Изображений Локальный ЦС<sup&gt; 2+</sup&gt; Сигналы в культуре клетках млекопитающих

Краткое содержание

Здесь мы представляем методы визуализации локальных IP-3-опосредованных событий^Ca2+ с использованием флуоресцентной микроскопии в интактных клетках млекопитающих, загруженных индикаторами^Ca2+, вместе с алгоритмом, который автоматизирует идентификацию и анализ этих событий.

Аннотация

Цитозольного Ca ²⁺ регулировать многие аспекты клеточной активности практически во всех типах клеток, контролируя процессы, широкие, как транскрипции генов, электрической возбудимости и пролиферации клеток. Разнообразие и специфичность Ca ²⁺ сигналов происходит от механизмов, посредством которых Ca ²⁺ сигналы генерируются действовать в течение различных временных и пространственных масштабах, начиная от сотовых всей колебаний и волн, происходящих в течение периодов от нескольких минут до местных переходных Ca ²⁺ микродоменов (Ca ²⁺ клубы) длительностью миллисекунд. Последние достижения в области электронного умножается CCD (EMCCD) камеры в настоящее время позволяют для работы с изображениями местных Ca ²⁺ сигналов с 128 х 128 пикселей пространственным разрешением со скоростью> 500 кадров с ^-1 (FPS). Такой подход чрезвычайно параллельный и позволяет одновременный мониторинг сотен каналов или слоеного сайтов в одном эксперименте. Тем не менее, огромное количество данных, полученных (около 1 Гб PER мин) оказывать визуальную идентификацию и анализ местного Ca ²⁺ события невыполнимую. Здесь мы опишем и продемонстрируем процедуры для приобретения, обнаружения и анализа местного IP ₃ опосредованной Са ²⁺ сигналы в интактных клетках млекопитающих, нагруженных Са ²⁺ показателей в обеих широкого поля эпи-флюоресценции (WF) и полное внутреннее отражение флуоресценции (TIRF) микроскопия. Кроме того, мы опишем алгоритм, разработанный в рамках программной среде Python с открытым исходным кодом, которая автоматизирует выявление и анализ этих местных Ca ²⁺ сигналов. Алгоритм локализуется сайты Ca ²⁺ выпуска с разрешением суб-пикселей; позволяет отзыв пользователем данных; и выводит временные последовательности отношение флуоресцентных сигналов вместе с амплитудой и кинетических данных в Excel-совместимый таблице.

Введение

Ионы кальция (Ca ²⁺⁾ повсеместно регулировать широкий спектр биологических процессов, в том числе генной экспрессии, секреции и длительных изменений в синаптической пластичности ^1. Один из способов, через которые Са ²⁺ может действовать таким разнообразным образом через различных пространственных и временных форм Ca ²⁺ сигналы клеток может генерировать. Например глобальных высот в цитозоле [Са ^2+] триггера сокращения в гладкой мышечной ткани ^2, тогда как более мелкие, локальные переходные высоте (местные Ca ²⁺ Микродомены) стимулировать экспрессию генов, необходимую для обучения и памяти ^3.

Бесплатный цитозольный [Ca ^2+] поддерживается на ~ 100 нм в покое, но может быстро подняться до нескольких микро-моляра после притока Ca ²⁺ в цитозоле через Са ²⁺ -permeable ионные каналы, расположенные в мембране и освобождение Са ²⁺ из внутриклеточных сTores. В нашей лаборатории фокусируется на инозитол 1,4,5-трифосфата рецептора _(IP-3 R), который образует канал выпуска ²⁺ Ca, расположенной в эндоплазматический ретикулум (ER) мембраны. После связывания как IP ₃ и Са ²⁺ в цитозоле активации сайты рецептора, R канал IP ₃ открывает освободить Ca ²⁺ поглощенных в ER просвет. Релиз Ca ²⁺ может оставаться пространственно ограничена небольшим кластера IP ₃ рупий для создания местного цитозольную микродоменной Ca ²⁺ (Ca ²⁺ слоеного ⁴⁾ или, в зависимости от близости соседних кластеров IP ₃ R, может распространяются по всей клетке, привлекая множество сайтов слоеные с помощью процесса, Са ^2+, индуцированной Ca ²⁺ -release (CICR) ^5,6.

