Сравнительный анализ рекомбинантного белка слова в разных биофабрик: бактерии, клетках насекомых и растительных систем

Summary

В этом исследовании сравнивалась экспрессия целевого человеческого рекомбинантного белка на различных производственных платформах. Мы сосредоточились на традиционных культурах на основе ферментеров и на растениях, описав настройку каждой системы и выделив на основе полученных результатов ограничения и преимущества, присущие каждой платформе.

Abstract

Системы на основе растений, которые считаются важной платформой для получения рекомбинантных белков в результате их хорошо документированный потенциала для производства гибкой и недорогой качественной, биологически активных продуктов.

В этом исследовании мы сравнили экспрессию целевого рекомбинантного белка в традиционных ферментере на основе клеточных культур (бактериальных и насекомых) с системами экспрессии на основе растений, как переходных и стабильных.

Для каждой платформы мы описали создание, оптимизацию и длительность процесса производства, качество конечного продукта и урожайности и мы оценили предварительные производственные затраты, определенные для рекомбинантного белка выбранной цели.

В целом, полученные результаты свидетельствуют о том, что бактерии являются непригодными для производства белка-мишени из-за его накопление в нерастворимых телец включения. С другой стороны, системы на основе растительных универсальные платформы тшлем позволяют производить выбранного белка при более низких затратах, чем-бакуловируса / системы клеток насекомых. В частности, стабильные линии трансгенных отображается самый высокий-выход конечного продукта и переходные выражающие растения быстро процесс развития. Однако, не все рекомбинантные белки могут извлечь выгоду из растительных систем на основе, но лучшая продукция платформа должна быть определена эмпирически случая к случаю подход, как описано здесь.

Introduction

Рекомбинантные белки коммерчески массово производятся в гетерологичных системах экспрессии с помощью новых биотехнологических инструментов. Ключевые факторы, которые необходимо учитывать при выборе гетерологичной системы экспрессии, включают: качество белка, функциональность, скорость процесса, выход и стоимость.

В области рекомбинантных белков рынок фармацевтических препаратов быстро расширяется, и, следовательно, большинство биофармацевтических препаратов, производимых сегодня, являются рекомбинантными. Белки могут экспрессироваться в клеточных культурах бактерий, дрожжей, плесени, млекопитающих, растений и насекомых, а также в растительных системах (посредством стабильной или транзиторной трансформации) и трансгенных животных; Каждой системе экспрессии присущи свои преимущества и ограничения, и для каждого целевого рекомбинантного белка необходимо тщательно оценить оптимальную систему продуцирования.

Растительные платформы становятся важной альтернативой традиционным системам на основе ферментеров для безопасного и экономически эффективного производства рекомбинантного белка. Несмотря на то, что затраты на последующую обработку сопоставимы с затратами на последующую обработку микробных клеток и клеток млекопитающих, ключевыми преимуществами являются более низкие первоначальные инвестиции, необходимые для коммерческого производства на заводах, и потенциальная экономия за счет масштаба, обеспечиваемая выращиванием на больших площадях.

Мы оценили растения как биореакторы на экспрессию изоформы 65 кДа декарбоксилазы глутаминовой кислоты человека (hGAD65), одного из основных аутоантигенов при аутоиммунном диабете 1 типа (СД1). hGAD65 в значительной степени используется в качестве маркера, как для классификации, так и для мониторинга прогрессирования заболевания, и его роль в профилактике СД1 в настоящее время исследуется в клинических испытаниях. Если эти испытания будут успешными, глобальный спрос на рекомбинантный hGAD65 резко возрастет.

Здесь мы сосредоточимся на экспрессии ферментативно неактивного аналога hGAD65, hGAD65mut, мутанта, образованного путем замены остатка лизина, который связывает кофактор PLP (пиридоксаль-5'-фосфат) остатком аргинина (K396R)¹.

hGAD65mut сохраняет свою иммуногенность и в клетках растений и насекомых накапливается в десять раз выше, чем hGAD65, его аналог дикого типа. Была выдвинута гипотеза о том, что ферментативная активность hGAD65 вмешивается в метаболизм растительных клеток до такой степени, что подавляет собственный синтез, в то время как hGAD65mut, ферментативно-неактивная форма, может накапливаться в растительных клетках до более высоких уровней.

