Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Исследование тучных клеток секреторных гранул; от биосинтеза к экзоцитозу

12K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52505

⸱

26 января 2015 г.

 ,  ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2Division of Allergy and Immunology, Department of Pediatrics, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, University of Cincinnati College of Medicine, 3Laboratory of Membrane Trafficking Mechanisms, Department of Developmental Biology and Neurosciences, Graduate School of Life Sciences, Tohoku University

В этой статье

Краткое содержание

Целью настоящего протокола заключается в разработке способа, который позволит функциональные геномные анализы секреции тучных клеток. Протокол основан на количественной оценке высвобождения флуоресцентного гена-репортера cotrasfected с интересующего гена и реального времени анализа морфологии секреторной гранулы в.

Аннотация

Тучных клеток (MC) являются секреторные клетки иммунной системы, которые выполняют свои физиологические и патологические функции, выпуская предварительно сформированных и вновь синтезированных аллергических, воспалительных и иммунорегуляторных медиаторов. Посредники MCS "влияют несколько тканей и органов кульминацией аллергических и иммунных реакций. Синтез, хранение и выпуск медиаторов MC высоко регулируется. Предварительно формируется посредники упаковываются в цитоплазматические секреторных гранул (SG), что сливаются с плазматической мембраной и высвобождают их содержимое, регулируемой экзоцитоза. Мы представляем протокол, основанный на совместной экспрессии интересующего гена с геном-репортером, которая предназначена для ИК и выпущен в регулируемом образом наряду с эндогенными посредниками SG. Протокол позволяет с высоким разрешением четырехмерный конфокальной анализы MC ПГ и контроля за их сроки от биогенеза, чтобы срабатывает экзоцитоза. Таким образом, используя этот протокол для скрининга генов ИнтерТекущая за их фенотипического и функционального воздействия позволяет расшифровать молекулярные механизмы, которые регулируют биогенез и экзоцитоз МК ПГ и выявление регуляторов, участвующих. Таким образом, должна быть обеспечена более полное представление о клеточных механизмах, которые составляют функции MCS в норме и патологии.

Введение

Тучные клетки (ТК) являются иммунные клетки, которые лучше всего известны за их участие в аллергических и воспалительных реакций, таких как артрит, астма, эозинофильный эзофагит, хронический дерматит и анафилактический шок 1,2, а также других патологий, включая болезнь коронарных артерий 3,5 и Рак 3,4. Кроме того, МС играют важную роль в врожденного и адаптивного иммунитета, как в иммунной защиты против бактерий и паразитов и подавления иммунного ответа, например, индуцирующего аллотрансплантата толерантности 5,6.

МС происходят из костного мозга, развивается от CD34 + / CD117 + плюрипотентные клетки-предшественники 7. Совершенные костного мозга MC предшественники попадают в кровь и мигрируют в периферические ткани локализовать преимущественно в соединительной ткани и эпителиальные поверхности 8. Созревание и терминальная дифференцировка, в конечном итоге достигается под влиянием OF цитокины в пределах окружающей среде 8,9.

МС может быть активирован аллергена (антигена, Ag), чья встреча привела к образованию иммуноглобулина Е (IgE) тип антител. Связывание такой IgE к FcεRI рецепторов МК, за ними следуют сшивания клеток, связанного IgE при повторном воздействии того же Ag, приводит к FcεRI агрегации и начала сигнального каскада, который завершается в дегрануляции ячейки [рассмотрены в 10,11] , МС также активируются, независимо от IgE, по нейропептидов 5,12, токсины 13, бактериальных и вирусных антигенов 14,15, количество положительно заряженных пептидов совместно именуемые основных секреции, иммунных клеток и цитокинов 5,13,12,16 17. МС также активируется многие из их собственных выпущенных медиаторов, которые дополнительно усиливают воспалительную реакцию.