Введение флуоресцентных маленькая молекула Са ²⁺ индикатор красителей разработана Роджером Tsien ^7, в сочетании с передовой микроскопии томографовнг методы, значительно облегчило наше понимание Ca ²⁺ сигнализации. Последние достижения в области камер, используемых для микроскопии позволяют сейчас для визуализации переходных местных Ca ²⁺ события, такие как клубы с беспрецедентной пространственным и временным разрешением. Имеющиеся в настоящее время EMCCD камеры позволяют изображений с 128 х 128 пикселей при> 500 кадров с ^-1 (кадров в секунду) и новое поколение дополнительной полупроводника из оксида металла (CMOS) камеры обеспечивают более высокое разрешение в пикселях, и даже более высокую скорость за счет немного выше уровень шума. В сочетании с полного внутреннего отражения (TIRF) микроскопии стало возможным с изображением одного Ca ²⁺ события ^8,9 каналов. Такой подход позволяет визуализации сотен каналов / событий одновременно, при создании больших наборов данных (около 1 Гб в минуту), которые делают ручную обработку, визуальную идентификацию и анализ непрактичным и разместить ответственность на разработке автоматизированных алгоритмов.

Здесь мы представляем процедур и протоколов для работы с изображениями местных Ca ²⁺ сигналы в интактных клетках млекопитающих с использованием флуоресцентных Ca ²⁺ показателей. Кроме того, мы продемонстрировать алгоритм, разработанный в среде Python с открытым исходным кодом, которая автоматизирует идентификацию и анализ локальных Ca ²⁺ событий, отображаемых как TIRF и обычные широкое поле эпи-флуоресценции (WF) микроскопии. Хотя мы опишем эти подходы в контексте ИС ₃ -порожденная Ca ²⁺ сигналы, они легко поддаются изучению локальных изменений в цитозоле [Са ^2+], исходящие из различных Са ²⁺ -permeable ионные каналы, расположенные в любом поверхности мембрану или внутриклеточные органеллы ^8-10.

Протокол

Мы представляем детальные процедуры для работы с изображениями местных Ca ²⁺ события в человеческой нейробластомы SH-SY5Y клеток. Эти процедуры могут быть адаптированы к изображения внутриклеточного Са ²⁺ сигналов во многих типах клеток ^8-10.

1. Подготовка клеток

1. Культуры клеток для включения в образ в соответствии с инструкцией, приведенной на веб-сайте своего поставщика.
2. Через несколько дней до обработки изображений, урожай клеток, выращенных в культуре ткани колбу с использованием 1 мл 0,25% трипсина / EDTA (2-3 мин). После отрыва, добавить равный объем культуральной среды для инактивации трипсина.
3. Выполните подсчет клеток с использованием гемоцитометра и семян клеток в стеклянное дно блюд изображений при плотности 3-7 х 10 ⁴ клеток на чашку. Выделите ячейки для экспериментов с изображениями, когда они достигают 60% слияния (2-3 дня).

2. Приготовление растворов и реактивов

1. Подготовка Ca ²⁺ -содержащего HEPES в буфересолевой раствор (Са ²⁺ -HBSS) состоит из (мМ): NaCl 135, KCl 5,4, _CaCl2, 2, 1 MgCl _2, 10 HEPES, 10 глюкозы и; рН = 7,4 при комнатной температуре (RT) с помощью NaOH. Подготовка Ca ²⁺ -HBSS без добавления глюкозы и хранят при температуре 4 ° С; добавить глюкозы в растворе непосредственно перед использованием.
2. Солюбилизации мембранных проникающий формы флуоресцентного индикатора Са ²⁺ Cal-520 (1 мМ), _CI-IP-3 (200 мкМ), и EGTA (100 мМ) в диметилсульфоксиде (ДМСО), содержащих 20% Pluronic F-127. Алиготе этих реагентов в пробирки Эппендорф и хранить, защищенных от влаги и света, при температуре -20 ° C.

