системе, чтобы вызвать летальный менингоэнцефалит. Таким образом, изучение связи между Cryptococcus и макрофагов важно для понимания прогрессирование инфекции. Настоящее исследование описывает шаг за шагом протокол для изучения макрофагов инфекционность через С. neoformans в пробирке. Используя этот протокол, роль хозяина стеринов на хозяин-патоген взаимодействий изучается. Различные концентрации метил - циклодекстрина (MCD) были использованы, чтобы истощить холестерин из мышиного ретикулум саркомы макрофагов, как клетки линии J774A.1. Истощение Холестерин был подтвержден и количественно, используя как коммерчески availablе холестерина количественное комплект и тонкослойной хроматографии. Холестерин истощены клетки активировали с помощью липополисахарид (ЛПС) и гамма-интерферона (IFN,) и инфицировали антител опсонизированным Cryptococcus neoformans дикого типа H99 клеток при соотношении эффектор-к-цели 1: 1. Инфицированные клетки были проверены после 2 часов инкубации с С была рассчитана neoformans и их фагоцитарного индекса. Истощение Холестерин приводит к значительному снижению фагоцитарного индекса. Представленные протоколы предлагают удобный способ имитировать начало инфекционного процесса в лабораторных условиях и изучение роли хозяина липидного состава по инфекционной.
Введение
Фагоцитоз является процесс, при котором внеклеточные лица усваиваются клетками-хозяевами. Это основным оружием в арсенале иммунной системы к защите от патогенных микроорганизмов, но процесс часто может быть нарушена патогенами, чтобы обеспечить интернализации и распространяется по всему телу 1. Фагоцитоз опосредуется несколькими сигнальными событий, которые приводят в приложении и охвату через перестроек цитоскелета клетки-хозяина. Фагоциты «профессиональный» способны распознавать и связываться с опсонинов на поверхности вторжения возбудителя сигнал для крепления и формирования ламеллиподий, которые охватывают возбудителя и образовывать фагосомы 2.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Холестерин Истощение J774A.1 клеток с MβCD
- В стерильной камере биологической безопасности, семена 10 5 J774A.1 макрофагами, как клетки на лунку на 96-луночный планшет для культивирования клеток в 200 мкл Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина / стрептомицина (P / S). Инкубируют при 37 ° С и 5% СО 2 O / N.
- Удалить носитель из клеточный монослой и промыть клетки дважды 1x фосфатным буферным раствором (PBS), который был фильтрованной или в автоклаве.
- Добавить 200 мкл раствора MβCD в нужной концентрации (10 мМ или 30 мМ в PBS) или 1X PBS в качестве кон....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Холестерин Истощение
Анализ супернатанта защищены в шаге 1.3 протокола в соответствии с инструкциями изготовителя в Холестерин набор для анализа Amplex Красной дает повышенное содержание холестерина в MβCD обработанного образца по сравнению с контролем 1x PBS. В зависимости от типа клеток и используемого концентрация MβCD истощения холестерина может изменяться. Для J774, обработанной 10 мМ MβCD, наблюдалось истощение примерно на 50%. Истощение может быть вычислена с использованием значений, пол.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В работе с этим протоколом важно, чтобы получить точные числа клеток при покрытие клетки млекопитающих и opsonizing С neoformans клеток. Это сводит к минимуму различия между испытаний и обеспечивает точную 1: 1 цель соотношение эффектора на протяжении всего исследования. Важно также, чтобы координировать синхронизацию с истощением холестерина и инфекции, чтобы предотвратить опсонированных дрожжевых клеток, или лечение макрофагов клетки от отдыха при комнатной температуре в период между процедурами. Длительные п.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана NIH гранты AI56168, AI71142, AI87541 и AI100631 для MDP. Маурицио дель Поэта является Burroughs Wellcome Следователь по инфекционным болезням.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Класс II тип A2 Шкаф биобезопасности | Labconco | 3460009 | |
