Измерение барьера для межвидовой передачи прионных заболеваний является сложной задачей и, как правило, включает в себя испытания на животных или биохимические анализы. В данной работе мы представляем анализ конверсии прионных белков in vitro, способный предсказывать видовые барьеры.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Оценка Трансмиссивные губчатой энцефалопатии видов барьеров с
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Исследования для понимания межвидовой передачи трансмиссивных губчатых энцефалопатий (ТГЭ, прионные заболевания) сложны тем, что они обычно основаны на длительных и дорогостоящих исследованиях на животных in vivo. Ряд тестов in vitro был разработан для измерения барьеров прионных видов, тем самым сокращая использование животных и обеспечивая более быстрые результаты, чем биотесты на животных. В данной статье мы представляем протокол для быстрого анализа конверсии прионов in vitro, называемого анализом коэффициента эффективности преобразования (CER). В этом анализе клеточный прионный белок (PrPC) из неинфицированного мозга хозяина денатурируется при pH 7,4 и 3,5 для получения двух субстратов. Когда субстрат с pH 7,4 инкубируют с агентом TSE, количество PrPC, которое переходит в устойчивое к протеиназе K (PK) состояние, модулируется видовым барьером исходного хозяина для агента TSE. Напротив, PrPC в субстрате pH 3,5 неправильно сворачивается любым агентом TSE. Сравнивая количество PK-резистентного прионного белка в двух субстратах, можно провести оценку видового барьера хозяина. Мы показываем, что анализ CER правильно предсказывает барьеры известных видов прионов лабораторных мышей и, в качестве примера, показываем некоторые предварительные результаты, свидетельствующие о том, что рыси (Lynx rufus) могут быть восприимчивы к возбудителю хронической болезни истощения белохвостого оленя (Odocoileus virginianus).
Введение
Трансмиссивных губчатых энцефалопатий (ТГЭ, прионные болезни) являются группа фатальных нейродегенеративных заболеваний с длительный инкубационный период, которые влияют на разные виды животных и людей. Предполагаемый этиологический агент ЦЭС состоит из неправильно свернутых изомера хост прионного белка (PrP), который способен самораспространения по шаблону приводом конверсии нормального клеточного виде PrP (PrP C) в инфекционное, болезни, связанные Форма (PRP TSE), который накапливается в центральной нервной системе тканях инфицированного хозяина 1. Инфекционные прионы млекопитающих обычно передают от хоста к хосту в видоспецифическо....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Животное работ, проводимых на USGS Национальный центр здравоохранения дикой природы был проведен в соответствии с NIH Управления принципов Лаборатория здоровья животных, и под институциональной ухода за животными и использование комитета протокол № EP080716. Ткани из охотников-добытых животных были подарки от Висконсина или Мичиган департаментов природных ресурсов.
1. Решение Подготовка
ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенные ниже решения, необходимые для подготовки CER анализа субстрата в разделе 2 ниже. Подготовка каждого из этих растворов от более высокой концентрации исходных растворов; Рекомендуемые концен....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Успешное использование ССВ анализа во многом зависит от качества пар используемого субстрата в реакциях конверсии. По этой причине, после процедур для подготовки ССВ пары подложек, контроль качества иммуноблот должны быть выполнены (рисунок 2). Для обоих субстратов, анализ 10-25 мкл иммуноблоттингом. PrP C должна быть легко обнаружить в каждой подложки и уровни PrP C должна быть примерно такой же между ними. Иммунореактивность будет в основном видна над 20 кДа, но меньше полосы мог.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Для успешного завершения этого протокола, внимание должно быть уделено уровнях PrP C в неинфицированных тканей мозга, используемого для подготовки поверхности (шаг 2.1.2) и семян в подложку соотношение для преобразования реакций (шаг 4.4.2). По нашему опыту, мозг может быть извлечен для использования в качестве ССВ подложке после значительного периода посмертного тех пор, как PrP C присутствует иммуноблоттингом (рисунок 4). В самом деле, некоторые автолиза наблюдалось в мозгах рыси.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарим Джона Олсена (Департамент природных ресурсов штата Висконсин), Тома Кули, Дэниела О'Брайена и Стива Шмитта (Департамент природных ресурсов штата Мичиган) и доктора Дэниела Уолша (Национальный центр здоровья дикой природы USGS) за помощь в приобретении тканей. Мы также благодарим Лабораторию гигиены штата Висконсин за услуги по диагностическому тестированию, а также доктора Тони Рокк и ее сотрудников (Национальный центр здоровья дикой природы USGS) за использование оборудования. Любое использование торговых наименований, названий продуктов или фирм носит исключительно описательный характер и не подразумевает одобрения со стороны правительства США.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 12% Bis-Tris SDS-PAGE гели | Life Technologies | NP0342 | |