МС упакованы с секреторных гранул (SGS), которые содержат иммунорегулирующих посредники, в том числе вазоактивных аминов, таких как гистамин и серотонин (у грызунов), протеогликанов, протеаз, таких как химазы и триптазы, фактора роста эндотелия сосудов и нескольких цитокинов и хемокинов 8,9. Эти посредники "готов пойти" и один раз МС активируются соответствующего стимула, эти посредники освобождаются из клеток регулируется экзоцитоза (дегрануляции) в течение нескольких секунд до минут 18,19. Это исходное событие следует путем синтеза De Novo и выделением большого массива биологически сильнодействующих веществ, в том числе метаболитов арахидоновой кислоты, несколько цитокинов и хемокинов 20,21,22. Выпуск новых синтезированных продуктов происходит независимо от выпуска SG. В совокупности эти посредники инициировать ранние и поздние фазы воспалительных и аллергических реакций. Таким образом, понимание механизмов, учитывающие MC активации и дегрануляции оба из теоретической и клинической импortance.

Трудность генетически манипулировать первичных и культурные МС препятствует попыткам выяснения механизмов, лежащих в основе MC дегрануляцию, которые были плохо решены. Чтобы преодолеть эту проблему, мы разработали на основе анализа репортерного СО-трансфекции линии тучных клеток слизистой оболочки, крысы базофильной лейкемии (RBL) -2H3 (отнесено здесь к RBL) или костного мозга, полученные МС (ВММС) 30 с интересующего гена и нейропептида Y (NPY), слитый с мономерной RFP (MRFP), как SG репортера.

NPY Ранее было показано, воспроизводят поведение эндогенных маркеров SG в других системах. Кроме того, из-за флюоресценции MRFP является нечувствительным рН, выражение NPY-MRFP позволяет визуализировать кислотных ИК, а также количественную оценку с помощью экзоцитоза 96-луночные планшеты и устройства чтения флуоресценции пластины. Мы показали, что NPY-MRFP доставляется в кислых ИК в RBL-клеток и ВММС и высвобождается из клетокна регулируемом моды наряду с эндогенным SG груза (например, β-гексозаминидазы и серотонина) 30, 32. Этот протокол обеспечивает изображения на основе методологии высокого разрешения, что позволяет скрининга генов, представляющих интерес для их фенотипических и функциональных влияния на характеристики SG и дегрануляции в RBL клеток 32. В частности, этот протокол позволяет в режиме реального времени отслеживать MC ПГ и количественную оценку их области или размера тома, их номера, кинетики сборки, их движения по мобильному цитоскелета и их конечной слияния с плазматической мембраной при различных условиях. Например, сенсибилизации клеток с DNP-специфического IgE и запуск клетки с поливалентной Ag (DNP конъюгированный сывороточный альбумин) при различных возмущений (то есть, нокдаун генов, представляющих интерес, более экспрессии мас или мутантных генов, или фармакологических манипуляций) и по сравнению с контрольными клетками.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка RBL среды для культивирования клеток

  1. Смешайте 500 мл среды с низким глюкозы Игла в модификации Игла (DMEM) с 56 мл фетальной бычьей сыворотки (это составляет 10% FBS), а затем добавить 5,5 мл пенициллина стрептомицин (это делает ~ 1% PEST).
  2. Фильтр носитель при помощи 500-1000 мл флакон-Топ вакуум-фильтры с размером пор 0,22 мкм размер пор и хранить при температуре 4 ° С.

