Методическая статья

Целевые метилирования ДНК Анализ Следующее поколение Секвенирование

DOI:

10.3791/52488

⸱

24 февраля 2015 г.

 ,  , 
1Department of Physiology, University of Oklahoma College of Medicine, 2Department of Geriatric Medicine, University of Oklahoma College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Бисульфитное ампликонное секвенирование (BSAS) — это метод количественной оценки метилирования цитозина в целевых областях генома, представляющих интерес. Этот метод использует конверсию бисульфита в паре с ПЦР-амплификацией целевых областей перед секвенированием следующего поколения для получения абсолютного количественного определения метилирования ДНК на уровне, специфичном для оснований.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Роль эпигенетических процессов в контроле экспрессии генов известна уже несколько лет. Метилирование ДНК в остатках цитозина представляет особый интерес для эпигенетических исследований, поскольку было продемонстрировано, что оно является как долгосрочным, так и динамическим регулятором экспрессии генов. Усилия по изучению эпигенетических изменений в здоровье и болезнях затрудняются отсутствием высокопроизводительных, количественно точных методов. С появлением и популяризацией технологий секвенирования нового поколения (NGS) эти инструменты теперь применяются в эпигеномике в дополнение к существующим методологиям геномики и транскриптомики. Для эпигенетических исследований метилирования цитозина, в которых были идентифицированы области, представляющие интерес, такие как специфические промоторы генов или островки CpG, и существует необходимость в исследовании значительного числа образцов с высокой количественной точностью, мы разработали метод, называемый бисульфитным ампликонным секвенированием (BSAS). Этот метод сочетает в себе бисульфитную конверсию с целенаправленной амплификацией областей интереса, транспосом-опосредованным построением библиотеки и настольным NGS. BSAS предлагает быстрый и эффективный метод анализа до 10 кб целевых областей в 96 образцах за раз, который может быть выполнен большинством исследовательских групп с базовыми навыками молекулярной биологии. Полученные результаты обеспечивают абсолютное количественное определение метилирования цитозина с базовой специфичностью. BSAS может быть применен к любому участку генома из любого источника ДНК. Этот метод полезен для проверки гипотез в отношении целевых областей, представляющих интерес, а также для подтверждения областей, идентифицированных в анализах метилирования по всему геному, таких как бисульфитное секвенирование всего генома, бисульфитное секвенирование с уменьшенной представленностью и иммунопреципитация метилированной ДНК.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Прошло уже более полувека с момента первого доклада естественным изменения ДНК в виде цитозина метилирования 1. Цитозин метилирование представляет собой модифицированный нуклеотид цитозин базовой где 5-й углерода от основного кольца имеет метильную группу (5-MC), наиболее часто встречающихся в динуклеотид CpG мотивов в геномах млекопитающих. Функциональный наличие 5-MC в промоторов генов, как правило, связаны с транскрипционной репрессии, а отсутствие связано с транскрипционной активности 2.

Огромные успехи были достигнуты в нашем понимании роли метилирования ДНК в развитии 3, распространения transgeneration эпигенетических профилей 4, патогенез рака 5,6, и ряд других научно-исследовательских областях. Многие из этих достижений стали в последние несколько лет, как новые методы были разработаны в профиль метилирования ДНК 7. С появлением ипопуляризация последовательности (NGS) методов нового поколения в настоящее время ряд методов профиль метилирования ДНК в пределах всего генома или крупных регионов генома 8. Эти подходы открывают возможность изучения обнаружения, количественной ДНК метилирования и различия в метилирования ДНК. В дополнение к этим гипотеза, приносящей подходов, есть значительная потребность в целевых / проверки гипотез ДНК методами метилирования количественного определения.

Пиросеквенирование, метилирование специфичная ПЦР и прямого Sanger секвенирования бисульфит преобразованного ДНК были наиболее используемых методов для анализа целевых регионах (например, область промотора одного гена или остров CpG) 9-12. Все эти методы основаны на бисульфита преобразования, в результате химической реакции дезаминирования, где неметилированные цитозина конвертируются в урацил, тогда как метилированных цитозина годов остаются неизменными 13,14. ПЦР-амплификация bisulfite-преобразованные результаты ДНК в замене урацила с тимин 15, позволяющие дифференциального метилирования считывать как разница базу. В то время как весьма полезным, ограничения этих методов относятся низкий количественный точность, короткую длину читать, и низкую пропускную образца. Для устранения этих недостатков был разработан метод мы назвали бисульфит Amplicon Секвенирование (BSAS) 16. Цель этого метода состоит в том, чтобы иметь возможность анализировать целевые геномные районы, представляющие интерес в большом количестве образцов с высокой количественной точностью.

BSAS использует элементы существующих методов (бисульфит преобразования и конкретного региона ПЦР-амплификации) и объединяет их с простой конструкцией следующего поколения библиотеку (transposome-опосредованной) 17 и настольный NGS 18 (рисунок 1). Такой подход обеспечивает более количественного и выше способа пропускной изучения цитозин метилирование в любой интересующей области. Здесь мы представляемМетод подробно и описать подходы для поиска неисправностей и проверки качества процесса BsAs.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Нуклеиновые кислоты Изоляция из ткани,

Примечание: Со-Выделение ДНК и РНК из того же образца ткани дает возможность собирать ДНК для анализа и эпигенетическом паре РНК для анализа экспрессии генов. Пример, приведенный здесь, является одной из форм очистки колоночной из экспериментальной ткани, но альтернативные подходы в различных типов образцов или других методов изоляции может быть использован. Основное требование для высокоочищенной нуклеиновой кислоты без загрязнения белок или органические растворители.

