Method Article

Сравнительный анализ рекомбинантного белка слова в разных биофабрик: бактерии, клетках насекомых и растительных систем

DOI:

10.3791/52459

⸱

March 23rd, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biotechnology, University of Verona, Verona, Italy, 2Department of Internal Medicine, University of Perugia, Perugia, Italy

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании сравнивалась экспрессия целевого человеческого рекомбинантного белка на различных производственных платформах. Мы сосредоточились на традиционных культурах на основе ферментеров и на растениях, описав настройку каждой системы и выделив на основе полученных результатов ограничения и преимущества, присущие каждой платформе.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Системы на основе растений, которые считаются важной платформой для получения рекомбинантных белков в результате их хорошо документированный потенциала для производства гибкой и недорогой качественной, биологически активных продуктов.

В этом исследовании мы сравнили экспрессию целевого рекомбинантного белка в традиционных ферментере на основе клеточных культур (бактериальных и насекомых) с системами экспрессии на основе растений, как переходных и стабильных.

Для каждой платформы мы описали создание, оптимизацию и длительность процесса производства, качество конечного продукта и урожайности и мы оценили предварительные производственные затраты, определенные для рекомбинантного белка выбранной цели.

В целом, полученные результаты свидетельствуют о том, что бактерии являются непригодными для производства белка-мишени из-за его накопление в нерастворимых телец включения. С другой стороны, системы на основе растительных универсальные платформы тшлем позволяют производить выбранного белка при более низких затратах, чем-бакуловируса / системы клеток насекомых. В частности, стабильные линии трансгенных отображается самый высокий-выход конечного продукта и переходные выражающие растения быстро процесс развития. Однако, не все рекомбинантные белки могут извлечь выгоду из растительных систем на основе, но лучшая продукция платформа должна быть определена эмпирически случая к случаю подход, как описано здесь.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рекомбинантные белки коммерчески массово производятся в гетерологичных системах экспрессии с помощью новых биотехнологических инструментов. Ключевые факторы, которые необходимо учитывать при выборе гетерологичной системы экспрессии, включают: качество белка, функциональность, скорость процесса, выход и стоимость.

В области рекомбинантных белков рынок фармацевтических препаратов быстро расширяется, и, следовательно, большинство биофармацевтических препаратов, производимых сегодня, являются рекомбинантными. Белки могут экспрессироваться в клеточных культурах бактерий, дрожжей, плесени, млекопитающих, растений и насекомых, а также в раститель....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Конструирование векторов экспрессии,

  1. Коммерческая система рекомбинации клонирование:
    1. Амплификации последовательности полной длины гена-мишени (hGAD65mut) с соответствующими праймерами позволяет добавление CACC зажима на 5'-конце гена, как описано выше 2.
    2. Клон гель-очистке продукта амплификации, в зависимости от направления характеристики набора для клонирования в векторе ввода (топоизомеразы связан), собирая реакцию в общем объеме 6 мкл, с использованием 1,5 в: 1 мольное отношение вставки: вектор и 1 мкл солевой раствор (0,2 М NaCl и 0,01 MgCl 2). Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре (RT). <....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Опытно-конструкторских для гетерологичной экспрессии рекомбинантного белка-мишени в различных производственных систем описана здесь. Первый фокус был настройка различных платформ путем создания оптимальных условий для экспрессии целевого белка в каждой системе.