2. Культура RBL клеток

  1. Выращивают клетки RBL в увлажненной атмосфере 5% CO 2 при 37 ° С либо в пластинах или колбы. RBL клетки, которые растут в 10 см пластинах должны быть дополнены 10 мл среды и образуют сливающийся монослой ~ 10 7 клеток / пластину.
  2. Когда слой клеток приближается слияния, replate культуру при более низкой плотности.
    1. Удалить культуральной среды от пластины / колбу с помощью стерильной пастеровской пипетки, подключенный к вакууме.
    2. Промойте клеточный монослой с подогретую (37° С) 0,25% трипсина / EDTA, который охватывает весь монослой (объем зависит от размера пластины культуры / колбу, 2 мл на 10 см пластины). Это открепления клеток.
    3. В качестве альтернативы, промыть монослой клеток фосфатно-солевым буфером (PBS), удалить PBS и добавить предварительно нагретой (37 ° С) трипсин / ЭДТА. Этот шаг отделяет клетки быстрее.
    4. Поместите пластину / колбу в термостат при 37 ° С (не более 10 мин).
    5. Проверьте клеток под оптическим микроскопом, чтобы проверить, если они были отключены. Если клетки не отсоединить через 10 мин, осторожно нажмите на пластине / колбу.
    6. Добавить носитель в культуральный планшет / колбу приостановить клеток (объем среды должна быть по крайней мере в 2 раза больше, чем объем раствора трипсина).
    7. Гранул клетки центрифугированием в течение 3 мин при 200 г при 25 ° С.
    8. Ресуспендируют клеток в среде. Развести клетки, 1:10 и семян в новой культуре блюдо. Инкубируйте клетки в течение 48-72 ч, пока они не пастьч приблизительно 90% слияния.
    9. Повторите ту же процедуру (раздел 2.2.1-2.2.8) до 3 месяцев (30 проходов).

3. Подготовка трансфекции Media.

  1. Подготовьте 100 мМ раствора K-Трубы рН 7, 1 мМ раствора Ca 2+ ацетата и 100 мМ раствора Mg 2+ ацетата.
  2. Развести 100 мМ раствора K труб рН 7 в 20 мм с использованием DMEM носитель, добавьте 1 мМ раствора ацетата Ca 2+ до конечной концентрации 10 мкМ и 100 мМ раствора Mg 2+ ацетата до конечной концентрации 2 мм.
  3. Взвешивание калия глутамата и добавить к раствору до конечной концентрации 128 мМ, хорошо перемешать и не хранить при температуре 4 ° С до использования. Держите оставшиеся решения (т.е.., К-трубы, Ca 2+ ацетат, Mg 2+ ацетат) при температуре -20 ° C.

4. Трансфекция RBL клеток

  1. Удалить культуральной среды из пластины / колбу с использованиемстерильной пастеровской пипетки подключен к вакууме.
  2. Промыть клеточный монослой с предварительно нагретой (37 ° С) трипсин / ЭДТА, которые должны охватывать весь монослой. Поместите пластину / колбу в термостат при 37 ° С (не более 10 мин). Проверьте, если клетки были отключены с помощью оптического микроскопа.
  3. Добавить среды в культуре пластины / колбу приостановить клетки (объем средств массовой информации должна быть не менее 2-более крупной, чем объем раствора трипсина).
  4. Подсчитайте количество клеток с использованием гемоцитометра.
  5. Гранул 1,5 × 10 7 клеток центрифугированием в течение 3 мин при 200 х г при 25 ° С. Откажитесь от супернатантов и добавить 280 мкл трансфекции среды. Передача реакционной смеси в 4 мм кювете.
  6. Добавить 20 мкг NPY-MRFP плазмиды и либо 30 мкг управления пустой плазмидой или с плазмидой тестируемого. Конечный объем реакционной смеси должен быть 300 мкл.
  7. Сразу же место на льду в течение 10 мин. Протрите кювету из остаточной воды и рroceed электропорации при 300 V в течение 9 мс.
  8. Для измерения экзоцитоза, replate клетки сразу в 24-луночные культуры ткани, содержащие 300 мкл среды. Добавить 8 мкл реакционной смеси (4 × 10 5 клеток) в каждую лунку. Добавить 4 × 10 5, не являющимся трансфекции клеток в дополнительных скважин для контроля. Подготовка достаточно скважин для иметь по крайней мере дублировать скважин для каждой обработки для каждого трансфекции.
  9. Для промежуток времени микроскопии, replate клетки сразу в камеру боросиликатного системы покровного стекла 8-а, содержащего 80 мкл среды. Добавить 1,5 мкл реакционной смеси (7,5 × 10 4 клеток) в каждой камере. (Попытка избежать с помощью камеры на краю покровного стекла, камеры в центре покровного стекла легче изображения).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно отметить, что не все клетки ответ на триггер, а иногда и покадровой микроскопии отменены из-за потери внимания и дрейфа 8-а камеры borosiсиликатное покровного стекла система. Таким образом, подготовка по меньшей мере, 8 камер для каждой обработки для каждой трансфекции.
  10. Для сенсибилизации клеток к FcεRI опосредованной активации, добавить 1 мкг / мл мыши DNP IgE специфических моноклональных в средствах массовой информации (Инкубируйте клетки с IgE, по крайней мере, 2 ч).
  11. После 18-24 часов использования флуоресцентного микроскопа, чтобы подтвердить, что клетки экспрессируют плазмиды. Возбуждения и излучения длины волны флуоресценции MRFP являются: ех 584, λEm 607 нм. NPY-MRFP должен появиться в везикулярного структур, которые соответствуют ПГ. Если второй интерес ген слит с флуоресцентной меткой использовать флуоресцентного микроскопа, чтобы подтвердить совместной экспрессии обоих плазмид при тех же клетках. Например, если тестируемый ген, слитый с GFP, возбуждения и излучения длин волн флуоресценции GFP являются: ех 488, λEm 507 нм. GFP помечены белок должен появиться в одних и тех же клеток, которые экспрессируют NPY-MRFP.
  12. Для измерения экзоцитоза приступить тО шагом 5 и промежуток времени микроскопии, перейдите к шагу 6.

