Method Article

Методы анализа внеклеточной везикул с использованием проточной цитометрии

DOI:

10.3791/52484

⸱

March 17th, 2015

 ,  , 
1Blood Systems Research Institute, 2Department of Medicine, University of California, San Francisco, 3Department of Laboratory Medicine, University of California, San Francisco

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Существует много различных методов для измерения внеклеточной пузырьков (EVS) с помощью проточной цитометрии (FCM). Некоторые аспекты должны быть учтены при определении наиболее подходящего метода для использования. Два протокола для измерения электромобилей представлены, используя либо отдельные обнаружения или подход шарик на основе.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внеклеточной Пузырьки (EVS) малы, мембранные, полученных пузырьки, найденные в жидкостях организма, что активно вовлечены в межклеточной коммуникации и помогают регулировать широкий спектр биологических процессов. Анализ электромобилей с помощью проточной цитометрии (FCM) был крайне сложно из-за их небольшого размера и отсутствия дискретных групп населения положительных маркеров, представляющих интерес. Методы EV анализа, в то время как значительно улучшилось за последнее десятилетие, по-прежнему в стадии разработки. К сожалению, нет один-размер-подходит-всем протокол, и некоторые аспекты должны быть учтены при определении наиболее подходящего метода для использования. Здесь представлены несколько различных методов для обработки электромобилей и два протокола для анализа электромобилей с использованием либо индивидуального обнаружения или подход шарик на основе. Методы, описанные здесь, поможет с устранением агрегаты антител обычно встречаются в коммерческих препаратов, увеличение отношения сигнал-шум и настройки ворота в рациональном FАшион, что сводит к минимуму обнаружение фоновой флуоресценции. Первый протокол использует индивидуальный метод обнаружения, который особенно хорошо подходит для анализа большого объема клинических образцов, в то время как второй протокол использует подход шарик на основе захватить и обнаружить более мелкие электромобилей и экзосомы.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внеклеточной Пузырьки (EVS) малы, мембранные, полученных пузырьки, найденные в жидкостях организма, что активно вовлечены в межклеточной коммуникации и помогают регулировать широкий спектр биологических процессов. Анализ электромобилей с помощью проточной цитометрии (FCM) был крайне сложно из-за их небольшого размера и отсутствия дискретных групп населения положительных маркеров, представляющих интерес. Методы EV анализа, в то время как значительно улучшилось за последнее десятилетие, по-прежнему в стадии разработки. К сожалению, нет один-размер-подходит-всем протокол, и некоторые аспекты должны быть учтены при определении наиболее подходящего метода для использовани....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие протоколы были выполнены в соответствии со всеми институциональном, национальном и международных руководящих принципов для благосостояния человека. Все образцы человеческого субъекта были протестированы в соответствии с этическим комитетом (IRB) -approved протокола и информированного согласия субъектов.