Выражение белка-мишени, hGAD65mut, индуцировали в трех экземплярах Е. палочки культуры. После 3 ч экспрессии при 37 ° С, бактериальные клетки собирали центрифугированием и лизировали с помощью ультразвука. После стадии центри.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании сравнивали три различные платформы для экспрессии рекомбинантного человеческого белка: бактериальных клеток бакуловируса / клеток насекомых и растений. Платформа на растительной основе было продолжено за счет использования трех широко используемых технологий экспрессии (т.е., преходящей - MagnICON и pK7WG2 основе - и стабильные). Целевой белок выбран для этого эксперимента, hGAD65mut, ранее выражено в различных системах 13, и его производство и функциональность можно было легко об.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в связи с публикацией данной статьи.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана акцией COST «Молекулярный фарминг: растения как производственная платформа для высокоценных белков» FA0804. Авторы благодарят д-ра Анатолия Гирича и профессора Юрия Глебу за предоставление векторов MagnICON для исследовательских целей.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Дрожжевой экстрактSigmaY1333
ТриптонFormediumTRP03
Агар Бактериологический классApplichemA0949
SF-900 II SFM mediumGibco10902-088
Grace' s Среда для насекомых, без добавокGibco11595-030
Целфектин II РеагентInvitrogen10362-100
MS среда, включая витаминыDuchefa BiochemieM0222
СахарозаDuchefa BiochemieS0809
Растительный агарDuchefa BiochemieP1001
Ампициллин натрияDuchefa BiochemieA0104Токсичный
сульфат гентамицинаDuchefa BiochemieG0124Токсичный
ганцикловирInvitrogenI2562-023
Карбенициллин динатрияDuchefa BiochemieC0109Токсичный
сульфат канамицинаSigmaK4000Токсичный
рифампицинDuchefa BiochemieR0146Токсичный & ндаш; 25 мг/мл запас в ДМСО
стрептомицина сульфатаDuchefa BiochemieS0148Токсичный
дигидрохлорид спектиномицинаDuchefa BiochemieS0188
IPTG (изопропил-&бета;-D-1-тиогалаттопиранозид)SigmaI5502Токсичный
гидрат MESSigmaM8250
MgCl2Biochemical436994U
АцетосирингонSigmaD134406токсичный – 0,1 М запас в шприце ДМСО
(1 мл)Terumo
MgSO4Fluka63136
BAP (6-бензиламинопурин)SigmaB3408Токсичный
NAA (нафталена уксусная кислота)Duchefa BiochemieN0903Раздражающий
ЦефотаксимMylan Дженерикс
Тризма БазаSigmaT1503Отрегулируйте pH с 1 N HCl для получения буфера Tris-HCl
HClSigmaH1758Коррозионный
NaClSigmaS30141 M сток
KClSigmaP9541
Na2HPO4SigmaS7907
KH2PO4SigmaP9791
PMSF (фенилметансульфонилфторид)SigmaP7626Коррозионный, токсичный
мочевинаSigmaU5378
&бета;-меркаптоэтанолSigmaM3148Токсичный
твин-20SigmaP5927
HepesSigmaH3375
DTT (Дитиотреитол)SigmaD0632Toxic – 1 M stock, хранить при -20 °°; C
CHAPSDuchefa BiochemieC1374
Токсичный коктейль ингибиторов протеазырастений SigmaP9599Не замораживать/размораживать слишком много раз
SDS (додецилсульфат натрия)SigmaL3771Легковоспламеняющийся, токсичный, коррозионный – 10% стоковый
глицеринSigmaG5516
Бриллиантовый синий R-250SigmaB7920
ИзопропанолSigma24137Легковоспламеняющаяся
уксусная кислотаSigma27221Коррозионная
антиглутаминовая кислота декарбоксилаза 65/67SigmaG5163Не замораживать/размораживать слишком много раз
Пероксидаза хрена (HRP)-конъюгат против кроличьего антителаSigmaA6154Не замораживать/размораживать слишком много раз
Sf9 КлеткиЖизнь Технологии11496
BL21 Компетентный E. coliNew England BiolabsC2530H
Белок А СефарозаSigmaP2545
Планшеты для клеточных культурSigmaCLS3516
Набор для радиоиммунологического анализаTechno Genetics12650805Радиоактивный материал

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hampe, C. S., Hammerle, L. P., Falorni, A., Robertson, J., Lernmark, A. Site-directed mutagenesis of K396R of the 65 kDa glutamic acid decarboxylase active site obliterates enzyme activity but not antibody binding. FEBS Lett. 488 (3), 185-189 (2001).
  2. Avesani, L., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Recombinant Protein ExpressionBacterial SystemsInsect Cell SystemsPlant Based SystemsTransient ExpressionStable Transgenic LinesProtein Yield AnalysisProduction Cost EvaluationInclusion Body FormationBiofactory Comparison

Related Articles