5. Измерение NPY-MRFP Экзоцитоз

  1. Подготовка Тироде буфера:
    1. Приготовьте раствор 54 мМ KCl, 20 мМ MgCl 2, 2,74 М NaCl и 8 мм NaH 2 PO 4 в DDW. Хорошо перемешать и хранить при 4 ° С. Этот шаг для подготовки 20x Тироде буфера.
    2. Приготовьте раствор 20 мМ Hepes рН 7, 1,8 мМ CaCl 2, 1 мг / мл BSA, 5,6 мМ глюкозы и 1 к 20 разбавление Тироде 20x в DDW и хорошо перемешать. Этот шаг для подготовки 1x Тироде буфера.
    3. Алиготе буфера 1x Тироде и хранить при температуре -20 ° C. Избегайте повторного замораживания и оттаивания.
  2. Удалить культуральной среды из 24-луночного планшета и промыть 3 раза буфером Tyrode. Подготовка нестимулированных клеток путем добавления 200 мкл буфера Тироде с контрольными лунками.
  3. Подготовка 10 мкл / лунку 20X концентрировали активирующего реагента (например, [1000 нг / мл DNP-BSA или DNP-HSA (Ag), 200 мкМ Са 2+ ионофор (например, А23187), и комбинация 20 мкМ Ca 2+ ионофора и 1000 нМ 12-O- тетрадеканоилфорбол-13-ацетата (TPA)]. Если реагенты хранятся в ДМСО, разбавляют реагенты в 20x концентрации в Тироде буфера, содержащего 1% ДМСО. Инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин.
  4. Удалить супернатантах каждую лунку тщательно, чтобы 96-луночного планшета, поместить на лед и избежать от света. (Надосадочные содержать химерный пептид NPY-MRFP, который был выпущен из клетки).
  5. Добавить 200 мкл буфера, содержащего Тироде 0,5% Triton X-100 в каждую лунку и инкубируют при 37 ° С в течение 10 мин. (Этот шаг является важным для подготовки клеточных лизатов, которые содержат оставшегося NPY-MRFP, что не был выпущен из клетки). Сбор клеточных лизатов и передать 96-луночного планшета, поместить на лед и избежать от света.
  6. Измерить флуоресценцию клеточных супернатантах и ​​клеточных лизатов с использованием fluorescENCE ридер, используя 590-, 20 нм полосы пропускания возбуждения фильтр и 635-, 35 нм фильтр излучения полосы пропускания.
  7. Рассчитать процент NPY-MRFP выхода:
    ПРИМЕЧАНИЕ: Флюориметры мера произвольные единицы флуоресценции (AFU). Значения AFU зависит от машины и ее чувствительности и эффективности трансфекции.
    1. Установите аутофлюоресценции nontransfected RBL клеток как пустые. Разделите ВСУ каждого супернатанта к общей флуоресценции (AFU супернатантов + AFU соответствующего лизата) и умножить на 100.

