Методическая статья

В Ситу Ca 2+ изображений нервной системы кишечной

21.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52506

⸱

29 января 2015 г.

 , 
1Department of Physiology, Michigan State University

В этой статье

Краткое содержание

Энтеральная нервная система (ЭНС) — это сеть нейронов и глии, расположенных в стенке кишечника, которая контролирует кишечные рефлексы. В этом протоколе описаны методы регистрации активности энтеральных нейронов и глии в живых препаратах ЭНС с использованием визуализации Ca2+.

Аннотация

Рефлекторное поведение кишечника контролируется энтеральной нервной системой (ЭНС). ЭНС представляет собой интегративную сеть нейронов и глии в двух ганглионированных сплетениях, расположенных в стенке кишечника. Энтеральные нейроны и энтеральная глия являются единственными типами клеток в кишечных ганглиях. Активность энтеральных нейронов и глии отвечает за координацию функций кишечника. Этот протокол описывает методы наблюдения за активностью нейронов и глии в интактной ЭНС путем визуализации внутриклеточных переходных процессов кальция (Ca2+) с помощью флуоресцентных индикаторных красителей. Наша техническая дискуссия сосредоточена на методах визуализации Ca2+ в препаратах миентерального сплетения из кишечника грызунов. Массовая загрузка цельных креплений ENS с высокоаффинным индикаторомCa2+, таким как Fluo-4, позволяет измерять ответы Ca2+ в отдельных нейронах или глиальных клетках. Эти реакции могут быть вызваны многократно и надежно, что позволяет проводить количественные исследования с использованием фармакологических инструментов. Ответы Ca2+ в клетках ЭНС регистрируются с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного камерой охлаждаемого устройства с зарядовой связью (ПЗС). Флуоресцентные измерения, полученные с помощью визуализации Ca2+ в цельных препаратах, предлагают простой способ охарактеризовать механизмы и потенциальные функциональные последствия ответов Ca2+ в кишечных нейронах и глиальных клетках.

Введение

Кишечной нервной системы (ЭНС) состоит из двух ganglionated сплетений встроенных в стенке желудочно-кишечного тракта 1. Эти внутримышечные нейронные цепи, мышечной оболочки кишечника сплетение (MP) и подслизистого сплетения (SMP), состоят из нейронов и кишечной глии (рисунок 1) 2. MP и SMP регулировать желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) функции, такие как моторики кишечника и эпителия поглощения и секреции, соответственно 3. Кишечная глия находятся в непосредственной близости от нейронов внутри ганглиев, но популяций кишечной глии существуют также и в смежных волокон брошюры и экстра-ганглиозные части стенки кишечника 3,4. Кишечные глиальные клетки были первоначально считали только для обеспечения питательной поддержки нейронов. Однако, недавние исследования убедительно свидетельствуют, что нейрон-глия взаимодействия имеют важное значение для ENS действует 5,6. Например, данные показывают, что кишечно-глии "слушать" нейронной активности 7и модулировать нейронные схемы 6,8, защиты энтеросолюбильной нейроны от окислительного стресса и 9 способны генерировать новые энтеросолюбильной нейронов в ответ на повреждение 10,11. Протокол, представленные в данном техническом обзоре обеспечивает простой и надежный метод для изучения сложных взаимосвязей между нейронами и кишечной глии, используя на месте внутриклеточного Ca 2+ изображений.