Для экспрессии hGAD65mut здесь было исследовано использование различных технологий, широко используемых в биотехнологии растений, и сравнение с традиционными платформами экспрессии (Escherichia coli и Baculovirus/insect-cell-based).

В этой работе были рассмотрены и сравнены рекомбинантные платформы, разработанные для экспрессии hGAD65mut, включающие традиционные и растительные системы, на основе скорости процесса и выхода, а также качества и функциональности конечного продукта.

Protocol

1. Конструирование векторов экспрессии,

1. Коммерческая система рекомбинации клонирование:
   1. Амплификации последовательности полной длины гена-мишени (hGAD65mut) с соответствующими праймерами позволяет добавление CACC зажима на 5'-конце гена, как описано выше ^2.
   2. Клон гель-очистке продукта амплификации, в зависимости от направления характеристики набора для клонирования в векторе ввода (топоизомеразы связан), собирая реакцию в общем объеме 6 мкл, с использованием 1,5 в: 1 мольное отношение вставки: вектор и 1 мкл солевой раствор (0,2 М NaCl и 0,01 MgCl _2). Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре (RT).
   3. Преобразование всей реакции в химически компетентную E. палочки клетки в соответствии с характеристиками направленности Cloning Kit и экраном, полученных колоний ПЦР колоний ^3, с использованием M13 прямого и обратного праймеров, включенных в набор направленного клонировани. Изолировать плазмиды из роsitive колония в соответствии с плазмиды препарата ДНК спецификации комплекта и последовательность вставки диска с помощью M13 прямого и обратного праймеров, чтобы гарантировать отсутствие мутаций ^3.
   4. С помощью полученного клона входа проводить реакцию рекомбинации с помощью лямбда рекомбиназу Clonase II фермента (LR) с конкретными векторами назначения: для экспрессии рекомбинантного белка в бактериальных клетках с получением pDEST17 (pDEST17.G65mut), в растениях (временной или стабильной) с pK7WG2 (уступая pK7WG2.G65mut), в Baculovirus / системы клеток насекомых с линеаризованной вирусной ДНК (уступая Baculo.G65mut) ^4. Сборка реакции, в соответствии с техническими Clonase комплект, со 100 нг векторной записи, 150 нг вектора назначения и 2 мкл ферментной смеси в конечном объеме 10 мкл. Инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение 1 часа.
   5. Преобразование рекомбинации продукт в химически компетентную E. палочки клетки в соответствии с Clonase спецификации комплекта. Экран полученные колонии с помощью ПЦР ³ с использованием всех реакционных преобразование полученных колоний и тот же обратный GAD65mut-специфический праймер (5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3 '), и следующие конкретные векторы назначения праймеры: для pDEST17: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'; Для pK7WG2: 5'-AAGATGCCTCTGCCGACAGT-3 '; для Baculo линеаризованной вектора: 5'-AAATGATAACCATCTCGC-3 ».
   6. Изолировать плазмидной ДНК с использованием набора коммерческой minipreparation ДНК и подтвердить наличие последовательности-мишени с помощью ПЦР ^3, с использованием тех же конкретных комбинаций праймеров, описанных в предыдущем шаге.
   7. С помощью полученных ПЦР-позитивные плазмиды для трансформации различных целевых организмов, в зависимости от платформы, выбранной для экспрессии рекомбинантного белка, как описано в следующих шагах.
2. Система MagnICON ^5-7:
   1. Клонирование гена-мишени в 3'-модуля pICH31070, как ранее описано подробно ^7, с получением pICH31070.G65mut. ИспользуйтеСледующие конкретные реакционного цикла: 30 мин инкубации при 37 ° С, 5 мин при 50 ° С, а затем 5 мин при 80 ° С.