  1. Выберите кусок свежемороженой или свежей ткани для механической гомогенизации и место на льду. Магазин или передача в ткани на 2,0 мл с круглым дном трубки микроцентрифужных.
  2. Добавить один 5 мм шарик нержавеющей стали в каждую пробирку, содержащую ткани. Добавить соответствующее количество буфера для лизиса, на основе предложений производителя количеству клеток или веса ткани.
  3. Однородный тканей с помощью шаровой мельницы механической гомогенизации при30 Гц в течение 30 сек.
    Примечание: Частота и продолжительность механической гомогенизации зависит от типа ткани. Мягкие ткани полностью гомогенизации с использованием рекомендованных параметров, в то время жесткие ткани требуют установки оптимизации.
  4. Провести выделения ДНК и РНК с использованием силикагеля спин колонки при комнатной температуре в соответствии с протоколом производителя.
    1. Элюировать РНК в 50 мкл РНКазы свободной воды и место на льду. Используйте РНК для анализа экспрессии мРНК КПЦР.
    2. Элюции ДНК в 100 мкл ТЕ-буфера. Повторите элюирование с колонки ДНК с использованием в качестве элюента, чтобы увеличить концентрацию ДНК и выход. Используйте ДНК для целевого метилирования количественного определения.
  5. Оценка качества ДНК и РНК с помощью стандартного спектрофотометра по поглощению при 230 нм, 260 нм, 280 нм, и 320 нм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: соотношение / A280 A260 должно быть ~ 1,8-2 для качественного ДНК. Отношение / A280 A260 должно быть ~ 2 для качественного РНК. Наличие избыточного поглощения при 230 нм индийскихАтеш загрязняющих веществ из процедуры выделения.
  6. Проверки качества РНК за счет использования чипа капиллярного электрофореза в соответствии с инструкциями изготовителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Высокое качество РНК будет иметь ряд целостности РНК (РИН)> 8. Наличие дополнительных пиков в electropherogram кроме рРНК пиков показывают загрязнение пробы.
  7. Количественная ДНК и РНК флуоресцентного исследования в соответствии с протоколом производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование флуорометрического анализа является более чувствительным и специфичным для количественной оценки нуклеиновых кислот, чем спектрофотометрии в одиночку.
  8. Магазин изолированных ДНК и РНК при -80 ° С.

2. Цель Выявление и праймеров

  1. Определение геномной области (ы) интересов, которые будут проанализированы BSAS на основе соответствующей последовательности генома ссылка. Промоторы генов дифференциально выраженных генов являются общими целями метилирования количественного определения.
  2. Подготовка в силикомарганца бисульфита-новообращенногоред референсный геном для последующего выравнивания последовательности читает, изменяя файл .fasta последовательности в текстовом редакторе. В ориентации 5'-3 ', заменить не-CpG цитозин с тимин (рисунок 2).
  3. Дизайн наборов праймеров для амплификации представляющих интерес областей из бисульфита преобразованного ДНК.
    1. Выделите и скопируйте непревращенный область интереса, в ориентации 5'-3 ', в бисульфита-специфической ПЦР разработки программы грунтовка (рисунок 3).
      Примечание: оптимальное бисульфит-ПЦР Длина ампликона является 250-400 п.о. в ампликона как бисульфит фрагментов ДНК лечения и трудно для амплификации больших> 400 регионов BP. Если, например, область 1 кб представляет интерес, несколько пар праймеров могут быть разработаны, чтобы покрыть эту область. Дизайн ампликоны быть одинакового размера б.п. для легкого объединения. Избегайте длин ампликонов <250 б.п., потому что они могут быть недостаточной длины для библиотеки поколения. Оптимальная длина грунтовка для BSAS является>На 20 б.п. за грунтовкой.
    2. Выберите T м Дальность 55-65 ° C и разность М А макс T между прямого и обратного праймеров 1-2 ° C.
    3. Выберите пары праймеров, которые лучше всего покрыть область интереса. Не выбирайте праймеров, которые содержат сайты CpG или непосредственно примыкают к сайтам CpG, так как это вызовет смещение в реакциях ПЦР. Используйте стандартные ПЦР-праймеров, которые можно заказать из любого количества академических и коммерческих поставщиков.
    4. Воссоздания лиофилизированной праймеров в РНКазы / ДНКазы свободной воды в рабочем складе 100 мкМ.
  4. Магазин ПЦР-праймеры при -20 ° С. Развести 100 мкм праймера акции до 10 мкм, работающих акции для ПЦР-реакций.

3. бисульфит специфической ПЦР Оптимизация

Примечание: Для бисульфит конверсии геномной ДНК, число различных коммерческих наборов для бисульфита преобразования доступны. Выберите набор или протокол, который наилучшим образом соответствует намеченной эксперимент.