1. МЕТОД: Индивидуальное Метод обнаружения

1.1) переработки крови образца / Изоляция электромобилей

  1. Нарисуйте кровь из донорской / пациента в двух 10 мл стеклянных пробирок, содержащих 1,5 мл ACD-раствора А или другой подходящий антикоагулянт и процесс немедленно (в течение 30 мин ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рисунок 1 описывает общую схему обработки для выделения и обнаружения электромобилей, используя либо метод шарик на основе или индивидуальный метод обнаружения. Индивидуальный обнаружения электромобилей с использованием FCM работает хорошо для анализа больших электромобилей, но большинство цитометры не способны индивидуально обнаружения частиц размером экзосом. Шарик подход позволяет малым электромобилей, которые будут обнаружены, однако, существуют недостатки, связанные с использованием этого метода, к.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Были представлены два различных протокола для выделения, обработки и анализа электромобилей, используя какой-либо отдельный обнаружения или бисером подход. Выбор наиболее подходящего метода для использования не всегда проста и требует понимания тестируемому образцу, а также отдельных групп населения, представляющих интерес. Кроме того, чувствительность цитометром используется для приобретения, должны быть рассмотрены при выборе наиболее подходящего метода. Часто нет единого оптимального используемый протокол, скорее, со.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют никакого конфликта интересов раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить Дейл Hirschkorn от кровеносной систем научно-исследовательского института за помощь в проточной цитометрии настройки прибора. Эта работа была поддержана NIH предоставляет HL095470 и U01 HL072268 и МО контракты W81XWH-10-1-0023 и W81XWH-2-0028.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Настольный проточный цитометр LSR IIBD Biosciences3-лазерный (20 мВт Coherent Sapphire 488 нм синий, 25 мВт Coherent Vioflame 405 нм фиолетовый и 17 мВт JDS Uniphase HeNe 633 нм красный)
FACS Diva software BD BiosciencesPC версия 6.0
Программное обеспечение FlowJo Treestar USMac версии 9.6.1 или ПК версии 7.6.5
Флуоресцентные частицы Sphero RainbowBD Biosciences556298используются для регулировки напряжения всех каналов для поддержания постоянства интенсивности флуоресценции 
Флуоресцентные частицы Ultra Rainbow SpherotechURFP-10-5используется в дополнение к гранулам Megamix-Plus SSC для обеспечения однородности стробирования EV от партии к партии
Бусины Megmix-Plus SSCBiocytex7803используются для регулировки напряжений FSC и SSC  для поддержания   постоянства между прогонами. Также может использоваться для контроля расхода и равномерного расхода для обеспечения использования одного и того же расхода во всех прогонах
AbC Anti-Mouse Bead KitLife TechnologiesA-10344используется для контроля компенсации и отрицательных бусин AbC используется для метода на основе бусин
Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9)Santa Cruz SC-281108используется в индивидуальном методе обнаружения только для лизиса образцов после первоначального считывания для использования в качестве отрицательного контроля. Бульон можно разбавить до 1:10 в PBS и хранить в холодильнике до 1 месяца.
Трубки BD TruCOUNTBD Biosciences340334использоваться в тех случаях, когда необходимы абсолютные концентрации EV
Ultrafree-MC, GV 0.22 &; m Центробежные фильтрующие установкиMillipore UFC30GVNBиспользуются для стирки после окрашивания Evs и/или фракционирования EV в зависимости от размера
стеклянные пробирки для цельной крови Vacutainer пробирки для цельной крови ACD-ABD Biosciences364606
пробирки FAS 12x75 полистронаBD Biosciences352058
50 мл Резервуары в индивидуальной упаковке Наконечники для дозатора PhenixRR-50-1s
Green-Pak - 10 & микро; lНаконечники дляRainin GP-L10S
Green-Pak -200 &; l Наконечники дляGP-L250S
Green -Pak - 1,000 &; l RaininGP-L1000S
Стабильный стек Наконечники L300 предварительно стерилизованные RaininSS-L300S
Pipet-Lite XLS 8 каналов LTS  Регулируемый  Спейсер RaininLA8-300XLS
96-луночные планшеты для культивирования тканейE& K ScientificEK-20180
RPMI 1640 Среда (без Hepes)UCSF Cell Culture FacilityCCFAE001среды, используемые для метода детектирования на основе гранул
Dulbeccos PBS D-PBS, без CaMg, 0,2 &; m фильтрованнаядля культивирования клеток UCSFCCFAL003
ультрацентрифужной пробиркой, тонкостенной, ультрапрозрачнойBECKMAN COULTER INC
PANEL I
CD3 PerCP-Cy5.5Biolegend3448082 &; l
CD14 APC-Cy7Biolegend3018202 & l
CD16 V450BD Biosciences5604742 & микро; l
CD28 FITCbiolegend3029062 & микро; l
CD152 APCBD Biosciences5558552 & микро; l
CD19 A700Biolegend3022262 & микро; l
PANEL II
CD41a PerCP-Cy5.5BD Biosciences3409302 & l
CD62L APCBiolegend304810 2& l
CD108 PE BD Biosciences5528302 & микро; l
CD235a FITCbiolegend3491042 & микро; l
PANEL III
CD11b PE-Cy7 Biolegend3013222 & микро; l
CD62p APCBiolegend304910 2& l
CD66b PE Biolegend3051062 & микро; l
CD15 FITCexalphaX1496M5 & l
CD9 PEBiolegend555372
CD63 APCBiolegend353008
APC-Cy7 Ms IgG2a, κБиолегенда400230
пипеток пипеток Rainin установка 344058

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Andaloussi, S., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
  2. Sugawara, A., Nollet, K. E., Yajima, K., Saito, S., Ohto, H.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Extracellular VesiclesFlow CytometryBead Based DetectionIndividual DetectionPlatelet Poor PlasmaAntibody StainingCytometer SetupFluorescent ParticlesPolystyrene BeadsForward Scatter

Related Articles