2. рекомбинантный белок экспрессия

1. Бактериальный клеточная система:
   1. Преобразование pDEST17.G65mut в E. палочка BL21 (DE3) Электрокомпетентные клетки с использованием стандартных методов и экран колоний, выращенных на ампициллин-содержащие (100 мкг / мл) LB-среды, от ПЦР колоний с использованием следующих трансгенных-специфических праймеров: 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 'и 5' -CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ', при температуре отжига 58 & deg; С и ​​времени элонгации 20 сек. Проведение реакции ПЦР в общем объеме 20 мкл после растворения бактериальных клеток с пластмассовым наконечником в трубке.
   2. Посев одну колонию в течение ночи при 37 ° С в 3 мл ампициллина, содержащего (100 мкг / мл) LB-среде.
   3. Развести бактериальной культуры 1: 100 в 100 мл свежего LB среды (в том числе ampicillв) и не инкубировать при 37 ° С в течение 1-6 ч до конечной OD ₆₀₀ 0,8.
   4. Индуцируют экспрессию рекомбинантного белка путем добавлени isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) в конечной концентрации 1 мМ и инкубируют культуры при интенсивном встр хивании в течение 3 ч при 37 ° С.
   5. Собирают клетки центрифугированием при 4000 х г в течение 20 мин и использовать бактериальный осадок для экстракции белка (шаг 3.1.1.1).
2. Baculovirus система / клетка насекомого:
   1. Семенной Spodoptera frugiperda (Sf9) клеток в 6-луночных планшетах (8 х 10 ⁵ клеток на лунку) и дважды промывали 2 мл, не дополненной Грейс насекомых среды.
   2. Снять и заменить среднего по каплям трансфекции смеси (5 мкл LR рекомбинантного реакции, 6 мкл раствора Celfectin и 200 мкл без дополненной Грейс насекомых среды).
   3. Планшеты инкубируют при 27 ° С в течение 5 часов.
   4. Снять и заменить трансфекции смесь с 2 мл свежей SF-900 средних, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки, 10 мкг / мл гентамицина и 100 мкМ ганцикловир, чтобы выбрать рекомбинантных клонов бакуловирус.
   5. После инкубации в течение 96 ч при 27 ° С, собирать среды (V1 вирусный штамм), центрифуги в 4000 мкг, для удаления клеток и крупного мусора и в магазине в темноте при 4 ° С.
   6. Семена 1 × 10 ⁶ Sf9 клеток на лунку в 2,5 мл Sf-900, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 10 мкг / мл гентамицина и 100 мкМ ганцикловир и заражают 100 мкл V1 наличии в каждую лунку.
   7. Инкубируйте клетки в течение 3 дней при 27 ° С.
   8. Сбор и центрифуги среда в 4000g в.
   9. Храните супернатант (V2 с высоким титром акций) при 4 ° С.
   10. Семена 1 × 10 ⁶ Sf9 клеток на лунку в 2,5 мл Sf-900, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 10 мкг / мл гентамицина и 100 мкМ ганцикловир и заражают 25 мкл V2 наличии в каждую лунку.
   11. Инкубируйте клетки в течение 3 дней при 27 ° С.
   12. Сбор клеток от центрифуге при 4000 мкг в и использовать осадок клеток насекомых для извлечения белка (шаг 3.1.2. 1).
3. Nicotiana benthamiana временной экспрессии системы:
   1. Расти Н. benthamiana растения в теплице, при естественном свете в диапазоне температур 18-23 ° C. Для agroinfection использовать 4-5-недельных растений.
   2. Держите agroinfected растения в климатической камере при 22 ° С с 13 ч дня / 11 ч ночь светового дня.
   3. Коммерческая система рекомбинации клонирование:
      1. Представьте pK7WG2.G65mut в Agrobacterium tumefaciens штамма EHA105 Электрокомпетентные клетки, как описано выше, и экран ⁸ колоний, выращенных на LB среде, содержащей рифампицин (50 мкг / мл), стрептомицина (300 мкг / мл) и спектиномицином (100 мкг / мл) после того, как две дней инкубации при 28 ° С, ПЦР колоний ⁸ с использованием следующих трансгенных-специфических праймеров: 5'-CATGGTGGAGCACGACACGCT-3 & #8217; и 5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ', при температуре отжига 58 & deg; С и ​​времени элонгации 50 сек. Проведение реакции ПЦР в общем объеме 20 мкл.