<ол>
  • Использование от 200 нг до 2 мкг геномной ДНК. Для оптимизации экспериментов, запустить несколько процессов превращения для того, чтобы иметь достаточно бисульфит преобразуются ДНК для нескольких реакций BS ПЦР.
  • Используйте маленькие (например, 10 мкл) объемы элюирования бисульфита преобразованного ДНК, чтобы поддерживать высокие концентрации ДНК.
    Примечание: 1-2 мкл бисульфита преобразованного ДНК является достаточным для оптимизации ПЦР-реакций, если 1 мкг геномной ДНК использовали для ввода преобразования.
  • Усиливаются бисульфит преобразованный ДНК, бисульфита специфической ПЦР. БС-ПЦР-реакции требуют использования Taq-полимеразы, способной усиливать бисульфит преобразованный ДНК.
    1. Собирают следующую реакцию для оптимизации целевой амплификации одного ампликона. Для нескольких образцов, сборку реакции в 96-луночный ПЦР пластины.
      25 мкл 2x реакционного буфера
      0,5 мкл дНТФ Mix
      5 мкл 10 мкМ прямого праймера (Final 1 мкМ)
      5 мкл 10 мкМ обратного праймера(Final 1 мкМ)
      2 мкл шаблон бисульфит преобразуются ДНК
      0,4 мкл (5 Е / мкл) ДНК-полимераза
      12,1 мкл ДНКазы воды (конечный объем 50 мкл реакционной смеси)
    2. Уплотнение ПЦР пластины с соответствующим клеем или термосварного пленки.
    3. Поместите реакцию в соответствующем термоциклер и использовать следующие условия велосипедные с подогревом крышкой:
      1. Выполнение первоначальной денатурации при 95 ° С в течение 10 мин.
      2. Денатурация при 95 ° С в течение 30 сек.
      3. Отжиг в течение 30 сек в конкретном Т м праймеров используется. Начало при температуре отжига несколько ° C ниже T м праймера для реакций оптимизации.
        Примечание: Лучшие температуры отжига также может быть определена с использованием градиента термоциклер, чтобы проверить диапазон температур.
      4. Выполнение удлинение при 72 ° С в течение 30 сек. Увеличьте время расширения для более ампликонов.
      5. Повторите шаги 3.3.3.2-3.3.3.4 для 35 циклов дляТаль для начальной оптимизации. Большее число циклов может быть необходимым, но как правило, следует избегать, чтобы предотвратить клоновых уточнения, которые будут создавать артефакты реакции.
      6. Выполнение окончательного удлинение при 72 ° С в течение 7 мин.
      7. Удержание реакции при 4 ° С.
    4. Визуализация ампликонов за страницей электрофореза. Кроме того, использование ДНК-чипа капиллярного электрофореза в соответствии с протоколом производителя.
      1. Смешайте 24 мкл ПЦР-реакции с 6 мкл 5х красителем на льду и вихря.
      2. Сделать 1 л 1x КЭ рабочего буфера путем смешивания 200 мл 5х буфера TBE работает и 800 мл DDH 2 O. Развести ДНК лестнице для конечной концентрации 0,5 мкг на лунку в DDH 2 O и красителем.
      3. Загрузка скважины с 30 мкл ПЦР-реакций или лестница.
      4. Запустите гель при 200 V для ~ 45 мин. Остановка гель проход, когда первый передний краситель достигает конца геля.
      5. Пятно гель с 5 мкг / млбромистый этидий путем смешивания 5 мкл 10 мг / мл в 100 мл DDH 2 O. Обложка весь гель и пусть инкубировать в течение ~ 5 мин.
      6. Image гель через окна УФ или в смешанных тепловизора при длине волны возбуждения 482 нм.
      7. Со ссылкой на лестнице, размер ампликонов ПЦР и определить специфичность реакции, глядя на несколько полос, кроме ожидаемого размера ампликонов (рис 4а и С).
    5. После того, как оптимальные условия для BS-ПЦР были определены, выполните BS-ПЦР на экспериментальных образцах.
      1. Очищают ампликонов из оставшихся праймеров и других реакционных компонентов. Выполните очистку колонке с силикагелем, SPRI шарик, или гель на основе очистку и количественное.
      2. Элюции ампликоны в 30 мкл ТЕ-буфера.
      3. Количественная ампликоны помощью флуорометрического анализа с использованием протоколов производителя.
      4. Если есть несколько ампликоны на образец, бассейн их на равном массе на объемсуммы и хранить при -20 ° С.

    • 4. NGS Библиотека Подготовка и библиотека QC

    ПРИМЕЧАНИЕ: BSAS NGS подготовка библиотека использует упрощенную протокол transposome-опосредованной с двойной индексацией (см список материалов для подробной информации о библиотеке подготовки выбора комплекте). Этот метод обеспечивает чрезвычайно быстрое и высокой пропускной маршрут для создания библиотеки, которая была утверждена и показывает практически нет предвзятости в бисульфитных секвенирования приложений 16,19. Dual-индексирование позволяет более высокой мультиплексирования образцов, чем одного индексации. Другие библиотеки стилей препарат может быть возможно, но не были испытаны.

