Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оценка Трансмиссивные губчатой ​​энцефалопатии видов барьеров с

7.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52522

⸱

10 марта 2015 г.

 ,  ,  ,  , 
1USGS National Wildlife Health Center, 2Department of Soil Science, University of Wisconsin–Madison, 3Laboratory of Immunology, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 4Merial Veterinary Scholars Program, School of Veterinary Medicine, University of Wisconsin–Madison, 5Department of Neurology, University of British Columbia

В этой статье

Краткое содержание

Измерение барьера для межвидовой передачи прионных заболеваний является сложной задачей и, как правило, включает в себя испытания на животных или биохимические анализы. В данной работе мы представляем анализ конверсии прионных белков in vitro, способный предсказывать видовые барьеры.

Аннотация

Исследования для понимания межвидовой передачи трансмиссивных губчатых энцефалопатий (ТГЭ, прионные заболевания) сложны тем, что они обычно основаны на длительных и дорогостоящих исследованиях на животных in vivo. Ряд тестов in vitro был разработан для измерения барьеров прионных видов, тем самым сокращая использование животных и обеспечивая более быстрые результаты, чем биотесты на животных. В данной статье мы представляем протокол для быстрого анализа конверсии прионов in vitro, называемого анализом коэффициента эффективности преобразования (CER). В этом анализе клеточный прионный белок (PrPC) из неинфицированного мозга хозяина денатурируется при pH 7,4 и 3,5 для получения двух субстратов. Когда субстрат с pH 7,4 инкубируют с агентом TSE, количество PrPC, которое переходит в устойчивое к протеиназе K (PK) состояние, модулируется видовым барьером исходного хозяина для агента TSE. Напротив, PrPC в субстрате pH 3,5 неправильно сворачивается любым агентом TSE. Сравнивая количество PK-резистентного прионного белка в двух субстратах, можно провести оценку видового барьера хозяина. Мы показываем, что анализ CER правильно предсказывает барьеры известных видов прионов лабораторных мышей и, в качестве примера, показываем некоторые предварительные результаты, свидетельствующие о том, что рыси (Lynx rufus) могут быть восприимчивы к возбудителю хронической болезни истощения белохвостого оленя (Odocoileus virginianus).

Введение

Трансмиссивных губчатых энцефалопатий (ТГЭ, прионные болезни) являются группа фатальных нейродегенеративных заболеваний с длительный инкубационный период, которые влияют на разные виды животных и людей. Предполагаемый этиологический агент ЦЭС состоит из неправильно свернутых изомера хост прионного белка (PrP), который способен самораспространения по шаблону приводом конверсии нормального клеточного виде PrP (PrP C) в инфекционное, болезни, связанные Форма (PRP TSE), который накапливается в центральной нервной системе тканях инфицированного хозяина 1. Инфекционные прионы млекопитающих обычно передают от хоста к хосту в видоспецифического образом, что привело к концепции "TSE видовой барьер», который ограничивает события передачи межвидовой 2. Биологические детерминанты прионов видовой барьер не очень хорошо понял. Сходство аминокислотной последовательности между инфекционной PrP TSE и принимающей PrP C Cсильно влияют принимает ли преобразование разместить 3-5, но остается недостаточным для объяснения всех событий передачи прионов, наблюдаемые в естественных условиях 6,7.

Таким образом, характеристика TSE видов барьеров в значительной степени полагаться на животное призов исследований: подвергая наивные животных от данного вида прионов от другого и измерения результирующего время инкубации до начала заболевания и скорости атаки в качестве показателей эффективности передачи. Мыши, экспрессирующие PrP C от гетерологичных видов также используются для этого типа исследования 8. Расходы, связанные с трансгенных мышей и затяжных прионов биопробы, а также этических соображений использования животных, являются препятствием для экспериментального исследования TSE видов барьеров. Оценка видовой барьер человеческого ТГЭ опирается на мышах, чтобы выразить человеческую PrP C. Эти мыши требуют длительных периодов инкубации поддаваться человека ТГЭ или модификации Т-он человек молекула PrP C для быстрого начала болезни 9. Инкубационный период для не-человеческого ТГЭ у этих мышей может выходить за пределы нормального срока службы мыши делает интерпретацию отрицательных результатов сложных. Номера для человека приматов также используется в качестве прокси для изучения барьеров видов человека, но эти исследования чревато теми же проблемами, как и другие виды экспериментов на животных и приматов, возможно, не точно воспроизводят болезнь, как это происходит в организме человека.