      2. Посев бактерий в 30 мл LB среды, содержащей рифампицин (50 мкг / мл), стрептомицина (300 мкг / мл) и спектиномицином (100 мкг / мл) в течение двух дней при 28 ° С.
      3. Сбор бактерий центрифугированием при 4000 х г в течение 20 мин и ресуспендируют осадок в 10 мл инфильтрации буфера (10 мМ MES, 10 мМ MgCl _2, 100 мкМ ацетосирингона, рН 5,6). Измерить значение OD _600, а затем отрегулировать его в 0,9 путем разбавления в том же буфере.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем необходим для проникновения в три N. benthamiana растения составляет 30 мл.
      4. Используйте 2,5 мл безыгольного шприца проникнуть в Agrobacterium суспензии в N. benthamiana уходит. Осторожно и медленно вводят листа панели с суспензией из шприца. Проникнуть три расширенный лкарнизы на заводе и использовать три растения, как трижды.
         Примечание: В целях охраны здоровья и безопасности надевайте защитные очки во время процесса инфильтрации.
      5. Сбор агроинфильтрации листья 2 дня после заражения (точек на дюйм) и замораживание в жидком азоте. Магазин тканей растений при -80 ° С.
   4. MagnICON система:
      1. Введем MagnICON векторы - 'модуль (pICH20111), 3' 5 модуль (pICH31070.G65mut), а модуль интегразу (pICH14011) - в А. tumefaciens GV3101 напряжение с помощью стандартных методик. Экран колоний, выращенных на LB среде, содержащей 50 мкг / мл рифампицина и соответствующего вектора конкретного антибиотика (50 мкг / мл карбенициллина для pICH20111 и pICH14011, 50 мкг / мл канамицина для pICH31070), ПЦР колоний с использованием специфических праймеров для каждого вектора.
      2. Привить отдельно три А. tumefaciens штаммы в 5 мл LB среды, содержащей 50 мкг / мл рифампицина и соответствующий вектор конкретным антибиотики встряхивали в течение ночи при 28 ° С.
      3. Гранул ночной бактериальной культуры центрифугированием при 4000 х г в течение 20 мин и ресуспендируют их в двух объемах исходного бактериальной культуры из 10 мМ MES (рН 5,5) и 10 мМ MgSO _4.
      4. Смешайте равные объемы бактериальной суспензии, содержащие три вектора и использовать для подвешивания смесь для шприца инфильтрации N. benthamiana уходит. Проникнуть три расширенные листья с растения.
      5. Сбор агроинфильтрации листья на 4 точек на дюйм и заморозить в жидком азоте.
      6. Магазин тканей растений при -80 ° С.
4. Табак обыкновенный система стабильная экспрессия:
   1. Вырастить и сохранить ростки в пробирке N. аЬасит (вар Sr1.) на твердой питательной среде растений (4,4 г / л Мурасиге и Скуга - МС - средний в том числе витаминов, 30 г / л сахарозы, рН 5,8, 7 г / л агара) растений в контролируемых условиях в климатической камере при 25 ° С 16 ч / 8 ч день / Niнравом режим.
   2. Начать подготовительный культуры А. tumefaciens EHA105, несущие вектор экспрессии pK7WG2.G65mut в 5 мл жидкого YEB среде с соответствующими антибиотиками (рифампицин 50 мкг / мл, стрептомицин 300 мкг / мл, спектиномицин 100 мкг / мл) и расти в течение ночи при 28 ° С в орбитальном шейкере набора при 200 оборотах в минуту.
   3. Использование 1 мл предварительной культуры для инокуляции культуры 50 мл Agrobacterium в Yeb среде плюс антибиотики (рифампицин 50 мкг / мл, стрептомицин 300 мкг / мл, спектиномицин 100 мкг / мл) и расти в течение 24 ч, до тех пор, бактериальная культура не является насыщенный (OD ₆₀₀ Значение 0,5-1,0).