3. Загрузка Клетки с мембраной проникающий Cal-520, CI-IP ₃ и EGTA

1. Подготовка "загрузочного буфера" путем разбавления исходных растворов мембран проникающий Cal-520 и CI-IP ₃ до конечной концентрации 5 мкМ и 1 мкМ, соответственно, в Са ²⁺ -HBSS.
2. Отберите у.е.lture СМИ и промыть клетки, замену носителя с Са ²⁺ -HBSS три раза.
3. Удалить Ca ²⁺ -HBSS и инкубировать клетки в буфере для нанесения в течение 60 мин при комнатной температуре в темноте.
4. Удалить загрузки буфер и промыть клетки, замену носителя с Са ²⁺ -HBSS три раза.
   1. При желании на этом этапе, тензодатчики с EGTA / AM разбавлением исходного раствора в конечной концентрации 5 мкМ в Ca ²⁺ -HBSS а затем инкубируют клетки в течение 30-60 мин при комнатной температуре в темноте. После этого инкубирования промойте ячеек три раза Ca ²⁺ -HBSS затем переходите к шагу 3.5.
5. Инкубируйте клетки в Ca ²⁺ -HBSS в течение 30 мин, чтобы обеспечить деэтерификации загруженных реагентов.
6. Непосредственно перед визуализации, заменить Са ²⁺ -HBSS с "свежей" Ca ²⁺ -HBSS, чтобы удалить какой-либо краситель, который мог бы утечка в ванне во время конечного инкубации.

4. Ca ²⁺ Приобретение изображения

1. Поместите небольшую каплю иммерсионного масла на цели 100X APO TIRF (NA 1.49).
2. Установите блюдо изображений на этапе инвертированного микроскопа и принести клеток в фокусе, используя проходящем свете. Важно, чтобы обеспечить блюдо изображений, чтобы предотвратить движение во время записи.
3. Осветить клетки с 488 нм лазера, чтобы возбудить Cal-520 и собрать излучаемую флуоресценции (λ> 510 нм), используя высокоскоростной EMCCD камеру.
   ПРИМЕЧАНИЕ: пакет программного обеспечения, который работает микроскоп позволяет пользователю перевести фокусирующей линзы, позволяющие лазерный луч, чтобы быть введены либо на самом краю объективной обратной диафрагму (для TIRF возбуждения) или ближе к центру (для "WF" возбуждения).
4. Использование программного обеспечения EMCCD, уменьшить поле изображения с полным 512 х 512 пикселей для того, чтобы собирать данные по необходимой временным разрешением, чтобы захватить локальные Ca ²⁺ события.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Например, центр Quadприобретение 256 х 256 пикселей ускоряет процесс приобретения до 66 кадров в секунду. Кроме того, можно дополнительно увеличить частоту кадров EMCCD камеры к 500 кадров в секунду с использованием изолированного функция режима урожай.
5. Настройка программного обеспечения для автоматической записи несколько секунд базовой деятельности, доставить УФ вспышки в клетки и продолжить запись еще 10-30 сек.
   Примечание: УФ флэш поставляется с использованием ксеноновой дуговой источник света вводится через УФ отражающей дихроичное зеркало в задней порта микроскопом. Продолжительность и интенсивность УФ-вспышки регулируется эмпирически, чтобы вызвать желаемую частоту местных Са ²⁺ событий.
6. Сохранить файлы в качестве изображения стеки для анализа в автономном режиме.

5. Автоматизированная Ca Анализ ²⁺ изображения

ПРИМЕЧАНИЕ: Можно просматривать, обрабатывать и анализировать полученные данные с помощью многих коммерческих программных пакетов. Тем не менее, мы разработали алгоритм для быстрого автоматизации идентификациейd анализ локальных Ca ²⁺ сигналов. Подробное описание пространственных и временных фильтров, используемых в данном алгоритме, генерация подпрограмм; F / F ₀ и идентификации / анализа можно найти в ^11. Этот алгоритм был разработан для работы на платформе программного обеспечения с открытым исходным кодом Python, и могут быть получены, вместе с образцами экспериментальных данных и подробные инструкции пользователей, по электронной почте об авторе (ismith@uci.edu).