6. Покадровый Микроскопия Экзоцитоз

  1. Семенной 7,5 × 10 4 трансфецированных клеток / камере в 8-а системы покровного стекла камеры из боросиликатного. После 18-24 часов, удалите культуральную среду из камер и промойте 3 раза Тироде буфера
  2. Добавить 72 мкл буфера Tyrode в каждую камеру. Развести активирующие реагенты в Тироде буфера 10x концентрации.
  3. Используйте конфокальной флуоресцентной микроскопии, оснащенный нагретой камере (37 ° C) и CO 2 контроллера (4,8%) и в 40 раз или 63x цели. Включите систем микроскопов: ртутная лампа, компьютер и лазеры. Убедитесь, что нагревается камера при правильной температуре до начала эксперимента.
  4. Поместите камеру в нагретой камере и убедитесь, что камера правильно и стабильно установлен.
  5. Включите света флуоресценции в соответствии с соответствующим флуорофора и визуализировать трансфекции клеток. Выключение флуоресценции когда клетка представляет интерес в области, чтобы минимизировать обесцвечивания и цитотоксичность. Важно, что в этом поле будет содержать около 2-3 трансфицированных клеток. В трансфицированные клетки должны быть хорошо нанесен, но не соприкасаются друг с другом.
  6. Регулировка мощности лазера (в зависимости от микроскопа), чтобы минимизировать шум и перенасыщение, а также токсичности, и установки усиления и смещения для изменения отношения сигнал-шум. Сканирование быстро илидер чтобы свести к минимуму продолжительность лазерного экспозиции (в среднем 2).
  7. Регулировка микроотверстий размер не более, это позволяет уменьшения мощности лазера и поддерживать изображения, направленные в течение длительного периода времени. При желании, установить параметры для Z стек, чтобы восстановить изображение в трехмерном, регулировать обскуры размер до 1 воздушный единицу (а.е.), что дает лучшее отношение сигнала к шуму и приобрести последовательного сканирования двумерных конфокальной оптической срезов в Z -axes с оптическими ломтиками ≤0.7 мкм.
  8. Задайте временной интервал между каждым приобретения до 15-30 сек и продолжительности общего приобретения до 15 мин и начать получения изображений. После 5 мин приобретения приостановить временной ряд. Добавить 8 мкл 10-кратного триггера и сразу же продолжить приобретение.
  9. Сохранить фотографии, выполните деконволюции с помощью программного обеспечения деконволюции и реконструировать стеки трехмерных изображений и в кино, используя программное обеспечение Imaris.

7. Анализ изображения

  1. Импорт данных из разрешенный изображений временных рядов, которые были получены с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии к программному обеспечению Imaris. Это программное обеспечение считывает более 40 микроскопии файлов. Если программное обеспечение не может читать файлы; конвертировать файлы в TIF файлов и импорта.
  2. Чтобы добавить моменты времени до конца открытого множества данных нажмите Правка -> Добавить моменты времени и импортировать новый набор данных.
  3. Создание поверхности канала MRFP с использованием опции мастера поверхность. Выберите алгоритм по умолчанию. Выберите канал NPY-MRFP. Отметьте данную опцию сглаживания для снижения шума. Чтобы избежать потери мелких деталей снизить уровень до 0,05 мкм области сведений.
  4. Установите порог интенсивности. Новый серая поверхность будет отображаться. Перейдите в раздел "Настройки" и включить стиль от "центральной точке" в "Surface".
  5. Перейдите на вкладку статистики в свойствах выбранного объекта, выберите подробную вкладку и конкретное значение SUCч как интенсивность флуоресценции, объем и т.д.
  6. Просмотрите данные и убедитесь, что значения совместимы с изображениями. Например, два или более соседних гранул может быть измерена как один большего гранулы. Для количественной оценки средний размер гранул разделить размер присоединяемых гранул до фактического количества гранул.
  7. Экспортируйте нужные наборы данных в файлы Excel и анализировать данные.
F