   4. Сбор бактерий центрифугированием при 4000 х г в течение 20 мин и ресуспендируют осадок в 50 мл жидкой культуральной среды растений. Повторите этот шаг дважды, чтобы полностью удалить антибиотики.
   5. Взять первые здоровых Полностью укомплектованная листья с в пробирке растений табака и порежьте их на примерно 1 см квадраты.
   6. Передача кусочки листьевв глубоких чашках Петри, содержащие бактериальную суспензию и оставить в темноте в течение 20 мин.
   7. Удалить кусочков листьев с подвеской и промокнуть сухой стерильной фильтровальной бумаги.
   8. Поместите кусочков листьев с адаксиальной стороны (верхнюю поверхность листьев) на твердой растительной культуральной среде, содержащей 1,0 мкг / мл 6-бензоаминопурином (БАТ), в 0,1 мкг / мл нафталин уксусную кислоту (НАА), и инкубировать пластин в течение двух дней в климатической камере при контролируемой условия (25 ° С, 16 ч день / 8 ч ночь).
   9. Передача кусочки листьев на твердую культуральную среду (в том числе 1,0 мкг / мл BAP, 0,1 мкг / мл NAA, 500 мкг / мл цефотаксима, 100 мкг / мл канамицина) с абаксиальной поверхности (нижней поверхности листа) в контакте со средой.
   10. Планшеты инкубируют в течение 2-3 недель в климатической камере при 25 ° С с 16 ч / 8 ч день / ночь режим, чтобы вызвать образование отростков. Субкультура каждые 2 недели по передаче листовых эксплантов на свежий твердое культивировани растений среде, содержащей 1,0 мкг / мл BAP, 0,1 мкг / мл NAA, 500мкг / мл цефотаксима и 100 мкг / мл канамицина.
   11. При всходы появляются передавать их на Magenta коробки, содержащих твердую культуральную среду, включая 500 мкг / мл цефотаксима и 100 мкг / мл канамицина, чтобы вызвать образование корней. Выдержите ростки с 16 ч дня / 8 часов ночного светового дня при 25 ° С в течение 1-2 недель.
   12. Когда корни форма, передавать растения в почву в теплице.
   13. Сбор листьев кусок для каждого завода и изолировать геномной ДНК с коммерческого набора.
   14. Обнаружить присутствие трансгена по конкретной ПЦР. Использование 30 нг геномной ДНК в качестве матрицы для ПЦР-амплификации с использованием следующих трансгенных-специфических праймеров: 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 'и 5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3', при температуре отжига 58 & deg; С и ​​времени элонгации 20 сек , Проведение реакции ПЦР в общем объеме 50 мкл.
   15. Анализ 220 п.о. продукт с помощью электрофореза в 1% агарозном геле в трис-ацетатном-ЭДТА (ТАЕ) буфере (40 мМ Trэто, 20 мМ уксусной кислоты и 1 мМ ЭДТА).
   16. Выбор трансгенных растений, содержащих ген-мишень.
   17. Сбор кусок листа с каждой из выбранного трансгенного растения и заморозить в жидком азоте немедленно.
   18. Подготовка общего белка экстракты из растений листовой ткани (этап 3.1.3) и проверить каждый образец с помощью вестерн-блот анализа, как описано выше ^2, чтобы выбрать лучший рекомбинантного белка, экспрессирующих растений табака.
   19. Сумка цветы выбранного самые эффективные растения перед цветением, чтобы предотвратить перекрестное опыление.
   20. После цветения, созревания плодов и семян сушки, собирать чемоданы.
   21. Отдельные семена от плевел и хранить их в сухом помещении при контролируемой температуре (20-24 ° C).
   22. Сейте Высушенные семена для получения поколение трансгенных растений второго и последующего выбора самых эффективных завод будет самоопыляемыми.
   23. Повторите ту же процедуру, описанную в шагах 2.4.19-2.4.21 для последующих поколений.