    1. Подготовка NGS библиотеки из БС ПЦР ампликонов в 96-луночный ПЦР пластины. Развести ампликонов до 0,2 нг / мкл для окончательного ввода массы 1 нг, или 5 мкл 0,2 нг / мкл разведения. Выполните очистку образующихся библиотек с использованием шариков SPRI. Используйте 50-90 мкл бисер SPRI для выделения библиотеки WIth этого протокола. Объем бисером SPRI зависит от заданного размера библиотеки и числа циклов желаемых реакций секвенирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте Микропланшетный шейкер или пластины Vortexer ресуспендировать бусы.
      1. Элюируйте библиотеки с бисером и перейти на новую 96-луночного планшета и печать с термосклеивающего пленки для хранения при -20 ° C.
    2. Определить размер и концентрацию библиотек (рис 4В и г).
      1. Запуск библиотеки на капиллярного электрофореза ДНК проклейки чип в соответствии с протоколами производителя.
        1. Использование высокой чувствительности анализа капиллярный электрофорез ДНК, чтобы определить средний размер обнаруженных пиков библиотеки и оценку молярность в соответствии с протоколами производителя.
      2. Количественная библиотеки с помощью количественной ПЦР, с использованием праймеров, сконструированных на адаптере последовательностей в генерируемых библиотек и стандартов использования с известной концентрацией.
        1. Выполнить КПЦР Reдействия в режиме реального времени инструмента с использованием параметров абсолютного количественного согласно протоколам производителя.
        2. Используйте размер библиотек и молярную количественное от кПЦР для расчета молярных концентраций библиотек.
    3. Развести библиотеки 4 нм с использованием 10 мМ Трис-Cl с 0,1% твина-20 при рН 8,5. Магазин библиотеки в 96-луночный ПЦР пластины запечатанную термосваркой пленки при -20 ° С.

    5. Последовательность библиотек, использующих секвенсора Настольная

    1. Оттаять и подготовить реагенты в соответствии с инструкциями изготовителя.
    2. Оттепель 4 нм библиотеки на льду.
    3. Сделайте 1 мл 0,2 N NaOH в 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
    4. Бассейн 4 нм библиотеки в равных количествах громкости, если несколько библиотек, которые будут использоваться.
    5. Развести и денатурации объединенных библиотек в соответствии с инструкциями изготовителя до желаемой конечной концентрации молярной.
      1. Держите разбавляют и денатурацииобъединили библиотека на льду до готовности загрузить на реагента картриджа.
    6. Создать образец листа, содержащего названия образцов и соответствующую информацию индекса и указать для создания .fastq только файлы.
      1. Образец листа нагрузки в соответствующей папке образец листа на секвенсор.
    7. Добавить в общей сложности 600 мкл разведенного и денатурированного библиотеки в картриджа с реагентом в соответствующие лунки.
    8. Запустите секвенирования реакции до завершения.

    Анализ 6. Метилирование Количественный данных

    ПРИМЕЧАНИЕ: Есть несколько программ, доступных для анализа данных NGS в том числе коммерческого, так и с открытым исходным кодом. Подробная информация о запущенных программах можно найти с каждым конкретным пакетом. Общие инструкции даны на каждом этапе наряду с определенными командами для данного пакета. (См список материалов для подробной информации о программном обеспечении, используемых в этом протоколе).

    1. Импорт файлов .fastq.gz в соответствующие SEquencing анализа трубопровода удерживающий качества оценки (Qscores) для использования в чтение обрезки. (Для этого примера программы выберите "Импорт" и выберите метод секвенирования, используемый для генерации говорится в сообщении. Выберите .fastq.gz читать файлы для импорта, и сохранить Qscores от .fastq файлов для чтения обрезки приложений, сняв «Сбросить показатели качества в разделе 'Генеральным Параметры ". Выберите место для импортированы читает и выберите« Готово ».)
      1. Обрезать и сохранить читает, используя следующие настройки в анализ данных трубопровода NGS. (Для этой программы выберите 'Trim последовательностей в разделе' NGS Основные инструменты ", и выберите читает быть обрезаны.)
        1. Сохраните только читает, содержащий ≥ Q30 баллы. (Для этой программы выберите 'Trim, используя показатели качества »и установите лимит в 0,001.)
        2. Сохраните только читает, содержащий ≤ 1 неоднозначное нуклеотида. (Для этой программы выберите 'Trim неоднозначные нуклеотидов' и устанавливает'Максимальное количество неясностей "до 1. Выберите место для сохранения обрезанного читает и выберите" Готово ".)
      2. Карта отделаны читает в в силикомарганца бисульфита преобразованы ссылкой генов от 2,2. (Для примера программного обеспечения выберите 'Карта Читает задание »под« NGS Основные Сервис ". Выберите отделаны читает быть нанесены на карту и выберите" Далее ". Выберите преобразованный эталонной последовательности и выберите' нет маскировки в разделе 'справочной маскировки». Выберите " следующий '.)
        1. Назначьте максимальное наказание за несоответствия, вставки и удаления. Установка параметров таким образом, что 100% от длины чтения требуется отобразить идентичности последовательности с 90%. Например, программное обеспечение, назначить балл 3 для несоответствия, вставки и удаления. Связать 1 балл за минимальную долю длины чтения отображается в ссылке, и назначить балл 0,9 для минимальной доли идентичности между отображенных читать и ссылки.
        3. Для вывода выравнивания генерировать каждый образец в качестве независимого файла. Например, программное обеспечение, выберите "Создать автономный читать отображения в разделе 'параметры вывода» и «Сохранить» в разделе' обработки результата ». Выберите место для сохранения отображение чтения и выберите «Готово».
      3. Запуск вариант вызова рабочего процесса на карту читает. Для примера программного обеспечения, выберите 'вероятностные Variant Обнаружение в разделе' дочивающей анализа », выберите отображение чтения, которые необходимо проанализировать и выберите" Далее ". Выберите "Игнорировать неспецифические матчи в разделе 'Читать фильтры" и выберите "Далее".
        1. Убедитесь, что последовательность в DEPго ≥ 1000 X, установив "минимальное покрытие" под "значении", до 1000.
        2. Убедитесь, что вызов вариант присутствует в прямом и обратном говорится в сообщении. Например, программное обеспечение, выберите "Требовать присутствия в прямом и обратном стенды в разделе 'Variant фильтров" и выберите "Далее".
        3. Экспорт выровнены, вариант, называемый данные в виде аннотированной таблице. Например, программное обеспечение, выберите "Создать аннотированный таблицу в разделе 'параметры вывода" и выберите папку для сохранения файла вариант таблицы. Выберите 'Finish'.
    2. Рассчитать 5-MC процент использованием частоты вариант, при аннотированных сайтов CpG в области, представляющей интерес из файла вариант таблицы. Частота цитозина в опорном С в CG процент 5-MC.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании вариант вызова алгоритмов для высококвалифицированных метилированных CpG-х годов, заменить CpG цитозины с thymines. Это идентифицируетFY отображается цитозина, как варианты, в результате чего частота цитозина в CpG-х.
    3. Определить эффективность преобразования бисульфит (BSC) путем вычисления первого процент C не в CpG-сайтов в качестве ссылки (C). Умножьте процент не CpG C годов по количеству отображается (Т пл) Всего T, и разделите на общее C сопоставляется при обращении T в (C MPT). 100 минус частота вычисляется является бисульфит эффективность преобразования (BSC) этой библиотеки (уравнение 1).