Биопробы на животных остаются метод "золотым стандартом" для измерения восприимчивости видов на TSE, но препятствия, расходы и этика этих живых исследованиях на животных заставили расследование альтернатив. Количество анализов в пробирке, основанных на оценке превращение PrP C хозяина в протеиназы K (PK) резистентные состояние (PRP разрешением), когда засевали PrP TSE, были разработаны и использованы для исследования TSE Species барьеры 10-12. Примеры анализов в пробирке включают бесклеточных анализов преобразования, белок неправильного сворачивания циклической амплификации (PMCA), а коэффициент эффективности преобразования (CER) анализа 10-14. Хотя ни один из этих методов анализа не учитывают периферийных факторов, участвующих в видовых барьеров после естественной инфекции, все может быть полезно для выявления потенциально восприимчивых хозяев за ТГЭ.

Здесь мы представляем протокол для ССВ анализа, в котором два денатурированные субстраты PrP C, полученные из нормальных гомогенатах головного мозга используется в настольной реакций конверсии прионов (рис 1) 13. PrP C в субстрате денатурированный при рН 7,4 может быть преобразован только PrP разрешении по PrP TSE высевали в реакции в отсутствие какого-либо вида барьера 14. В отличие от этого, денатурация PrP C в другую подложку при рН 3,5 позволяет ему быть преобразованы в PRP Рез После инкубациис PrP TSE от любого вида и служит в качестве контроля для преобразования. Отношение конверсии PrP C в PrP разрешении в рН 7,4 по отношению к подложке, что рН 3,5 подложки обеспечивает меру видовой барьер. Мы обнаружили, что CER анализ предсказывает известных видов барьеров лабораторных мышей различных ТГЭ и использовали пробу в усилиях предсказать видовой барьер многочисленных видов млекопитающих, в том числе снежного барана, к хронической изнуряющая болезнь (УХО) и других ТГЭ 14, 15. Следователи заинтересованные в инструмент, позволяющий оперативно провести проверку TSE видов барьеров или оценки конверсии PRP ĉ -Чтобы-ПРП ВИЭ найти эту методологию полезной.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Животное работ, проводимых на USGS Национальный центр здравоохранения дикой природы был проведен в соответствии с NIH Управления принципов Лаборатория здоровья животных, и под институциональной ухода за животными и использование комитета протокол № EP080716. Ткани из охотников-добытых животных были подарки от Висконсина или Мичиган департаментов природных ресурсов.

1. Решение Подготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: Приведенные ниже решения, необходимые для подготовки CER анализа субстрата в разделе 2 ниже. Подготовка каждого из этих растворов от более высокой концентрации исходных растворов; Рекомендуемые концентрации для маточных растворов будут даны в скобках после каждого соответствующего химического названия в списке. Подготовка всех решений свежие при подготовке субстрата и хранят при 4 ° С до использования.

  1. Для буфера для лизиса, приготовить раствор, следующих в 10 мМ Трис, рН 7,5 (1 M Трис, pH 7,5 раствор рекомендуется): 100 мм · сOdium хлорида (NaCl, 1 М раствор), 10 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА, 500 мМ ЭДТА, рН 8,0 раствор), 0,5% NP-40 (10% раствор), 0,5% дезоксихолат (DOC, 10% раствор ).
  2. Для буфера преобразования, приготовить раствор 0,05% додецилсульфата натрия (SDS, 10% основного раствора) и 0,5% Triton X-100 (10% основного раствора) в 1 фосфатным буферным раствором (PBS, 10, рН 7,4 раствор).
  3. Для хаотропных решений, подготовить два 3 М раствора гидрохлорида гуанидина (GdnHCl, 8 М акций) в 1x PBS (10x маточного раствора). Доводят рН одного из растворов до 3,5 ± 0,05 при помощи концентрированной соляной кислоты (HCl). Убедитесь, что рН раствора во втором остается при рН 7,4 ± 0,05 и регулировать с помощью концентрированной HCl и гидроокись натрия (NaOH), если необходимо.