   3. Рекомбинантные Анализ экспрессии белка

   1. Всего экстракции белка:
      1. Бактериальные клетки:
         1. Ресуспендируют осадок клеток бактерий, собранных как описано в стадии 2.1.5, в два раза объема культуры в Трис-буферном солевом растворе (TBS - 2 мМ Трис / HCl, 500 мМ NaCl), pH 7,4 с добавлением 1 мМ PMSF (phenylmethanesulfonylfluoride).
         2. Ультразвук клеточный осадок ресуспендировали в три раза по 40 секунд при половинной мощности, сохраняя при этом образец на льду.
         3. Уточнить лизата центрифугированием при 14000 х г в течение 20 мин при 4 ° С.
         4. Передача супернатант в чистую пробирку и хранить как супернатант и осадок отдельно при -80 ° С.
         5. Солюбилизации тел включения, собранные в осадке, в половины объема сотовой лизата TBS рН 8,0 с добавлением 6 М мочевины путем энергичного встряхивания в течение ночи при комнатной температуре.
         6. Центрифуга при 10000 х г в течение 25 мин при комнатной температуре и собирают супернатант в чистомтруба.
         7. Хранить как супернатант и осадок при -80 ° С.
      2. Клетки насекомых:
         1. Промыть гранулу инфицированных клеток насекомых, собранных как описано в стадии 2.2.12, 1 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS - 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na ₂ HPO _4, 1,8 мМ KH ₂ PO ₄ рН 7,4).
         2. Ресуспендируют клеток в 200 мкл буфера для лизиса (20 мМ Трис / HCl рН 8,0, 0,5 М NaCl, 3 мМ β-меркаптоэтанол и 1% Твин-20) и инкубировали на льду в течение 30 мин.
         3. Центрифуга клетки солюбилизировали при 14000 х г в течение 20 мин при 4 ° С.
         4. Собирают фракции растворимых и хранить при -80 ° С и отбросить гранул.
      3. Лист растительной ткани:
         1. Измельчить Н. benthamiana или N. аЬасит ткани в тонкий порошок в жидком азоте с использованием ступки и пестика.
         2. Однородный 100 мг наземной ткани в 300 мкл буфера для экстракции (40 мМ Hepes рН 7,9, 5 мМ ДТТ, 1,5% CHAPS), Supplemented с 3 мкл ингибитора протеазы коктейль и оттепель на льду.
            ПРИМЕЧАНИЕ: выбирается соотношение между весом тканей растений (г) в буфер объем (мл) 1: 3.
         3. Экстракт Центрифуга при 30000 х г в течение 30 мин при 4 ° С.
         4. Собирают супернатант в чистую пробирку и хранить при -80 ° С.
   2. Coomassie гель окрашивание:
      1. Подготовка соответствующего разбавления общих белковых экстрактов (например, 2 мкл растительного экстракта, 5 мкл бактериальных экстрактов и насекомых) в конечном объеме 10 мкл буфера для экстракции и добавить 5 мкл буфера для образцов 3x (1,5 М Трис / HCl, рН 6,8, 3% SDS, 15% глицерина, 4% β-меркаптоэтанола) до конечной концентрации 1х.
      2. Образцы кипятить в течение 10 мин.
      3. Отдельные белки на 10% SDS-PAGE.
      4. После электрофореза гель тепла в присутствии Кумасси раствора А (0,05% Brilliant Blue R-250, 25% изопропанола, 10% уксусная кислота) в микроволновой печи в течение примерно двух минутс до температуры кипения.
