Здесь мы представляем методы визуализации локальных IP-3-опосредованных событийCa2+ с использованием флуоресцентной микроскопии в интактных клетках млекопитающих, загруженных индикаторамиCa2+, вместе с алгоритмом, который автоматизирует идентификацию и анализ этих событий.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Цитозольного Ca 2+ регулировать многие аспекты клеточной активности практически во всех типах клеток, контролируя процессы, широкие, как транскрипции генов, электрической возбудимости и пролиферации клеток. Разнообразие и специфичность Ca 2+ сигналов происходит от механизмов, посредством которых Ca 2+ сигналы генерируются действовать в течение различных временных и пространственных масштабах, начиная от сотовых всей колебаний и волн, происходящих в течение периодов от нескольких минут до местных переходных Ca 2+ микродоменов (Ca 2+ клубы) длительностью миллисекунд. Последние достижения в области электронного умножается CCD (EMCCD) камеры в настоящее время позволяют для работы с изображениями местных Ca 2+ сигналов с 128 х 128 пикселей пространственным разрешением со скоростью> 500 кадров с -1 (FPS). Такой подход чрезвычайно параллельный и позволяет одновременный мониторинг сотен каналов или слоеного сайтов в одном эксперименте. Тем не менее, огромное количество данных, полученных (около 1 Гб PER мин) оказывать визуальную идентификацию и анализ местного Ca 2+ события невыполнимую. Здесь мы опишем и продемонстрируем процедуры для приобретения, обнаружения и анализа местного IP 3 опосредованной Са 2+ сигналы в интактных клетках млекопитающих, нагруженных Са 2+ показателей в обеих широкого поля эпи-флюоресценции (WF) и полное внутреннее отражение флуоресценции (TIRF) микроскопия. Кроме того, мы опишем алгоритм, разработанный в рамках программной среде Python с открытым исходным кодом, которая автоматизирует выявление и анализ этих местных Ca 2+ сигналов. Алгоритм локализуется сайты Ca 2+ выпуска с разрешением суб-пикселей; позволяет отзыв пользователем данных; и выводит временные последовательности отношение флуоресцентных сигналов вместе с амплитудой и кинетических данных в Excel-совместимый таблице.
Введение
Ионы кальция (Ca 2+) повсеместно регулировать широкий спектр биологических процессов, в том числе генной экспрессии, секреции и длительных изменений в синаптической пластичности 1. Один из способов, через которые Са 2+ может действовать таким разнообразным образом через различных пространственных и временных форм Ca 2+ сигналы клеток может генерировать. Например глобальных высот в цитозоле [Са 2+] триггера сокращения в гладкой мышечной ткани 2, тогда как более мелкие, локальные переходные высоте (местные Ca 2+ Микродомены) стимулировать экспрессию генов, необходимую для обучения и памяти
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Мы представляем детальные процедуры для работы с изображениями местных Ca 2+ события в человеческой нейробластомы SH-SY5Y клеток. Эти процедуры могут быть адаптированы к изображения внутриклеточного Са 2+ сигналов во многих типах клеток 8-10.
1. Подготовка клеток
- Культуры клеток для включения в образ в соответствии с инструкцией, приведенной на веб-сайте своего поставщика.
- Через несколько дней до обработки изображений, урожай клеток, выращенных в культуре ткани колбу с использованием 1 мл 0,25% трипсина / EDTA (2-3 мин). После отрыва, добавить равный объем культуральной среды для инакт....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
1А показывает WF образ отдыха флуоресценции Cal-520 в нейробластомы человека SH-SY5Y, также загружаются с CI-IP 3. Воздействие этих клеток к 100 мсек УФ вспышкой фото-выпуска I-IP-3 вызвало переходные Ca 2+ затяжек на дискретных участках, обозначенных (белые кружки на фиг.1А). Флуоресцентные следы измеренные на этих сайтах показал быстрый рост фазы, обусловленные переходными отверстиями IP 3 R, с последующим гораздо медленнее падающего фазы
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы опишем протоколов для работы с изображениями местных Ca 2+ события в культивируемых клетках млекопитающих с использованием флуоресцентных Ca 2+ показателей. Кроме того, мы опишем алгоритм с интуитивно понятным пользовательским интерфейсом, который позволяет автоматизировать идентификацию и анализ полученных данных. Описанная здесь процедура использования флуоресцентного Са 2+ индикатор CAL-520, но и многие другие Ca 2+ чувствительные красители, такие как Fluo-3, Fluo-.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения GM 100201 для I.F.S, а также GM 048071 и GM 065830 для I.P.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Клетки нейробластомы человека SH-SY5Y | ATCC | CRL-2266 | |
| Cal-520/AM | AAT Bioquest Inc. | 21130 | |
| CI-IP3 (D-23-O-изопропилиден-6-O-(2-nitro-4,5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 1,4,5-трисфосфат-Hexakis(propionoxymethyl) Ester | SiChem | cag-iso-2-145-10 | |
| DMSO/20% плуроновой F127 | Invitrogen | P-3000MP | |
| EGTA/AM | Invitrogen | E-1219 | |
| Посуда со стеклянным дном 35 мм | MatTek | P35G-1.5-14-C |
Ссылки
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
- Hill-Eubanks, D. C., Werner, M. E., Heppner, T. J., Nelson, M. T. Calcium signaling in smooth muscle. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