Ca 2+ повсеместно сигнальная молекула в возбудимых клеток и играет важную роль в синаптических сигнальных событий в нервной системе 12. Возбуждение нейронов или кишечной глии вызывает возвышение в цитоплазматической Ca 2+ концентрации либо притоком через Са 2+ -permeable каналов или Са 2+ релиз из внутриклеточных депо кальция. Изображениями Ca 2+ в нейронах и глии с люминесцентными красителями и широко используемый метод для изучения функциональной организации и динамикиENS 13-17. Изображениями Ca 2+ было показано, чтобы быть важным инструментом в изучении сегменты неповрежденной GI тканей для выяснения распространения возбудимости через ICC кардиостимулятора сетей 18 и кишечника гладкой мускулатуры 19,20. Это позволяет исследователям исследовать широкий спектр физиологических параметров и предоставляет информацию о как их пространственного распределения и временной динамики. Клетки могут быть эффективно окрашивали в минимально инвазивной образом с помощью мембранных проницаемым люминесцентные индикаторы и оптимизированные протоколы окрашивания 21. Это дает возможность контролировать большое количество нейронов и глии в кишечно функционально сохраненных препаратов 14-16,22, а также в естественных условиях 23. Целые-крепление ткани препараты основная загружается с высоким сродством Ca 2+ индикатора красителя, таких как Fluo-4, что повышает его флуоресценции при связывании с Са 2+. Изменение флуоресценции регистрируются ПЗС-камеры и Анализируется в цифровом 6. Появление Ca 2+ предоставляется возможность отслеживать нейронов и глии межклеточных взаимодействий, отзывчивость на различные раздражители, и участие этих типов клеток в желудочно-кишечной процессов в режиме реального времени.

В месте с изображениями Ca 2+ дала большое понимание в сигнальных механизмов кишечных нейронов и глии и обладает рядом явных преимуществ по сравнению с моделями клеточных культур 6,24. Во-первых, на месте препараты сохранить родной матрицы среду нейронов и глии и оставить большую часть своих связей с целевой ткани нетронутыми. Во-вторых, генетика и морфология культивируемых кишечной глии существенно изменяются по сравнению с в естественных условиях 6,24. В-третьих, многие гетеротипические взаимодействия теряются в первичной культуры клеток, и это ограничивает оценивающие межклеточных взаимодействий. Хотя культивируемые клетки хорошо подходят для исследования фундаментальных свойств, их usefulneСС для изучения сложных взаимодействий между кишечными глии и нейронов ограничена. Исследование нейрон-глия взаимодействие с использованием на месте подход является более физиологически актуальна как синаптические пути остаются нетронутыми 25. По сравнению с клеточной культуры подходов, на месте подхода предлагает улучшенные условия для систематического понимания сложных взаимодействий между нейронами и кишечной глии. Кроме того, плоская организация ganglionated сплетения в целом монтажа подготовки идеально подходит для флуоресцентных изображений внутриклеточных Са 2+ и этот метод обеспечивает простой подход для оценки Нейрон-глии деятельность в ENS.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие процедуры, связанные с ткани от лабораторных животных в соответствии с AVMA Руководства по эвтаназии животных в 2013 и были заранее одобрены Мичиганского государственного университета IACUC.