    figure-protocol-1

    Уравнение 1. бисульфит эффективность преобразования.
    Примечание: В то время как геномы млекопитающих содержат очень низкие количества не-CpG метилирование цитозина (за исключением потенциально стволовых клеток 20), растительные геномы содержат значительное количество. Для того чтобы определить эффективность преобразования бисульфит в этих Ссылки на сайтые геномы, подходящий путь заключается в последовательности часть митохондриального генома или хлоропластов генома или известных неметилированных генов, присутствующих в геномов растений 21 и расчета эффективности преобразования, как описано выше. Бисульфит эффективность преобразования должна быть ≥98% в большинстве случаев, с необращенных C, теоретически, возникающие от не CpG метилирования.

    Результаты

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    BSAS читает правильно выровнены по преобразованного эталонной последовательности будет напоминать рис 5. CpG динуклеотиды, очевидно, может быть идентифицирован и метилирования государства можно оценить, наблюдая базовые звонки в CpG-сайтов в карту читает. Например, с контрольной группой метилирования, 0% метилирование может привести к всего считывает карту, чтобы CpG сайты, содержащие T, (фиг.5А). 100% контроль метилирования приведет все чтениями читает CpG сайтов, содержащих С (рисунок 5б).

    Количественное определение частоты цитозин (С / С + Т) на участках CpG дает частоту метилирования в исходном образце. Представитель стандартной кривой, полученной из цельных элементов управления геном метилирования (N = 3 / Отношение метилирование) показывает, линейность метилирования количественного, а также точность количественного при каждом соотношении метилирования (Рисунок 6). В качестве примера этого способа в целом, РНК и ДНК были совместно ISO ванное от мозжечка мыши и сетчатки (п = 4 / группу). Родопсин выражение, селективно выраженный в ткани сетчатки, была измерена с помощью КПЦР. Выражение было обнаружено только в сетчатке (рис 7А). Использование BsAs, уровни метилирования CpG количественно в регионе родопсина промоутер. Совокупные уровни метилирования по всему региону промоутер были> 80% в мозжечке по сравнению с <15% клеток сетчатки (р <0,001, параметрический т-тест) (Рисунок 7b). BsAs метилирование количественного преимущества от конкретных участков метилирования количественного и уровни метилирования можно сравнить на CpG-специфической основе во любой момент геномной области. Уровни метилирования CpG всей родопсина промоутер были значительно выше в мозжечке образцов по сравнению с сетчатки образцов (р <0,001, параметрический т-тест на каждом участке CpG) (7С).

    1highres.jpg "/>
    Рисунок 1:. Схема метода СДБМ В этом способе геномной ДНК бисульфитом преобразованный изменить unmethylation цитозина в урацила. Впоследствии, во ПЦР эти урацилы изменяются на thymines. ПЦР-амплификацию направлено против районов, представляющих интерес и очень обогащает для всего этих последовательностей. Полученные ПЦР ампликонов сделаны в двойной индексированные библиотек через простой процесс tagmentation. Впоследствии библиотеки последовательность на настольном секвенсор нового поколения и последовательность чтения отображаются на в кремнии преобразуется опорной последовательности и процентов метилирования цитозина определяется в базовой-специфическим образом.

    figure-results-1
    Рисунок 2:. В силикомарганца бисульфита преобразования области интереса Любой регион представляет интерес с любой геномной ссылка может быть СелецТед ибо в силикомарганца бисульфита преобразования. Номера CpG цитозины заменяются тимин находится в эталонной последовательности. CpG цитозины остаются цитозины в бисульфит преобразуются ссылку.