| 0,5 мм Гранулы оксида циркония | Next Advance | ZROB05 | Другие разновидности гранул также являются эффективными |
| Антитела | различные поставщики | Выберите подходящие первичные и вторичные антитела для иммуноблоттинга обнаружения PrPres из интересующих видов | |
| Гомогенизатор | шариковДалее Усовершенствованная | BBY24M | |
| Beckman Coulter | 369434 | Высокая скорость с контролем температуры | |
| Конические трубки | любой марки | ||
| Аппликатор с ватным наконечником | Uline | S-18991 | |
| Cuphorn sonicator | Heat Systems-Ultrasonics | W-380 | Heat Systems-Ultrasonics, Inc. теперь Qsonica, LLC |
| Densitometry программное обеспечение | UVP | Vision Works LS Программное обеспечение для получения и анализа изображений | Другие программы, такие как NIH ImageJ, также будут работать |
| Dounce гомогенизатор | Kimble Chase | 885300 | |
| End-over-end mixer | Labnet | International H5600 | |
| Этилендиаминтетра уксусной кислоты | Boston Bioproducts | P-770 | Опасное химическое вещество: раздражение глаз |
| Гуанидина гидрохлорид, 8 м | Thermo Fisher Scientific | 24115 | Опасное химическое вещество: острая токсичность, раздражение кожи, раздражение глаз |
| Нагревательный блок | Fisher Scientific | 11-718 | |
| Соляная кислота | Sigma-Aldrich | 435570 | Опасное химическое вещество: сильная кислота |
| Буфер для проб додецилсульфата лития, 4x | Life Technologies | NP0008 | Опасные химические вещества: кожа и раздражение дыхательных путей, серьезное поражение глаз, легковоспламеняющийся твердый |
| метанол | Fisher Scientific | A454-4 | Опасные химические вещества: острая токсичность, легковоспламеняющаяся жидкость |
| Микроцентрифуга пробирки | любой марки | ||
| Мини-центрифуга | Labnet International | C1301 | |
| N-лауроил-саркозин (саркозил) | Sigma-Aldrich | L-5125 | Опасные химические вещества: острая токсичность, раздражение кожи, повреждение глаз |
| Nonidet P-40 | Amresco | M158 | Опасные химические вещества: раздражение кожи, повреждение глаз |
| гелевая система SDS-PAGE | Система | электрофореза Life Technologies NuPAGE | Другие системы SDS-PAGE также будут работать |
| ПЦР-пробирками (с низким связыванием) | Axygen | PCR-02-L-C | |
| Пестик-гомогенизатор | Fisher Scientific | 03-392-106 | |
| pH-метр | Sentron | SI600 | |
| Мембрана из поливинилдифторида | Миллипоры | IPVH00010 | |
| протеиназа K | Promega | V3021 | Опасные химические вещества: раздражение кожи и глаз, сенсибилизация дыхательных путей, снижение токсичности органов |
| для образцов SDS-PAGE, 10x | Life Technologies | NP0009 | |
| Хлорид натрия | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Дезоксихолат натрия | Sigma-Aldrich | D6750 | Опасное химическое вещество: острая токсичность |
| Додецилсульфат натрия | Thermo Fisher Scientific | 28364 | Опасное химическое вещество: острая токсичность, раздражение кожи, повреждение глаз, легковоспламеняющееся твердое вещество |
| Гидроксид натрия | Sigma-Aldrich | S5881 | Опасное химическое вещество; прочное основание |
| Шприц | BD Biosciences | различные | Используйте размер шприца, соответствующий объемам гомогенизируемого субстрата |
| Иглы для шприцев | BD Biosciences | различные | |
| термошейкеры (шейкер для ПЦР-трубок) | Hangzhou All Sheng Instruments | MS-100 | |
| Tris base | Bio Basic | 77-86-1 | Опасные химические вещества: раздражение кожи, глаз, дыхательных путей |
| Triton X-100 | Integra Chemical Company | T756.30.30 | Опасные химические вещества: острая токсичность, раздражение глаз |
| Вихревой | Fisher Scientific | 12-812 |
Ссылки
- Colby, D. W., Prions Prusiner, S. B. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a006833(2011).
- Hill, A. F., Collinge, J. Prion strains and species barriers. Contrib Microbiol. 11, 33-49 (2004).
- Scott, M., et al. Transgenic mice expre....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