2. Подготовьте ССВ Анализ подложки Пары

  1. Получить здоровых, не TSE-инфицированных тканей головного мозга от видов, представляющих интерес и подготовить 10% веса каждого тома(Масса / объем) гомогената в буфере для лизиса, используя любой из следующих методов: Даунса, шарик-стана или ступку и пестик гомогенизации. Уточнить результате гомогенаты, подвергая их, шприц-и-игл гомогенизации, используя иглы увеличением калибра, пока субстрат не может быть атмосферный и изгнали с легкостью через 27 G иглу шприца.
    1. Для подложках от грызунов и других мелких млекопитающих, гомогенизации весь мозг (ы); для субстратов, полученных из более крупных млекопитающих, использовать задвижки (ствола мозга) тканей для подготовки гомогенаты. При выборе количества гомогената мозга, не подготовить не более 50% от емкости центрифуги, используемой для осаждения белка на этапе 2.6.
    2. Если качество приобретенной ткани головного мозга под вопросом, оценки уровня PrP C помощью SDS-PAGE 16 и иммуноблот 17 до ПОДГОТОВКА ПОВЕРХНОСТИ.
  2. Разделить гомогената мозга на две равные объемы в отдельных меченых пластиковых конических пробирках. Добавить GdnHCl (3 М растворов в 1 PBS) в любом рН 3,5 или 7,4 в каждую пробирку в соотношении 1: 1 объема к гомогената мозга.
  3. Проверьте значения рН двух решений. Доводят рН рН 3,5 до рН субстрата ± 0,05 при помощи концентрированной HCl. Обеспечить рН другой подложке остается при рН 7,4 ± 0,05 и регулировать рН в случае необходимости с HCl или NaOH при необходимости. Во избежание превышения значения рН путем разумного добавлени кислоты или основания.
  4. Поверните решения на смеситель конец-по-конце при комнатной температуре (RT) в течение 5 часов.
  5. Осадок белка путем добавления четыре объемов метанола к подложке растворов в каждой конической трубе вихревые смешать хорошо, и инкубировать при 20 ° С в течение 16-18 ч.
  6. Образцы осадка центрифугированием при 13000 х г в течение 30 мин при 4 ° С. Тщательно слейте и отбросить супернатанты и позволяют метанола испаряться из гранул. Использование хлопка наконечником аппликатора, чтобы помочь в поглощении метанол прижалась к внутренней части трубки. Не позволяйте гранулы до более-DRу и как только метанол больше не видна, не переходите к следующему шагу.
  7. Ресуспендируйте белка гранулы в буфер преобразования. Использование количество буфера преобразования, равной сумме гомогената мозга исходного материала разливали в каждую пробирку на этапе 2.2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно, чтобы буфер преобразования используется для ресуспендируйте белка гранул и от рН 3,5 и 7,4, обработанных препаратами подложки является решение, определенное в пункте 1.2 выше (который содержит низкие уровни моющих средств и физиологический рН).
  8. Кратко соникатные решения подложке в cuphorn ультразвуком (10 сек при ~ 30% максимальной мощности), Алиготе в 0,5 - 1,0 мл объемов в маркированных 1,5 мл микропробирок. Выполните контроля качества иммуноблот (шаг 2,9) на аликвоты каждой подложки. Храните другие аликвоты при -80 ° С до готовности выполнять ССВ анализа (раздел 4).
  9. Осуществлять контроль качества на CER подложки пар перед применением (рисунок 2). Эти шаги гарантировать, что ССВ подложки будет Providе оптимальные результаты в исследованиях преобразования.
    1. Убедитесь, сравнимые количества PrP C в двух подложек. Сравнение уровней PrP в 10-25 мкл каждого субстрата с помощью SDS-PAGE и иммуноблоттинга 16 17. Если уровень белка в рН 7,4 и 3,5 субстраты в течение ~ 10% друг от друга, пары подложек являются подходящими для использования в ССВ исследований.
      ПРИМЕЧАНИЕ: PRP-иммуноблоты не должны показывать свидетельство обширной деградации PrP C. PrP иммунореактивности должны быть в основном> 20 кДа. Полосы меньше этой молекулярной массой может быть продукты распада. ОБЛИЦОВКИ модели должна быть примерно эквивалентны между парами подложки.
    2. Как PrP С в обоих субстратов должны быть чувствительны ПК, лечения 10-25 мкл каждого субстрата с ПК в конечной концентрации 100 мкг / мл и переварить образцов при 1000 оборотов в минуту при 37 ° С в течение 1 ч в термо-качалке. Оценить всю оставшуюся PrP сигнал на SDS-PAGE 16 и иммуноблоттингом 17.Подложки с PrP разрешении не подходят для использования в ССВ исследований.