    figure-results-2
    Рисунок 3:. Грунтовка размещение бисульфит ПЦР-праймеры предназначены против в силикомарганца бисульфит преобразуются эталонной последовательности. Праймеры должны быть разработаны так, что они не перекрываются CG динуклеотиды или предназначены рядом с CG динуклеотидах.

    figure-results-3
    Рисунок 4: Примеры высоких и бедных ампликонов качество ПЦР и секвенирования библиотек Представительства electropherogram следы и гель-шоу () идеал ампликон для transposome-опосредованной поколения библиотека с одной высокой.концентрация продукта. (B) Библиотека информации из этой ампликоне показывает высокую концентрацию и даже распределение по размерам. (C) Плохое качество ПЦР ампликонов может быть низкой по размеру, концентрации и содержать несколько товаров и / или праймер-димеров. Эти низкого качества ампликонов приведет к (D) не библиотека поколение с низкой концентрацией и низкой распределением по размерам.

    figure-results-4
    Рисунок 5: Примеры секвенирования выходов из управления метилирования. () В кремнии преобразуется ссылка команд с сайтов CpG выделены красным цветом. 0% контроль метилирование отображается читает выбранного региона показывает thymines (жадность подсветкой) карт на сайтах CpG. Управления (B) 100% метилирование отображается читает показать (синий подсветкой) отображение цитозин по адресу сайтов CpG.


    Рисунок 6:. Метилирование количественного по целому ряду управления метилирования весь геном управления метилирования смешанные в соотношении метилирования (N = 3 / отношение) от 0% до 100% были количественно с помощью BsAs. Построение количественной оценки ожидается против количественных демонстрирует линейность управления метилирование количественного определения. Во всех элементов управления, наблюдалась высокая точность метилирования количественного определения.

    figure-results-5
    Рисунок 7: Пример парных метилирования ДНК и экспрессии генов анализа из образцов тканей. () Родопсин относительно экспрессия мРНК из мозжечка мыши и ткани сетчатки. (B) Родопсин среднем метилирования промотора количественно BSAS между мозжечка и сетчатки ДНК (*** р <0,001, параметрический Т-тест). C) CpG сайт-специфические уровни метилирования всей родопсина промотора (-244 до 6, по отношению к сайту инициации транскрипции [TSS]) в мозжечке мыши и сетчатки ДНК.

    Обсуждение

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    BSAS позволяет целенаправленной, точной метилирования ДНК количественного с высокими возможностями пропускной способности в оба Количество образцов и количество целей. Кроме того, эта библиотека поколения с использованием transposome-опосредованной tagmentation требует меньше ввода ДНК, быстрее и содержит меньше шагов, чем традиционные стрижки и последующих методов лигирования адаптеров. Эти усовершенствования по сравнению с существующими методами позволяет точно базового уровня метилирования ДНК анализа любой цели, представляющей интерес. Кроме того, BSAS обеспечивает новый метод для подтверждения регионах, представляющих интерес (дифференциально регионы метилирования (DMRs), CpG островков, регуляторных областей), которые были определены с помощью целого генома бисульфит 22 ​​или захватить 23 подходов. Использование ортогональных подходы подтверждения и более количественно точные методы улучшает аналитическую строгость эпигеномном исследований. Высокая глубина чтения достигается с BSAS позволяет точно оценить в узком доверительном интервале, повторноконсалтинговой в точную количественную оценку 16. Кроме того, способность запускать многие образцы в одном эксперименте можно увеличить размер выборки для подтверждения целых методов генома, что позволит увеличить статистическую мощность; Слабость многих современных эпигенетических исследований. Важно отметить, что BSAS обеспечивает базовый конкретных CpG метилирования подсчета, которая позволяет для генерации проверяемых гипотез для эпигенетической исследований. Гипотезы, такие как увеличение метилирования в определенном элементе реакции приведет к снижению связывания конкретного фактора транскрипции. BSAS, в сочетании с парных данных экспрессии мРНК, относится к способу получения как эпигенетической регуляции и экспрессии мРНК в течение одного куска ткани или клеточной популяции. Парные измерения регулирования и выражения также увеличить научную строгость и влияние результатов.