1. Подготовка ткани

  1. Обезболить исследований на животных в камере, содержащей 2,5% изофлуран в кислороде или путем размещения 3-5 мл жидкости на изофлуран абсорбирующего материала на полу камеры, что обеспечивает физический барьер предотвращает животных от непосредственного контакта с изофлуран. Тест на глубине анестезии, зажимая в подушечку лапы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: глубина анестезии будет сочтено целесообразным, когда нет вывода рефлекс задней конечности. После того, как соответствующим образом под наркозом, усыпить мышь смещением шейных позвонков
  2. Место животное в лежачем положении и очистите кожу с брюшка с 70% этанола. Используйте пинцет, чтобы зажать кожи живота на срединной линии и использовать хирургические ножницы, чтобы сделать 6 см СМИл разрез вдоль белой линии, чтобы разоблачить внутренние органы пищеварения.
  3. Используйте тупые щипцы, чтобы найти и разоблачить подвздошной кишки внутри брюшины. Отрежьте подвздошной / толстой кишки брыжейки с ножницами и начать распутывать кишечника.
  4. После того, как длина кишечника адекватно разгадали, сократить кишечника дистальнее желудка и проксимальный к слепой кишке для приготовления подвздошной кишки. Для большого подготовки кишечника, вырезать толстой кишки дистальнее слепой кишки и вблизи прямой кишки.
  5. Быстрое удаление кишечного сегмента и поместить его в стакан с DMEM / F12 среде с добавлением 3 мкМ никардипин гидрохлорид и 1 мкМ гидрохлорида скополамин (далее именуемый "информации") на льду. Добавление этих ингибиторов облегчает микродиссекции и последующее изображений, парализуя кишечника гладкие мышцы.
  6. Cut сегмент интереса (например, тощей кишки, подвздошной кишки, дистальной или проксимальной толстой кишки) на основе установленных анатомических маркеров. Обычно utilizе ткани от дистального отдела подвздошной кишки или дистальном отделе толстой кишки. Тем не менее, использовать ту же основную процедуру, чтобы изолировать, нагрузки и изображений нейронов мышечной оболочки кишечника и глии во всех кишечных регионах.
  7. Удалить небольшой сегмент (4-6 см) нужного отрезка кишечника и место в Sylgard покрытием чашке Петри, наполненной охлажденной СМИ.
  8. Безопасный проксимальный и дистальный концы кишечного сегмента с штифтами насекомых и открыть кишечной трубки путем прямой, продольно разрезанной вдоль брыжеечной границе.
  9. Pin ткани квартиру под легкое напряжение с слизистой стороной вверх и осторожно отсечь слизистой оболочки слой, используя тонкий пинцет (# 5 и # 5/45 работать лучше) и очень прекрасный весенний ножницы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: удаление слизистой оболочки может быть весьма травматично для ENS, если не сделано должным образом. Для качества препаратов, заботиться, чтобы ограничить резкое удаление слизистой оболочки путем лущения или выскабливание. Лучше всего, чтобы поднять слизистой оболочки и нарезать под тонкими ножницами.
  10. Разрежьте ткань на небольшие подготовкис (примерно 0,5 см 2) и штифт в визуализации блюд (4 углам с круговой мышечный слой вверх) помещают на лед со свежей информации.
  11. Тщательно отсечь круговой мышцей дразнить друг от друга тонкими щипчиками, чтобы разоблачить мышечной оболочки кишечника сплетение. Избегайте чрезмерного растяжения.
  12. Поместите изображений блюдо обратно на лед и изменение решения с свежей прессы.
  13. Подготовка 2 мл ферментной смеси на чашку [диспаза 1 ед / мл (4,48 мг / 8 мл), коллагеназы типа II 150 ед / мл (5,45 мг / 8 мл) в средствах массовой информации].
  14. Удалить блюда из льда и добавьте смеси ферментов, начиная с шага 1.13.
  15. Инкубируйте блюда при КТ в течение 15 мин с 5% СО 2/95% воздуха.
  16. Тканевые препараты для мойки с медиа в 3 раза и вновь контактных углов.

2. Погрузка Fluo-4 краски

ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте фотообесцвечиванию, работая с ограниченной света при работе с флуоресцентными красителями и ткани, загруженные с индикаторными красителями.

  1. Подготовка 4 мкм Fluo-4 загрузки решение.
    1. Добавить 1,5 мл среды и 1,2 мкл 250 мМ пробенецида складе в 1,5 мкл аликвоты 4 мм Fluo-4 в наличии. 4 мМ Fluo-4-фри готовят путем добавления 11,4 мкл Pluronic F-127 (20% в ДМСО; с добавкой 0,25% cremaphor-EL) до 50 мкг Fluo-4, Am.
  2. Инкубируйте Preps в Fluo-4 загрузки раствора в течение 45 мин в темном инкубаторе при 37 ° С.
  3. Удалить из инкубатора и промыть препараты со средствами массовой информации в 3 раза.
  4. Обмен медиа-среды, содержащей по 200 мкм пробенецид и инкубировать 15 мин при 37 ° С до визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пробенецид является препарат, который подавляет множественной лекарственной устойчивостью перевозчиков в нейронах. Добавление этого препарата подавляет способность нейронов выталкивать красители и повышает нейронов маркировки. Массовое-загрузка Са 2+ индикаторных красителей в отсутствие пробенецид производит в основном глиальных клеток нагрузку. Добавление пробенецид позволяет визуализации нейронов и глии ответов.
  5. Подготовка Модифицированный KreBS буфера.
    1. Сделайте измененный буфер Кребса, так что конечные концентрации (в мм) компонентов, как следует: 121 NaCl, 5,9 KCl, 2,5 CaCl 2, 1,2 MgCl 2, 1,2 NaH 2 PO 4, 10 HEPES, 21,2 NaHCO 3, 1 пировиноградная кислоты и 8 глюкозы (рН доводили до 7,4 с помощью NaOH). Добавить 3 мкм никардипин и 1 мкМ скополамин ингибировать сокращения мышц во время Са 2+ изображений и вся монтажа вскрытия.