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Из-за низкой эффективности трансфекции ТК, генетические манипуляции вряд ли оставят влияние на показаниями среднего секреции, измеренных эндогенных медиаторов SGS. Тем не менее, путем создания полного со-экспрессии репортерного гена NPY-MRFP и ко-трансфицировали плазмидой в одних и тех же клеток, контроль результатов NPY-MRFP в мониторинге исключительно клеточную популяцию, которая экспрессирует интересующий ген. Таким образом, преимущество данного метода по сравнению с традиционными методами является возможность выборо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы описываем инновационной стратегии, которая сочетает в себе количественную МКС экзоцитоза и четыре (X, Y, Z, т) Размер количественными по времени истек трехмерной визуализации ИК в живых клетках с использованием ген-репортер для экзоцитоза. Этот метод позволяет просмотр семейств белков для их влияния на функции MC, таких как ИК мониторинга, начиная уже их выхода из аппарата Гольджи через их созревания, приобретение экзоцитоза компетенции и дегрануляции. Сочетание измерений экзоцитоза вместе с морфометрических и кинети...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов отсутствует финансовый конфликт интересов.

Благодарности

Мы благодарим доктора У. поташа за дар NPY-MRFP кДНК. Мы благодарим доктора. MJ Kofron, Л. Mittleman, М. Shaharbani, Е. Зильберштейн за неоценимую помощь в микроскопии и анализ изображения. Мы также благодарим д-р Джозеф Орли за критическое прочтение рукописи. Эта работа была поддержана грантом Научного фонда Израиля, основанной Израиля академии наук (1139/12 к RS-Е.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DMEMSigma-AldrichD6046-500MLтеплый в 37 градусов; C водяная баня перед применением
Фетальная бычья сывороткаGE здравоохранение Медико-биологические наукиSH30071,01
Пенициллин-стрептомицинТехнологии
жизни Мембрана из ацетата целлюлозы, размер пор 0,22  μ mSigma-AldrichCLS430769-1EA
Corning обработанные культурой ткани питательные чашкиSigma-AldrichCLS430167
Trypsin/EDTA Solution (TE)Life technologiesR001100Warm in 37 ° C водяной баней перед применением
ТРУБКИ дикалийной солиSigma-Aldrich108321-27-3 
Гидрат ацетата кальцияSigma-Aldrich114460-21-8
Тетрагидрат ацетата магнияSigma-AldrichM5661 
L-глутаминовая кислота моногидрат соли калия (глутамат калия)Sigma-AldrichG1501
4 мм электропорационные кюветыклеточные проектыEP-104
ГЕННЫЙ ПУЛЬСАТОР С КОНТРОЛЛЕРОМ ИМПУЛЬСОВ И CAPACITANCEBio rad
Камерное защитное стеклоThermo Scientific155411
24 лунки, плоское дноSigma-AldrichCLS3524
Corning 96 луночных пластинSigma-AldrichCLS3367 или CLS390
96 лунок пластина флуоресцентного считывателя - Infinite 200Tecan
Ионофор кальция A23187Sigma-AldrichC7522Избегайте воздействия прямого света
12-O-тетрадеканоил-13-ацетат (ТПА)CalbiochemP3766
анти-ДНП моноклональный IgESigma-AldrichD8406 
DNP-BSA/ DNP-HASSigma-AldrichA6661Избегайте прямого воздействия света
Triton-x-100Sigma-AldrichT8787
Конфокальный флуоресцентный микроскоп:
Zeiss LSM 510
LeicaSP5
Nikon A1 инвертированный
Программное обеспечение ImarisBITLANE
Microsoft exel или Prism или другое программное обеспечение
для анализа Другой реагент:
Хлорид магнияMERK5833
Хлорид натрияMERK6404
Хлорид кальция MERK2382
Бычий сывороточный альбумин Sigma-AldrichA4503
ГлюкозаBDH Laboratories284515V
Мононатрийфосфат MERK5345
Стерильная вода