    Основные этапы в протоколе СДБМ включают праймеров, оптимизация ампликона и библиотеки поколение /QC. Смещения ПЦР вводится, если грунты не предназначены правильно и усиливаются при различной эффективностью 8. Использование метилирования стандартов, таких как ферментативно генерируемых 100% и 0% цитозина метилированных стандартов, могут быть использованы для определения степени, если таковые имеются, метилирование количественного смещения, и собственно методологический контроль при количественной метилирование 16. Кроме того, следует соблюдать осторожность при оптимизации ПЦР-реакции для генерирования одного высококачественного ампликона. Если не ампликон не присутствует с использованием предложенных руководящими принципами, изложенными в протоколе, меры по оптимизации включают в себя все большее число ПЦР циклов или количество входной bsDNA. Если имеется несколько ПЦР-продукты, в том числе праймеров димеров, шаги оптимизации включают в себя уменьшение количества входной bsDNA, уменьшение молярные концентрации входных ПЦР-праймер, повышение температуры отжига или уменьшении числа PCR цикл. Один или сочетание этих процедур оптимизации дает достаточные результаты для генерации одного HIGH-качество ампликон. Кроме того, реорганизации праймеров хорошо подходят для наборов праймеров, которые не дают ни одного ампликон. Для тех регионах, где реконструкция не подходит или это возможно, вырождаются наборы праймеров в том числе оба могут работать цитозин-х и тимин по адресу CpG-сайтов в прямых праймеров и аденин-х и гуанин-х в CpG-сайтов в обратных праймеров. Тем не менее, эти наборы праймеров нуждаются в дальнейшей оптимизации, чтобы убедиться в отсутствии ПЦР смещения происходит, процесс вне рамок этого протокола. Библиотеки Качество очень важно для достижения успеха. Убедитесь, что меры контроля качества осуществляется для определения размера, качества и количества библиотек, прежде чем секвенирования. Реакции секвенирования может привести к неудачам с вводом низкого качества библиотек. Смещение в метилирования количественного могут быть смягчены за счет обеспечения, что частоты метилирования присутствуют в прямом и обратном последовательности читает. Кроме того, качество оценки оснований, совместив на сайты CpG должны быть ≥Q30 за большой сотрудничестваnfidence в количественного определения. В то время как другие, ранее практически не показано, не предвзятость в tagmentation реакций бисульфита преобразованного ДНК 19, обеспечивая показатели, описанные выше, позволяет для подтверждения низкого метилирования смещения количественного определения.

    BSAS настоящее измеряет метилирование CpG на участках, однако, будущие расширения этого метода позволит паре измерений CpG 5-HMC с добавлением экспериментальных этапов, отличающих между 5-MC и 5-HMC, таких как введение перрутенат калия до бисульфита преобразования 24. Это приведет к увеличению влияния СДБМ полезности, позволяя для парного метилирования, как 5-MC и 5-HMC, и данные экспрессии с целью определения экспрессии генов регуляторную роль метилирования ДНК. Transposome-опосредованной препарат библиотека ПЦР ампликонов действительно приводит к уменьшению глубины секвенирования на концах амплифицированных областей. Таким образом, регионы большой интерес должен быть разработан проживать в середине ампликонов. Каклибо, потому что BSAS генерирует последовательность чтения глубины> 1000 X, количественного точности 5-MC измерений вблизи концов амплифицированных областей остается высокой.

    Раскрытие информации

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Авторам нечего раскрывать.

    Благодарности

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Авторы благодарят Коллин Ван Кирк за образцы сетчатки и мозжечка мыши, а также Питера Грегори за создание фигуры. Авторы также благодарят доктора Эллисон Гилласпи и ядро исследований Лаборатории молекулярной биологии и цитометрии за доступ к MiSeq. Эта работа была поддержана грантами NIH DA029405, EY021716 и AG026607 и Фондом Дональда Рейнольдса.

    Материалы

    Список материалов, использованных в этой статье
    ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
    Agilent 2100 БиоанализаторAgilentG29393AA
    Agilent RNA 6000 Nano kitAgilent 5067-1511
    Agilent High Sensitivity DNA kitAgilent5067-4626
    Typhoon 9200Amersham/GE Healthcare Life Sciences
    Agencourt AMPure XP - Очистка ПЦРBeckman CoulterA63880 5мл
    PowerPac Basic Power Supply BioRad164-5050
    twin.tech PCR планшет 96 Eppendorf951020362полуюбка
    Термосвариваемая пленкаEppendorf0030127838
    термосвариваемая пленкаEppendorf0030127854
    термосваривательEppendorf5390000.024
    0.1-10 μ l TipsEppendorf0030073.002
    2-200 μ l TipsEppendorf0030073.045
    50-1,000 μ l НаконечникиEppendorf0030073.100
    MixMate Eppendorf5353000.014
    1,5 мл МикроцентрифугаEppendorf0030121.023
    Центрифуга 5424Eppendorf5424000.010
    2,0 мл Микроцентрифуга ПробиркаEppendorf022363352
    Набор для подготовки образцов ДНК Nextera XTIlluminaFC-131-102424 rxn
    Nextera XT Index KitIlluminaFC-131-100124 индекса
    MiSeq Desktop SequencerIllumina
    MiSeq Reagent Kit v2IlluminaMS-102-2002300 циклов
    KAPA SYBR FAST Универсальный набор для количественной ПЦРKAPA BiosystemsKK4824
    Quant-iT PicoGreen dsDNA Analysis kitLife TechnologiesP7589
    Quant-iT RiboGreen RNA Assay kitLife TechnologiesR11490
    96-луночная ПЦР-система ProFlexLife Technologies4484075
    Novex 6% TBE ДНК-гельLife TechnologiesEC6261BOX10-луночный
    Novex TBE Running BufferLife TechnologiesLC66755x (1 л)
    Novex Hi-Density TBE Sample BufferLife TechnologiesLC66785x (10 мл)
    1 Kb Plus DNA LadderLife Technologies10787-018
    Xcell SureLock Mini-CellLife TechnologiesEI0001
    UltraPure 10 мг/мл Бромид этидияLife Technologies15585-011
    7900HT Быстрая система ПЦР в реальном времениLife Technologies4329001384-луночный блок
    DynaMag-96 Side SkirtedLife Technologies12027
    SpectroMax M2 Многомодовый Считыватель микропланшетовМолекулярные устройства/VWR89429-532
    AllPrep ДНК/РНК Мини-наборQiagen80204
    Бусины из нержавеющей сталиQiagen699895 мм
    CLC Genomics WorkbenchQiagenПрограммное обеспечение для конвейера метилирования
    QIAQuick Набор для очистки ПЦРQiagen2810450 rxn
    TissueLyser IIRetsch/Qiagen85300
    Вода без нуклеазыSigmaW4502
    TRIS гидрохлоридSigmaPHG0002-100G
    Tween-20SigmaP9416-50ML
    NanoDrop 2000Thermo Scientific
    384-луночная полноразмерная пластина, стандартThermo ScientificAB-1384
    Абсолютная кПЦР SealThermo ScientificAB-1170
    EZ Набор для метилирования ДНКZymo ResearchD503050 rxn
    ZymoTaq ДНК-полимеразаZymo ResearchE200150 rxn