3. Подготовить Семена TSE агента

  1. Получение TSE-инфицированных ткани мозга из видов интерес, и подготовить 10% (вес / объем) гомогената в 1X PBS, рН 7,4 с помощью методов, перечисленных в пункте 2.1 выше.
    Примечание: Семена могут быть также получены из других TSE-инфицированных тканей за пределами центральной нервной системы, однако, эффективность преобразования мозга происходит субстратов, полученных из семян TSE-инфицированных периферических тканях еще не было экспериментально оценивали в опубликованной литературе.
  2. Алиготе в результате гомогената (ы) в 100 - 300 мкл объемы в 0,5 мл микропробирок и хранить при температуре -80 ° С до готовности выполнять ССВ анализа.

4. CER Анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: CER анализ включает добавление относительно небольшого количества PrP TSE (представленной в «семени») от одного видав относительного избытка ПОТ C (представленной в неинфицированных мозга "подложки") от другого вида, который был частично денатурированных в любом рН 3,5 или 7,4. После продолжительного встряхивания инкубационного периода, на основе шаблонов превращение PrP C в PrP TSE в каждой реакции оценивают с помощью денситометрического сигнала разрешения PrP, остающийся после PK пищеварения и обнаружения иммуноблот. Сравнивая PrP в законную уровни в основаниях ранее денатурированные при рН 3,5 по сравнению с 7,4 представляет собой меру видового барьера. Экспериментальный обзор этой процедуры анализа обеспечивается на фиг.1.