Ссылки

  1. Abonia, J. P., et al. Involvement of mast cells in eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 126 (1), 140-149 (2010).
  2. Galli, S. J., Tsai, M. Mast cells in allergy and infection: versatile effector and regulatory cells in innate and adaptive immunity. Eur J Immunol. 40 (7), 1843-1851 (2010).
  3. Ribatti, D., Crivellato, E. The controversial role of mast cells in tumor growth. International Review of Cell and Molecular Biology. 275, 89-131 (2009).
  4. Ribatti, D., Crivellato, E. Mast cells, angiogenesis and cancer. Adv Exp Med Biol. 716, 270-288 (2011).
  5. Tsai, M., Grimbaldeston, M., Galli, S. J. Mast cells and immunoregulation/immunomodulation. Adv Exp Med Biol. 716, 186-211 (2011).
  6. Vries, V. C., Noelle, R. J. Mast cell mediators in tolerance. Curr Opin Immunol. 22 (5), 643-648 (2010).
  7. Kirshenbaum, A. S., et al. Demonstration that human mast cells arise from a progenitor cell population that is CD34(+), c-kit(+), and expresses aminopeptidase N (CD13). Blood. 94 (7), 2333-2342 (1999).
  8. Metcalfe, D. D., Baram, D., Mekori, Y. A. Mast cells. Physiol Rev. 77 (4), 1033-1079 (1997).
  9. Gilfillan, A. M., Austin, S. J., Metcalfe, D. D. Mast cell biology: introduction and overview. Adv Exp Med Biol. 716, 2-12 (2011).
  10. Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. J Allergy Clin Immunol. 117 (6), 1214-1225 (2006).
  11. Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 117 (6), 1214(2006).
  12. Lagunoff, D., Martin, T. W., Read, G. Agents that release histamine from mast cells. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 23, 331-351 (1983).
  13. Depinay, N., Hacini, F., Beghdadi, W., Peronet, R., Mecheri, S. Mast cell-dependent down-regulation of antigen-specific immune responses by mosquito bites. J Immunol. 176 (7), 4141-4146 (2006).
  14. Abel, J., et al. Staphylococcus aureus evades the extracellular antimicrobial activity of mast cells by promoting its own uptake. J Innate Immun. 3 (5), 495-507 (2011).
  15. Avila, M., Gonzalez-Espinosa, C. Signaling through Toll-like receptor 4 and mast cell-dependent innate immunity responses. IUBMB Life. 63 (10), 873-880 (2011).
  16. Novak, N., Bieber, T., Peng, W. M. The immunoglobulin E-Toll-like receptor network. Int Arch Allergy Immunol. 151 (1), 1-7 (2010).
  17. Rudich, N., Ravid, K., Sagi-Eisenberg, R. Mast cell adenosine receptors function: a focus on the a3 adenosine receptor and inflammation. Front Immunol. 3, 134(2012).
  18. Theoharides, T. C., Kempuraj, D., Tagen, M., Conti, P., Kalogeromitros, D. Differential release of mast cell mediators and the pathogenesis of inflammation. Immunol Rev. 217, 65-78 (2007).
  19. Caughey, G. H. Mast cell proteases as protective and inflammatory mediators. Adv Exp Med Biol. 716, 212-234 (2011).
  20. Lundequist, A., Pejler, G. Biological implications of preformed mast cell mediators. Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).
  21. Metz, M., Maurer, M. Mast cells--key effector cells in immune responses. Trends Immunol. 28 (5), 234-241 (2007).
  22. Gordon, J. R., Burd, P. R., Galli, S. J. Mast cells as a source of multifunctional cytokines. Immunol Today. 11 (12), 458-464 (1990).
  23. Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases. J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).
  24. Stenmark, H., et al. Inhibition of rab5 GTPase activity stimulates membrane fusion in endocytosis. EMBO J. 13 (6), 1287-1296 (1994).
  25. Azouz, N. P., et al. Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis. J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Биогенез секреторных гранулрегулируемый экзоцитозконфокальная микроскопияфлуоресцентный репортерный генкоэкспрессия геновморфометрический анализизмерение интенсивности флуоресценциистимуляция ионофором кальциямутант Rab5
Исследование тучных клеток секреторных гранул; от биосинтеза к экзоцитозу
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.