| J774A.1 клеточной линии | ATCC | TIB-67 | поставляется в замороженном виде. Смотрите инструкции ATCC по выращиванию. |
| Дульбекко s Модифицированный Eagle Medium | Gibco | 11995-065 | Магазин в 4 ° С и прогреть до 37°С; C Перед применением |
| HI Фетальная бычья сыворотка Performance Plus | Gibco | 10082-147 | Хранить в замороженном виде при температуре -20 °°С; C и размораживание перед добавлением в DMEM |
| пенициллин-стрептомицин (10 000 ЕД/мл) | Gibco | 15140-122 | Используется для питания |
| инкубатора клеточных культур DMEM Isotemp | Fisher Scientific | Model # 3530 | |
| 96-луночная чашка для культивирования | Corning Inc. Costar | 3595 | |
| 10x Фосфат буферизованный физиологический раствор | Fisher Scientific BioReagents | BP3994 | Разбавьте до 1x и отфильтруйте или отфильтруйте в автоклаве перед использованием. |
| Метил-&бета;-циклодекстрин | Sigma Life Science | C4555-10G | Растворить в 1x PBS для получения растворов концентраций 10 мМ и 30 мМ |
| Орбитальный шейкер | Labline | ||
| Amplex Набор для анализа красного холестерина | Life Technologies Молекулярные зонды | A12216 | Все реагенты для анализа холестерина содержатся в наборе. Следуйте инструкциям производителя. |
| 96-луночная черная пробирная пластина | Corning Inc. Costar | 3603 | |
| Считыватель микропланшетов FilterMax | Молекулярные устройства | Модель F5 | |
| Камера TLC | Sigma-Aldrich | Z126195-1EA | |
| Хлороформ | Sigma-Aldrich | 650498-4L | |
| Метанол | Sigma-Aldrich | 34860-2L-R | |
| TLC Бумага | Ватман | 3030917 | Уменьшен до размера, необходимого для |
| вытяжного шкафа | Любой вытяжной шкаф, соответствующий стандартам AIHA/ANSI | ||
| 6-луночный планшет | Corning Inc. | Costar 3506 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Скребок для клеток | Corning Inc. Costar | 3010 | |
| Гемоцитометр | Hausser Scientific | 1490 | |
| Центрифуга | Beckman Coulter | Модель Alegra x-30R | |
| Votex миксер | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Balance | Mettler Toledo | Модель # MS104S измеряет до 0,1 мг | |
| Стеклянная пипетка Пастера | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Холестерин | Avanti Polar Lipids | 700000 | |
| Концентратор SpeedVac | Thermo Scientific | Model # SPD2010 | |
| Петролейный эфир | Fisher Scientific | E139-1 | |
| Диэтиловый эфир | Sigma-Aldrich | 309966 | |
| Уксусная кислота | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| TLC Silica Gel 60 с зоной концентрации | Аналитическая хроматография Millipore | 1.11845.0001 | |
| Йодная крошка | Sigma-Aldrich | 376558-50G | |
| Серная кислота | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| хлорид марганца | Sigma-Aldrich | 244589 | |
| UVP EC3 Imaging System | Ultra-Violet Products Ltd. | Используйте программное обеспечение Vision Works LS для денситометрического анализа | |
| Стеклянная конфокальная чашка с дном | MatTek | P35G-1.5-10C | www.glassbottomdishes.com |
| Cryptococcus neoformans (H99) | Получено в Медицинском центре Университета Дьюка | ||
| YNB | BD | 239210 | Инструкции по приготовлению см. у производителя. Используйте концентрацию глюкозы 20 г/л. |
| Липополисахарид | Sigma | L4391-1MG | Растворите в 1x PBS до получения 1 мг/мл бульона. Хранить при температуре -20 °C. |
| Интерферон гамма | Sigma | I4777 | Растворить в 1x PBS для получения 0,1 мг/мл стокового раствора |
| Антитело к глюкуроноксиломаннану (анти-GXM) | Подарок от лаборатории Артуро Касадеваля концентрация составляет 1,98 мг/мл | ||
| Giemsa | MP Biomedicals | 194591 | Растворить 0,8 г Giemsa в 25 мл глицерина и нагреть до 60 °°; C в течение 1 ч. Добавьте в раствор 25 мл метанола и дайте состариться при комнатной температуре не менее 1 месяца. |
| Микроскоп | Zeiss | Observer.D1 Микроскоп с AxioCam MRm для съемки |
Ссылки
- Sarantis, H., Grinstein, S. Subversion of phagocytosis for pathogen survival. Cell Host & Microbe. 12 (4), 419-431 (2012).
- Rougerie, P., Miskolci, V., Cox, D. Generation Of Membrane Structures During Phagocytosis And Ch....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