  1. Медленно разморозить неинфицированные пары ССВ субстрата (анализ требует равные объемы подложек ранее денатурируют при рН 3,5 и 7,4, и), и TSE-инфицированных семенных решений, помещая их в верхней части слоя льда (примерно 1 час времени оттаивания).
  2. После того, как полностью разморозить, аспирация, а затем изгнать каждый раствор субстрата через27 г иглу шприца несколько раз, чтобы вновь гомогенизации его. Кратко разрушать ультразвуком каждый TSE-инфицированных семян решение в течение 10 сек при ~ 30% максимальной мощности. Держите все решения на льду во время подготовки реакций конверсии.
  3. Этикетка 5 индивидуальных низким связыванием, тонкостенные пробирки ПЦР в TSE агента проходит испытания.
  4. Подготовка преобразования реакции в этих трубках путем добавления 5 мкл 10% TSE-инфицированного посевного раствора с 95 мкл (а) ССВ подложки, полученных при рН 7,4 и (б) ССВ подложки, полученного при рН 3,5.
    1. Для каждого опытного образца, подготовки параллельных реакций в ССВ пар подложки ранее денатурированные на обоих рН 3,5 и 7,4.
    2. Оптимизация соотношения TSE агента семян неинфицированному подложки мозга через эмпирического определения. Общие семян: коэффициенты подложки, используемой поддерживать общий реакционный объем 100 мкл, и включают в себя 1:99 мкл, 2:98 мкл и 5:95 мкл. Для большинства приложений, семя 5:95 мкл: отношение объема субстрата подходит и то, что представлено в гоэто протокол.
  5. Подготовка три контрольные образцы в TSE агента проходит испытания следующим образом: () добавить 5 мкл 10% TSE-инфицированной решения семян до 95 мкл буфера преобразования в качестве контроля для входных PrP ВИЭ; добавить 5 мкл буфера преобразования до 95 мкл субстрата, подготовленного на (б) рН 3,5 и (С), рН 7,4 в качестве контролей для неспецифической, Номера для шаблонного преобразования.
  6. Кратко вихрь каждого образца в закрытом ПЦР-пробирку, чтобы смешать семена и субстрат хорошо. Последующие с кратковременного импульса в низкоскоростном Настольные мини-центрифуге, чтобы удалить любой объем реакционной смеси, захваченного в крышке трубки ПЦР.
  7. Образцы нагрузка в отдельности, меченных ПЦР пробирок в настольной шейкера оборудованной принять ПЦР пробирок. Взболтать образцов при 1000 оборотов в минуту при 37 ° С в течение 24 ч.
  8. После встряхивания, добавление саркозила до конечной концентрации 2% (вес / объем) и ПК до конечной концентрации 100 мкг / мл. Образцы Дайджест в 1000 оборотов в минуту при 37 ° С в течение 1 ч в термо-качалке.
    NПРИМЕЧАНИЕ: Добавление саркозила образцы пособий после преобразования в PK переваривания PrP C. Ложные положительные сигналы в раздающих образцов (Шаг 4,5) практически устраняется добавлением саркозила.
  9. Добавить SDS-PAGE образца буфера, образцы тепла до 95 ° С в течение 5 минут и устранить оставшиеся PrP РЭС в каждом образце путем SDS-PAGE с последующим 16 иммуноблоттинга 17.
    Примечание: после добавления буфера для образцов и нагрева, образцы могут быть немедленно обработана или образцы можно хранить при -20 ° С или -80 ° С до иммуноблоттинга. Все данные, представленные здесь, были получены с использованием геля и передачи системы Novex NuPAGE. Отдельные образцы из CER анализа были обработаны с буфером для образцов и восстановителя в соответствии с инструкциями изготовителя. Образцы затем нагревают при 95 ° С в течение 5 мин и 30 мкл каждого образца загружали в 12% Bis-Tris гели сборных.
  10. Рассчитайте коэффициент эффективности преобразования (ССВ) в качестве мерывидового барьера. Уровни мера PrP разрешении по денситометрии 17 и разделить общую плотность пробы pH 7,4 с тем, что рН 3,5 образца. Умножьте на 100, чтобы получить процент.
  11. Компиляция данных из независимых экспериментальных повторов для создания среднего ССВ ± стандартное отклонение для вида с заданной TSE агента.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Успешное использование ССВ анализа во многом зависит от качества пар используемого субстрата в реакциях конверсии. По этой причине, после процедур для подготовки ССВ пары подложек, контроль качества иммуноблот должны быть выполнены (рисунок 2). Для обоих субстратов, анализ 10-25 мкл иммуноблоттингом. PrP C должна быть легко обнаружить в каждой подложки и уровни PrP C должна быть примерно такой же между ними. Иммунореактивность будет в основном видна над 20 кДа, но меньше полосы мог...