3. Работа с изображениями и анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте по крайней мере основной буровой изображений с флуоресцентным источником света, микроскоп, качество CCD камеры и соответствующего программного обеспечения приобретения. Вары добавление других компонентов в зависимости от источника света и конкретного применения. Колесо фильтра и затвора должен быть использован с традиционной ксеноновой дуговой источник света. Однако, светодиодные источники света и осветительные системы не требуют эти компоненты.

  1. Установите RECОрдинг камеру под микроскопом и с помощью проточной системе перфузии тяжести с несколькими подогревом шприцев водоемов установление постоянного скорость перфузии 2-3 мл / мин 37 ° C Кребса буфера. Убедитесь в том, чтобы предотвратить образование воздушного пузырька в обеих входной и всасывающей линии, подключенной к вакуумной ловушки.
  2. Приносят желаемых сплетения в центре внимания при ярком освещении поля. Избегайте передержки ткани, что может привести к фото отбеливания.
  3. Проверьте Fluo-4 загрузки в течение ганглиев и выберите здорового ганглиях изображений. Нездоровые / поврежденные ганглии будет проявлять автофлуоресцентной или точечный морфологию и не должны использоваться для визуализации.
  4. После выбора ганглий, отвлечь путь света к камере и получить живое изображение с помощью программного обеспечения захвата изображений. Убедитесь, что ганглий находится в фокусе и установить частоту захвата изображений и времени воздействия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Высокие захвата изображений и время будет изменяться в зависимости от событий следователи хотят записать. Для большинства экспериментов, изображенийтрадиционно приобрел в 0,5-1 Гц для глиальных клеток и до 2-10 Гц в течение нейронов, потому что ответы глиальных Ca 2+ не так быстро, как Са 2+ в нейроны.
  5. Начните эксперимент и установить базовую деятельность в течение 30 сек.
  6. Применение предварительно нагревают интересующих лекарственных средств, таких как агонисты и антагонисты рецепторов с использованием системы перфузионного самотеком со скоростью 2-3 мл / мин. Последующие применение агонистов / антагонистов путем возврата к нормальной перфузии буфер и позволяют период стирки / извлечения по меньшей мере, 10 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время применения препарата будет варьироваться в зависимости от конкретного соединения и опытно-конструкторских. В общем, 20-30 сек применение агониста является достаточным для активации G-белками рецепторов в нейронах и глиальных клеток. Тем не менее, лиганд-ионные каналы (например, никотиновые рецепторы ацетилхолина), требуют время нанесения не более чем на 5-10 сек. Дальнейшие продолжительность воздействия вызовет лиганд ионные каналы быстро дешеnsitize. Антагонисты следует применять в течение примерно 3-15 мин, чтобы обеспечить полную блокаду рецепторов путей. Тем не менее, это полная обобщение и следователи должны всегда оптимизировать любую экспериментальный препарат в своей конкретной парадигмы.
  7. Остановка записи и просмотра покадровой фильм эксперимента. Тщательно выберите регионах, представляющих интерес (ROI в) с использованием соответствующего программного обеспечения для анализа изображений.
  8. Используйте программное обеспечение, чтобы нормализовать и сравнить ROI интенсивности флуоресценции от его первоначальной стоимости базового флуоресцентного. Изменения в нормированной флуоресценции прямо пропорциональны изменениям [Са 2+].
    1. Использование модификацию метода, описанного ранее, используя 26; F / F = ((F 1 - F 0) / F 0) ROI - ((F 1 - F 0) / F 0) фона, где F1 является флуоресценции в любой данный точку и F0 является базовой флуоресценции, повысить точность оценки. Эта модификация средствав снижении шума от изменений флуоресценции в тканевых препаратов, которые обладают движение мышечного слоя, лежащего в основе мышечной оболочки кишечника сплетение.