1. Преобразование файлов, которые будут импортированы в специально написанный алгоритм в формат файла Multi-самолета .tiff.
2. Найдите папку, содержащую алгоритм анализа и дважды щелкните run.exe.
3. Выберите .tiff файл для анализа.
4. Выберите параметры анализа в диалоговом окне Открыть. Смотрите рисунок 2А для параметров по умолчанию для выборки данных.
5. Определить уровень черного, которые будут компенсированы из стека изображения либо перемещении курсора на части поля зрения, что делает пOT содержать ячейку (рис 2б) или вручную, путем ввода уровень черного, используя "Set Уровень черного строки.
6. Соблюдайте четыре окна на экране после анализа программного обеспечения (рис 2С-F). С монохромный образ отдыха флуоресценции из клеток анализируется. Белые квадраты, наложенные на этой фотографии являются места событий, определяется как центра тяжести позиций двумерных гауссовых функций, установленных на события.
7. Нажмите на каждом месте события или нажмите клавиши курсора для переключения между событиями. После выполнения этого фон вычитается, Gaussian сглаживаются изменения соотношения флуоресценции (; F / F ₀₎ в каждой из этих сайтов обновлений в окне D.
   ПРИМЕЧАНИЕ: красным цветом события полны решимости происходят из этого конкретного сайта, а не из «просачивание через" от деятельности локализованного в соседние сайтов. Нижний синий след указывает, где сигнал флуоресценции в выбранном месте превышает обнаруженияПорог, в то время как черные линии определяет события, происходящие из этого конкретного сайта (в соответствии с красным цветом события).
8. Нажмите на красным цветом событие для обновления окна E, который отображает временную эволюцию события, а окна F, который отображает пространственный профиль случае, усредненная по ее течения времени, вместе с пространственным профилем оборудованной функцией Гаусса.
9. Вручную просмотреть события, которые были определены таким образом, чтобы артефакты могут быть отклонены из анализа. Удалить такие события, щелкнув правой кнопкой мыши красным цветом события.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В наших руках, Ca ²⁺ поток через отдельные каналы IP ₃ R вызывает сигналы с; F / F ₀ о 0,11, так что, скорее всего, ложные срабатывания любых обнаруженных «события» заметно меньше, чем это.
10. Экспорт данных, выбрав пункт "Сохранить Excel" или экспортировать данные на чейно, опираясь вокруг клеток, представляющих интерес и выбрав "Сохранить CellR17 ;.
    Примечание: Данные сохраняются в той же папке, что и оригинальный стек изображений.

Результаты

1А показывает WF образ отдыха флуоресценции Cal-520 в нейробластомы человека SH-SY5Y, также загружаются с CI-IP _3. Воздействие этих клеток к 100 мсек УФ вспышкой фото-выпуска _I-IP-3 вызвало переходные Ca ²⁺ затяжек на дискретных участках, обозначенных (белые кружки на фиг.1А). Флуоресцентные следы измеренные на этих сайтах показал быстрый рост фазы, обусловленные переходными отверстиями IP ₃ R, с последующим гораздо медленнее падающего фазы

Обсуждение

Здесь мы опишем протоколов для работы с изображениями местных Ca ²⁺ события в культивируемых клетках млекопитающих с использованием флуоресцентных Ca ²⁺ показателей. Кроме того, мы опишем алгоритм с интуитивно понятным пользовательским интерфейсом, который позволяет автоматизировать идентификацию и анализ полученных данных. Описанная здесь процедура использования флуоресцентного Са ²⁺ индикатор CAL-520, но и многие другие Ca ²⁺ чувствительные красители, такие как Fluo-3, Fluo-...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Клетки нейробластомы человека SH-SY5Y	ATCC	CRL-2266
Cal-520/AM	AAT Bioquest Inc.	21130
CI-IP3 (D-23-O-изопропилиден-6-O-(2-nitro-4,5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 1,4,5-трисфосфат-Hexakis(propionoxymethyl) Ester	SiChem	cag-iso-2-145-10
DMSO/20% плуроновой F127	Invitrogen	P-3000MP
EGTA/AM	Invitrogen	E-1219
Посуда со стеклянным дном 35 мм	MatTek	P35G-1.5-14-C