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Для успешного завершения этого протокола, внимание должно быть уделено уровнях PrP C в неинфицированных тканей мозга, используемого для подготовки поверхности (шаг 2.1.2) и семян в подложку соотношение для преобразования реакций (шаг 4.4.2). По нашему опыту, мозг может быть извлечен для использования в качестве ССВ подложке после значительного периода посмертного тех пор, как PrP C присутствует иммуноблоттингом (рисунок 4). В самом деле, некоторые автолиза наблюдалось в мозгах рыси...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Джона Олсена (Департамент природных ресурсов штата Висконсин), Тома Кули, Дэниела О'Брайена и Стива Шмитта (Департамент природных ресурсов штата Мичиган) и доктора Дэниела Уолша (Национальный центр здоровья дикой природы USGS) за помощь в приобретении тканей. Мы также благодарим Лабораторию гигиены штата Висконсин за услуги по диагностическому тестированию, а также доктора Тони Рокк и ее сотрудников (Национальный центр здоровья дикой природы USGS) за использование оборудования. Любое использование торговых наименований, названий продуктов или фирм носит исключительно описательный характер и не подразумевает одобрения со стороны правительства США.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
12% Bis-Tris SDS-PAGE гелиLife TechnologiesNP0342
0,5 мм Гранулы оксида цирконияNext AdvanceZROB05Другие разновидности гранул также являются эффективными
Антителаразличные поставщикиВыберите подходящие первичные и вторичные антитела для иммуноблоттинга обнаружения PrPres из интересующих видов
ГомогенизаторшариковДалее УсовершенствованнаяBBY24M
Beckman Coulter369434Высокая скорость с контролем температуры
Конические трубкилюбой марки
Аппликатор с ватным наконечникомUlineS-18991
Cuphorn sonicatorHeat Systems-UltrasonicsW-380Heat Systems-Ultrasonics, Inc. теперь Qsonica, LLC
Densitometry программное обеспечениеUVPVision Works LS Программное обеспечение для получения и анализа изображенийДругие программы, такие как NIH ImageJ, также будут работать
Dounce гомогенизаторKimble Chase885300
End-over-end mixerLabnetInternational H5600
Этилендиаминтетра уксусной кислотыBoston BioproductsP-770Опасное химическое вещество: раздражение глаз
Гуанидина гидрохлорид, 8 мThermo Fisher Scientific24115Опасное химическое вещество: острая токсичность, раздражение кожи, раздражение глаз
Нагревательный блокFisher Scientific11-718
Соляная кислотаSigma-Aldrich435570Опасное химическое вещество: сильная кислота
Буфер для проб додецилсульфата лития, 4xLife TechnologiesNP0008Опасные химические вещества: кожа и раздражение дыхательных путей, серьезное поражение глаз, легковоспламеняющийся твердый
метанолFisher ScientificA454-4Опасные химические вещества: острая токсичность, легковоспламеняющаяся жидкость
Микроцентрифуга пробиркилюбой марки
Мини-центрифугаLabnet InternationalC1301
N-лауроил-саркозин (саркозил)Sigma-Aldrich L-5125Опасные химические вещества: острая токсичность, раздражение кожи, повреждение глаз
Nonidet P-40AmrescoM158Опасные химические вещества: раздражение кожи, повреждение глаз
гелевая система SDS-PAGEСистемаэлектрофореза Life Technologies NuPAGEДругие системы SDS-PAGE также будут работать
ПЦР-пробирками (с низким связыванием)AxygenPCR-02-L-C
Пестик-гомогенизаторFisher Scientific03-392-106
pH-метрSentronSI600
Мембрана из поливинилдифторидаМиллипорыIPVH00010
протеиназа KPromegaV3021Опасные химические вещества: раздражение кожи и глаз, сенсибилизация дыхательных путей, снижение токсичности органов
для образцов SDS-PAGE, 10xLife TechnologiesNP0009
Хлорид натрияFisher Scientific7647-14-5
Дезоксихолат натрияSigma-Aldrich D6750Опасное химическое вещество: острая токсичность
Додецилсульфат натрияThermo Fisher Scientific28364Опасное химическое вещество: острая токсичность, раздражение кожи, повреждение глаз, легковоспламеняющееся твердое вещество
Гидроксид натрияSigma-AldrichS5881Опасное химическое вещество; прочное основание
ШприцBD BiosciencesразличныеИспользуйте размер шприца, соответствующий объемам гомогенизируемого субстрата
Иглы для шприцевBD Biosciencesразличные
термошейкеры (шейкер для ПЦР-трубок)Hangzhou All Sheng InstrumentsMS-100
Tris baseBio Basic77-86-1Опасные химические вещества: раздражение кожи, глаз, дыхательных путей
Triton X-100Integra Chemical CompanyT756.30.30Опасные химические вещества: острая токсичность, раздражение глаз
ВихревойFisher Scientific12-812
центрифуга аппарат