Результаты

Правильное использование этого метода позволяет исследователям точно измерить внутриклеточного Ca 2+ [Ca 2+] я переходных процессов в кишечных нейронов и глии в целом монтажа тканевых препаратов. Типичный пример агонистов, вызвали Ca 2+ ответов в глии в пределах мышечной оболочки кишечника ганглия толстой кишки мыши показано на видео 1. Получены следующие результаты предназначены для иллюстрации некоторых репрезентативных результатов мы, полученные с помощью этого метода. Во-первых, на рисунке 2 представлены результаты эксперимента измерения кишечно-глиальных [Ca 2+] я изменения в ответ на стимуляцию АТФ в морской свинки толстой продольной мышечной оболочки кишечника мышцы сплетение (LMMP) препаратов. В частности, эта цифра показывает метод для правильного анализа экспериментального протокола, указанного выше, включая контур анализируемого мышечной оболочки кишечника ганглии и звездочек, обозначающих расположение кишечных нейронов. Эти результаты также яllustrate оптимальную дозу сто микромолярном АТФ на мобилизацию [Ca 2+] я в морской свинки мышечной оболочки кишечника глии. Эта реакция может быть использована для калибровки кишечно-глиальных стимуляции и нормализации ответы на тестовые стимулы. Далее, Рисунок 3 поясняет, как правильно выбрать интересующие участки (трансформирования) Ближайшие глиальные клетки, как показано с прилегающими желтые круги. Эти результаты также показывают желаемые изменения флуоресценции под базальных условиях и в ответ на фармакологических стимулов. Наконец, на рисунке 4 показывает, пространственные соображения по выбору кишечно-глии и нейронов для [Ca 2+] Я ответах в целом монтажа подготовки.

figure-results-1
Рисунок 1. Организация ENS. ENS содержит два основных ganglionated сплетения. Мышечной оболочки кишечника сплетения расположен между лongitudinal и круговые слои мышц. Подслизистого сплетения расположен между слизистой и круговой слой мышц. ENS исключительно состоит из нейронов и кишечной глии. Нервные волокна путей подключения ганглиев. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2. Кишечная глия в морской свинки толстой мышечной оболочки кишечника сплетения реагировать на СПС на месте. () Fluo-4 флуоресценции в мышечной оболочки кишечника ганглии (они изложены пунктирной линией) при базальных условиях. Стрелки указывают на толстых путей interganglionic волокон. (В) при стимуляции 100 мкмоль / л АТФ, глиальных клеток, но не нейроны, быстро растут Fluo-4 флуоресценции, указывающий увеличение [Ca 2+] я. Обратите внимание, что ответившие клетки малы и окружают гораздо более крупные нейроны (темные места, отмеченные звездочками). (C) Кишечная глия реагирует на АТФ в зависимости от дозы с 1 ммоль / л выявления максимальных ответов 24. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть Более крупная версия этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3. мышей S-100-GFP + клеток в толстой мышечной оболочки кишечника сплетения реагируют на АТФ в месте. (А) S-100-GFP + глиальные клетки (зеленый) в толстой мышечной оболочки кишечника мыши ганглия (изложенные пунктирной линией). Шесть регионов интереса (трансформирования) окружающей глиальные клетки в пределах ганглиев представлены в виде желтых кругов. Стрелки указывают толстые участки волокна, ведущие в ганглии. Звездочки denote расположение 2 кишечными нейронов. (B) То же ганглий, показывая Род-2 флуоресценции при базальных условиях. (C) После стимуляции 100 мкмоль / л АТФ, глиальные клетки реагируют с повышенным [Ca 2+] я, как проявляется увеличением Rhod- 2 флуоресценции. (D) Следы, соответствующие каждой ROI, показанном на А-С. (E) Среднемесячная ответ (имею в виду ± SEM) из 6 областей исследования, указанных в D 24. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4. В месте визуализации кишечной связи нейрон-к-глии. () Типичные изображения (псевдоцветной) из эксперимента с изображениями Ca 2+, где вся монтажаподготовка мышечной оболочки кишечника сплетения вызов с нейронным агониста Р2Х7 рецепторов BzATP (100 мкм, 30 сек). Обратите внимание, что нейронная агонист вызывает увеличение флуоресценции Fluo4 в нейроне (А ') до окружающих кишечных клеток глии (А "). (В) Анализ изменения флуоресценции с течением времени в глии (синий) и нейронов (красный ) после применения нейронной агониста, BzATP. (C) нейрональных и глиальных реакций на BzATP в нормальном буфера (сплошные линии) и в буфере, содержащем низкой Ca 2+ и Mg 2+ (пунктирные линии), чтобы усиливать нейронные рецепторы Р2Х7 13. Пожалуйста, Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой цифры.