      5. Охладить гель комнатной температуре и осторожном встряхивании.
      6. Отменить Coomassie окрашивание раствора А.
      7. Destain гель при нагревании в присутствии Кумасси раствора В (0,05% Brilliant Blue R-250, 25% изопропанол), С (0,002% Brilliant Blue R-250, 10% уксусная кислота) и D (10% уксусной кислоты) каждый раз следуя той же протокол для окрашивания.
      8. После последнего стадии нагревания раствора Г, оставьте гель Обесцвечивание до фон прозрачный ^9.
   3. Вестерн-блот-анализ:
      1. После электрофореза выделенные белки переноса на нитроцеллюлозную мембрану с использованием стандартных методов и блок с 4% молока в PBS, рН 7,4 при комнатной температуре в течение 1 часа.
      2. Инкубируйте блот в течение ночи при 4 ° С или в течение 4 ч при комнатной температуре в блокирующем растворе, содержащем первичное антитело кролика, поднятые против белка-мишени в 1: 10000 и с добавлением 0,1% Твин-20.
      3. После этикетке первичных антителING, мыть мембраны 3 раза по 5 мин в каждом блокирующим раствором, содержащим 0,1% Твин-20.
      4. Инкубируйте с пероксидазой хрена (HRP) -сопряженных анти-кроличьими антителами в 1: 10000 в течение 1,5 ч.
      5. Промыть мембраны в 5 раз по 5 мин каждый с PBS-T (PBS с добавлением 0,1% Твин-20).
      6. Процесс вестерн-блот с использованием хемилюминесцентного субстрата пероксидазы.
   4. Radioimmuno анализ (РИА):
      1. Разрешить реагенты (антисыворотка, Tracer и белка сефароза), чтобы достичь комнатной температуры и пипетки 20 мкл белка образцов экстракта и стандартов в различных концентрациях (от 300-2,400 нг / мл рекомбинантного коммерческой hGAD65) в 12 х 75 мм полистирольные пробирки.
      2. Добавить 20 мкл антисыворотки, подготовленный разбавления 1:30 сыворотки от плазмафереза ​​о T1D пациента.
      3. Добавить 50 мкл метки (125-я-GAD65) и инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре. Установите трубку с трассирующими только оценить общую активность.
      4. Добавить 50 мклбелка A Sepharose и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре.
      5. Не включать 1 мл холодного PBS буфера в каждую пробирку и центрифугируют при 1500 х г при 4 ° С в течение 30 мин.
      6. Слейте трубы для удаления надосадочной жидкости и поглощать остаточную жидкость на промокательную бумагу, осторожно нажав трубку.
      7. Мера иммунопреципитировали радиоактивность во всех трубок путем подсчета в течение 1 мин в гамма-счетчике.
      8. Земельный участок в логарифмической шкале обязательные ставки (B / T%) калибраторов, связанных с общей активностью, чтобы установить стандартную кривую, и читать концентрации ГТР образцов с калибровочной кривой ^10.
         ПРИМЕЧАНИЕ: закрытых районов должны быть разработаны для хранения, обработки и утилизации радиоактивных материалов.