    Ссылки

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Hotchkiss, R. D. The quantitative separation of purines, pyrimidines, and nucleosides by paper chromatography. The Journal of Biological Chemistry. 175 (1), 315-332 (1948).
    2. Bird, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes & Development. 16 (1), 6-21 (2002).
    3. Smith, Z. D., Meissner, A. DNA methylation: roles in mammalian development. Nature reviews. Genetics. 14 (3), 204-220 (2013).
    4. Heard, E., Martienssen, R. A. Transgenerational epigenetic inheritance: myths and mechanisms. Cell. 157 (1), 95-109 (2014).
    5. Baylin, S. B. DNA methylation and gene silencing in cancer. Nature Clinical Practice. Oncology. 2, Suppl 1. S4-S11 (2005).
    6. Baylin, S. B. The cancer epigenome: its origins, contributions to tumorigenesis, and translational implications. Proceedings of the American Thoracic Society. 9 (2), 64-65 (2012).
    7. Beck, S., Rakyan, V. K. The methylome: approaches for global DNA methylation profiling. Trends in Genetics : TIG. 24 (5), 231-237 (2008).
    8. Laird, P. W. Principles and challenges of genomewide DNA methylation analysis. Nature reviews. Genetics. 11 (3), 191-203 (2010).
    9. Mikeska, T., et al. Optimization of quantitative MGMT promoter methylation analysis using pyrosequencing and combined bisulfite restriction analysis. The Journal of Molecular Diagnostics : JMD. 9 (3), 368-381 (2007).
    10. Kreutz, M., Hochstein, N., Kaiser, J., Narz, F., Peist, R., et al. Pyrosequencing: powerful and quantitative sequencing technology. Current Protocols In. Molecular Biology / edited by Frederick M. Ausubel ... [et al.]. 104 (Unit 7 15), (2013).
    11. Dikow, N., et al. Quantification of the methylation status of the PWS/AS imprinted region: comparison of two approaches based on bisulfite sequencing and methylation-sensitive MLPA. Molecular And Cellular Probes. 21 (3), 208-215 (2007).
    12. Parrish, R. R., Day, J. J., Lubin, F. D., et al. Direct bisulfite sequencing for examination of DNA methylation with gene and nucleotide resolution from brain tissues. Current Protocols In Neuroscience / editorial board, Jacqueline N. Crawley ... [et al.]. 7 (Unit 7 24), (2012).
    13. Shapiro, R., Servis, R. E., Welcher, M. Reactions of uracil and cytosine derivatives with sodium bisulfite. A specific deamination method. Journal of the American Chemical Society. 92, 422-424 (1970).
    14. Hayatsu, H., Wataya, Y., Kazushige, K. The addition of sodium bisulfite to uracil and to cytosine. Journal of the American Chemical Society. 92 (3), 724-726 (1970).
    15. Wang, R. Y., Gehrke, C. W., Ehrlich, M. Comparison of bisulfite modification of 5-methyldeoxycytidine and deoxycytidine residues. Nucleic Acids Research. 8 (20), 4777-4790 (1980).
    16. Masser, D. R., Berg, A. S., Focused Freeman, W. M. high accuracy 5-methylcytosine quantitation with base resolution by benchtop next-generation sequencing. Epigenetics & Chromatin. 6 (1), 33(2013).
    17. Caruccio, N. Preparation of next-generation sequencing libraries using Nextera technology: simultaneous DNA fragmentation and adaptor tagging by in vitro transposition. Methods in Molecular Biology. 733, 241-255 (2011).
    18. Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13, 341(2012).
    19. Adey, A., Shendure, J. U. ltra-low-input tagmentation-based whole-genome bisulfite sequencing. Genome Research. 22 (6), 1139-1143 (2012).
    20. Smallwood, S. A., et al. Single-cell genome-wide bisulfite sequencing for assessing epigenetic heterogeneity. Nature Methods. 11 (8), 817-820 (2014).
    21. Wang, J., et al. Universal endogenous gene controls for bisulphite conversion in analysis of plant DNA methylation. Plant Methods. 7, 39(2011).
    22. Lister, R., et al. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).
    23. Ivanov, M., et al. In-solution hybrid capture of bisulfite-converted DNA for targeted bisulfite sequencing of 174 ADME genes. Nucleic Acids Research. 41 (6), e72(2013).
    24. Booth, M. J., et al. Oxidative bisulfite sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine. Nature Protocols. 8 (10), 1841-1851 (2013).

    Перепечатки и разрешения

    Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

    Запросить разрешение

    Теги

    CpGNGS

    Похожие статьи