Видео 1. агонистом вызывало Ca 2+ ответ в кишечной глии вСиту. Это видео показывает мышечной оболочки кишечника ганглия мыши дистального отдела толстой кишки, загруженной с Ca 2+ индикатора красителя, Fluo-4. Агонист глиальных клеток, АДФ, добавляют в ванну, когда указано. ADP вызывает увеличение внутриклеточного Са 2+ в кишечной глии, наблюдаемых при помощи переходного возвышения в Fluo-4 флуоресценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть это видео.

Обсуждение

Методологии, описанные в данной рукописи, обеспечивают последовательный подход к эффективному изучению нейронов и энтеральной глии в ЭНС. Несмотря на то, что визуализация нейронов и энтеральной глии в культуре позволила получить богатое представление о функциях отдельных клеток, изучение этих клеток в их естественной, многоклеточной среде имеет решающее значение для нашего понимания их физиологии и патофизиологии. Флуоресцентная микроскопия является важнейшим методом оценки разнонаправленных взаимодействий клеток в ЭНС. Нагрузочные ячейки ЭНС с селективными флуоресцентными маркерами и получение изображений с помощью микроскопии высокого разрешения позволяют проводить количественные наблюдения клеточной активности в ЭНС. Визуализация живых образцов тканей ЭНС выполняется относительно быстро и позволяет получить большие объемы углубленных функциональных и пространственных данных. Препараты миентерального и подслизистого сплетения мышей, используемые в этих экспериментах, позволяют использовать молекулярные и генетические манипуляции. Визуализация Ca2+ в цельных препаратах является полезным инструментом для оценки взаимодействия нейронов и глии.

В передовых экспериментальных парадигмах несколько зондов могут быть объединены для получения информации о различных событиях внутри клеток. Флуоресцентная микроскопия позволяет записывать изображения с повышенным контрастом конкретных молекул, если используется соответствующая флуоресцентная метка. Fluo-4 был выбран потому, что он обладает большим динамическим диапазоном. Достаточное время инкубации имеет жизненно важное значение при использовании AM-красителей в ЭНС. Для достижения наилучших результатов может потребоваться корректировка концентрации красителя и метода загрузки. Идеальные препараты должны быть наполнены красителем в достаточном количестве, чтобы визуализировать изменения флуоресценции, но не настолько, чтобы краситель хелатировал ионы-мишени и мешал внутриклеточной сигнализации. Воздействие флуоресцентного света должно быть ограничено, чтобы предотвратить фототоксичность в клетках и фотообесцвечивание красителей.

Исследователи должны быть осторожны с некоторыми этапами этого эксперимента, особенно с приготовлением раствора и тканей. Особая осторожность должна быть соблюдена во время обработки и рассечения ткани ЭНС для поддержания клеточных функций. Желудочно-кишечный тракт содержит несколько слоев и разновидностей тканей, что создает проблемы для диссекции и качества визуализации в этих цельных препаратах 27. Кроме того, соединительные волоконные тракты MP шире, а ганглии больше, чем у SMP 2. Плотность нейронов миентерального сплетения выше по сравнению с подслизистым сплетением 28. Медленные и неточные вскрытия окажут пагубное влияние на качество препаратов сплетения и, следовательно, на общий успех экспериментов. Поэтому чистые/неповрежденные инструменты, практика и ловкость рук имеют решающее значение для этой процедуры.