Results

Опытно-конструкторских для гетерологичной экспрессии рекомбинантного белка-мишени в различных производственных систем описана здесь. Первый фокус был настройка различных платформ путем создания оптимальных условий для экспрессии целевого белка в каждой системе.

Выражение белка-мишени, hGAD65mut, индуцировали в трех экземплярах Е. палочки культуры. После 3 ч экспрессии при 37 ° С, бактериальные клетки собирали центрифугированием и лизировали с помощью ультразвука. После стадии центри...

Discussion

В этом исследовании сравнивали три различные платформы для экспрессии рекомбинантного человеческого белка: бактериальных клеток бакуловируса / клеток насекомых и растений. Платформа на растительной основе было продолжено за счет использования трех широко используемых технологий экспрессии (т.е., преходящей - MagnICON и pK7WG2 основе - и стабильные). Целевой белок выбран для этого эксперимента, hGAD65mut, ранее выражено в различных системах ^13, и его производство и функциональность можно было легко об...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Дрожжевой экстракт	Sigma	Y1333
Триптон	Formedium	TRP03
Агар Бактериологический класс	Applichem	A0949
SF-900 II SFM medium	Gibco	10902-088
Grace' s Среда для насекомых, без добавок	Gibco	11595-030
Целфектин II Реагент	Invitrogen	10362-100
MS среда, включая витамины	Duchefa Biochemie	M0222
Сахароза	Duchefa Biochemie	S0809
Растительный агар	Duchefa Biochemie	P1001
Ампициллин натрия	Duchefa Biochemie	A0104	Токсичный
сульфат гентамицина	Duchefa Biochemie	G0124	Токсичный
ганцикловир	Invitrogen	I2562-023
Карбенициллин динатрия	Duchefa Biochemie	C0109	Токсичный
сульфат канамицина	Sigma	K4000	Токсичный
рифампицин	Duchefa Biochemie	R0146	Токсичный & ндаш; 25 мг/мл запас в ДМСО
стрептомицина сульфата	Duchefa Biochemie	S0148	Токсичный
дигидрохлорид спектиномицина	Duchefa Biochemie	S0188
IPTG (изопропил-&бета;-D-1-тиогалаттопиранозид)	Sigma	I5502	Токсичный
гидрат MES	Sigma	M8250
MgCl2	Biochemical	436994U
Ацетосирингон	Sigma	D134406	токсичный – 0,1 М запас в шприце ДМСО
(1 мл)	Terumo
MgSO4	Fluka	63136
BAP (6-бензиламинопурин)	Sigma	B3408	Токсичный
NAA (нафталена уксусная кислота)	Duchefa Biochemie	N0903	Раздражающий
Цефотаксим	Mylan Дженерикс
Тризма База	Sigma	T1503	Отрегулируйте pH с 1 N HCl для получения буфера Tris-HCl
HCl	Sigma	H1758	Коррозионный
NaCl	Sigma	S3014	1 M сток
KCl	Sigma	P9541
Na2HPO4	Sigma	S7907
KH2PO4	Sigma	P9791
PMSF (фенилметансульфонилфторид)	Sigma	P7626	Коррозионный, токсичный
мочевина	Sigma	U5378
&бета;-меркаптоэтанол	Sigma	M3148	Токсичный
твин-20	Sigma	P5927
Hepes	Sigma	H3375
DTT (Дитиотреитол)	Sigma	D0632	Toxic – 1 M stock, хранить при -20 °°; C
CHAPS	Duchefa Biochemie	C1374
Токсичный коктейль ингибиторов протеазы	растений Sigma	P9599	Не замораживать/размораживать слишком много раз
SDS (додецилсульфат натрия)	Sigma	L3771	Легковоспламеняющийся, токсичный, коррозионный – 10% стоковый
глицерин	Sigma	G5516
Бриллиантовый синий R-250	Sigma	B7920
Изопропанол	Sigma	24137	Легковоспламеняющаяся
уксусная кислота	Sigma	27221	Коррозионная
антиглутаминовая кислота декарбоксилаза 65/67	Sigma	G5163	Не замораживать/размораживать слишком много раз
Пероксидаза хрена (HRP)-конъюгат против кроличьего антитела	Sigma	A6154	Не замораживать/размораживать слишком много раз
Sf9 Клетки	Жизнь Технологии	11496
BL21 Компетентный E. coli	New England Biolabs	C2530H
Белок А Сефароза	Sigma	P2545
Планшеты для клеточных культур	Sigma	CLS3516
Набор для радиоиммунологического анализа	Techno Genetics	12650805	Радиоактивный материал