При составлении цельных тканей следует тщательно продумать при построении областей интереса (ROI), чтобы правильно оценить кинетику и степень наблюдаемого изменения интенсивности флуоресценции желаемого типа клеток. Поскольку ганглии расположены на сократительном мышечном слое, артефакты движения, вызванные моторикой кишечника, являются основной проблемой во время визуализации in situ . Таким образом, подавление этих двигательных нарушений путем повторного связывания тканевых препаратов после инкубации с ферментами и добавления фармакологического ингибирования (никардипин/скополамин) в буферы позволяет получить четкое и надежное изображение. Помимо фармакологических и механических подходов к предотвращению движения тканей, недавние исследования иллюстрируют применение передовых методологий программного обеспечения и характеристик реакции типа клеток для коррекции остаточного движения тканей в записях и повышения точности анализа. За исключением этих технических препятствий, этот метод обеспечивает физиологически значимые условия для оценки морфологических и количественных характеристик нейронов и кишечной глии в ЭНС.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами от Фонда Ассоциации фармацевтических исследований и производителей Америки (PhRMA) (Б. Гулбрансену), грантом Национальных институтов здравоохранения (Построение междисциплинарных исследовательских карьер в области женского здоровья) грантом K12 HD065879 (Б. Гулбрансен) и стартовыми фондами от Университета штата Мичиган (Б. Гулбрансен).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Нагреватель шприцев BubbleStop AutoMate Scientific10-4-35-G
CaCl2SigmaC3306
Коллагеназа, тип II, порошокGibco17101-015
ДиспазаSigma-Aldrich42613-33-2
Инструменты для вскрытияRoboz 
DMSOSigma-AldrichD5879
Стационарный микроскопOlympus BX51WI
Fluo-4 AM красительInvitrogenF-14201
ГлюкозаSigmaG8270
Булавки от насекомыхFine Science ИнструментыMinutien Pins
iQ Программное обеспечение для визуализации живых клетокAndorAndor iQ3
KClSigmaP3911
MgCl2SigmaM9272
NaClSigmaS9888
2PO4SigmaS8282
NaHCO3SigmaS6014
Neo sCMOS камераAndorNeo 5.5 sCMOS
NicardipineSigmaN7510
Перфузионная камераЗаказной
перистальтический насосHarvard ApparatusModel 720
Pluronic F-127 InvitrogenP3000MP
ProbenecidP36400
ScopolamineSigmaS1013 
Sutter Lambda DG-4SutterDG-4
Sylgard Контроллер температуры Dow Corning184
WarnerInstrumentsTC-344C
Молекулярные зонды

Ссылки

  1. Furness, J. B. Types of neurons in the enteric nervous system. Journal of the Autonomic Nervous System. 81 (1-3), 87-96 (2000).
  2. Furness, J. B. The organization of the autonomic nervous system: peripheral connections. Neuroscience. 130 (1-2), 1-5 (2006).
  3. Pham, T. D., Gershon, M. D., Rothman, T. P. Time of origin of neurons in the murine enteric nervous system: sequence in relation to phenotype. Journal of Comparative Neurology. 314 (4), 789-798 (1991).
  4. Nasser, Y., et al. Role of enteric glia in intestinal physiology: effects of the gliotoxin fluorocitrate on motor and secretory function. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 291, G912-927 (2006).
  5. Glial cells in the gut. Neurogastroenterology & Motility. 17 (6), 777-790 (2005).
  6. Broadhead, M. J., Bayguinov, P. O., Okamoto, T., Heredia, D. J., Smith, T. K. Ca2+ transients in myenteric glial cells during the colonic migrating motor complex in the isolated murine large intestine. J. Physiol. 590, 335-350 (2012).
  7. Gulbransen, B. D., Bains, J. S., Sharkey, K. A. Enteric glia are targets of the sympathetic innervation of the myenteric plexus in the guinea pig distal colon. J. Neurosci. 30, 6801-6809 (2010).
  8. McClain, J. L., et al. Ca2+ Responses in Enteric Glia Are Mediated by Connexin-43 Hemichannels and Modulate Colonic Transit in Mice. Gastroenterology. 146 (2), 497-507 (2014).
  9. Chandrasekharan, B., et al. Colonic motor dysfunction in human diabetes is associated with enteric neuronal loss and increased oxidative stress. Neurogastroenterology & Motility. 23 (2), e131-e126 (2011).
  10. Abdo, H., et al. Enteric glial cells protect neurons from oxidative stress in part via reduced glutathione. FASEB J. 24, 1082-1092 (2010).
  11. Aube, A. C., et al. Changes in enteric neurone phenotype and intestinal functions in a transgenic mouse model of enteric glia disruption. Gut. 55, 630-637 (2006).
  12. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nature Reviews Molecular cell biology. 1 (1), 11-21 (2000).
  13. Gulbransen, B. D., et al. Activation of neuronal P2X7 receptor-pannexin-1 mediates death of enteric neurons during colitis. Nat Med. 18, 600-604 (2012).
  14. Bayguinov, P. O., Hennig, G. W., Smith, T. K. Calcium activity in different classes of myenteric neurons underlying the migrating motor complex in the murine colon. J Physiol. 588, 399-421 (2010).
  15. Okamoto, T., Bayguinov, P. O., Broadhead, M. J., Smith, T. K. Ca(2+) transients in submucous neurons during the colonic migrating motor complex in the isolated murine large intestine. Neurogastroenterol Motil. 24 (8), 769-778 (2012).
  16. Kunze, W. A., Clerc, N., Furness, J. B., Gola, M. The soma and neurites of primary afferent neurons in the guinea-pig intestine respond differentially to deformation. J Physiol. 526, 375-385 (2000).
  17. Schemann, M., Michel, K., Peters, S., Bischoff, S. C., Neunlist, M. Imaging and the gastrointestinal tract: mapping the human enteric nervous system. Am J Physiol. 282, G919-G925 (2002).
  18. Hennig, G. W., et al. Visualization of spread of pacemaker activity in through ICC in guinea-pig antrum. Neurogastro Motil. 14, 575(2001).
  19. Stevens, R. J., Publicover, N. G., Smith, T. K. Induction and organization of Ca2+ waves by enteric neural reflexes. Nature. 399, 62-66 (1999).
  20. Stevens, R. J., Publicover, N. G., Smith, T. K. Propagation and neural regulation of calcium waves in longitudinal and circular muscle layers of guinea-pig small intestine. Gastroenterology. 118, 982-984 (2000).
  21. Jessen, K. R., et al. Astrocyte-like glia in the peripheral nervous system: an immunohistochemical study of enteric glia. Journal of Neuroscience. 3 (11), 2206-2218 (1983).
  22. Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9, 625-632 (2012).
  23. Gomes, P., et al. ATP-dependent paracrine communication between enteric neurons and glia in a primary cell culture derived from embryonic mice. Neurogastroenterology & Motility. 21 (8), e870-e862 (2009).
  24. Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Purinergic neuron-to-glia signaling in the enteric nervous system. Gastroenterology. 136, 1349-1358 (2009).
  25. Ren, J., Bertrand, P. P. Purinergic receptors and synaptic transmission in enteric neurons. Purinergic Signal. 4, 255-266 (2008).
  26. Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. Measurement of intracellular calcium. Physiol Rev. 79, 1089-1125 (1999).
  27. Dongcheng, Z., et al. Neural crest regionalisation for enteric nervous system formation: implications for Hirschsprung's disease and stem cell therapy. Developmental Biology. 339 (2), 280-294 (2010).
  28. Gershon, M. D. Behind an enteric neuron there may lie a glial cell. J Clin Invest. 121, 3386-3389 (2011).
  29. Boesmans, W., et al. Imaging neuron-glia interactions in the enteric nervous system. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, (2013).

Перепечатки и разрешения

Теги

Кальциевый имиджингпрепарат целого образцафлуоресцентный индикаторный красительфлуоресцентная микроскопиямиэнтерическое сплетениенагрузка Fluo-4фармакологическая стимуляцияполучение изображенийактивность глиальных клеток
В Ситу Ca 2+ изображений нервной системы кишечной
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.