Ссылки

  1. Colby, D. W., Prions Prusiner, S. B. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a006833(2011).
  2. Hill, A. F., Collinge, J. Prion strains and species barriers. Contrib Microbiol. 11, 33-49 (2004).
  3. Scott, M., et al. Transgenic mice expressing hamster prion protein produce species-specific scrapie infectivity and amyloid plaques. Cell. 59 (5), 847-857 (1989).
  4. Prusiner, S. B., et al. Transgenetic Studies Implicate Interactions between Homologous Prp Isoforms in Scrapie Prion Replication. Cell. 63, 673-686 (1990).
  5. Telling, G. C., et al. Prion Propagation in Mice Expressing Human and Chimeric Prp Transgenes Implicates the Interaction of Cellular Prp with Another Protein. Cell. 83, 79-90 (1995).
  6. Hill, A. F., et al. The same prion strain causes vCJD and BSE. Nature. 389 (6650), 448-450 (1997).
  7. Torres, J. M., et al. Elements modulating the prion species barrier and its passage consequences. PLoS One. 9 (3), e89722(2014).
  8. Groschup, M. H., Buschmann, A. Rodent models for prion diseases. Vet Res. 39 (4), 32(2008).
  9. Korth, C., et al. Abbreviated incubation times for human prions in mice expressing a chimeric mouse-human prion protein transgene. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (8), 4784-4789 (2003).
  10. Kocisko, D. A., et al. Species specificity in the cell-free conversion of prion protein to protease-resistant forms: a model for the scrapie species barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3923-3927 (1995).
  11. Raymond, G. J., et al. Evidence of a molecular barrier limiting susceptibility of humans, cattle and sheep to chronic wasting disease. EMBO J. 19 (7), 4425-4430 (2000).
  12. Fernandez-Borges, N., de Castro, J., Castilla, J. In vitro studies of the transmission barrier. Prion. 3 (4), 220-223 (2009).
  13. Zou, W. Q., Cashman, N. R. Acidic pH and detergents enhance in vitro conversion of human brain PrPC to a PrPSc-like form. J Biol Chem. 277 (46), 43942-43947 (2002).
  14. Li, L., Coulthart, M. B., Balachandran, A., Chakrabartty, A., Cashman, N. R. Species barriers for chronic wasting disease by in vitro conversion of prion protein. Biochem Biophys Res Commun. 364 (4), 796-800 (2007).
  15. Morawski, A. R., Carlson, C. M., Chang, H., Johnson, C. J. In vitro prion protein conversion suggests risk of bighorn sheep (Ovis canadensis) to transmissible spongiform encephalopathies. BMC Vet Res. 9, 157(2013).
  16. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2014).
  17. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2014).
  18. Chandler, R. L. Encephalopathy in mice produced by inoculation with scrapie brain material. Lancet. 1 (7191), 1378-1379 (1961).
  19. Browning, S. R., et al. Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP. J Virol. 78 (23), 13345-13350 (2004).
  20. Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. Experimental infection of sheep and goats with transmissible mink encephalopathy virus. Can J Vet Res. 51 (1), 135-144 (1987).
  21. Rubenstein, R., et al. Immune surveillance and antigen conformation determines humoral immune response to the prion protein immunogen. J Neurovirol. 5 (4), 401-413 (1999).
  22. Castilla, J., et al. Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions. Cell. 134 (5), 757-768 (2008).
  23. Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med. 27, 95-125 (2006).
  24. Atarashi, R., Sano, K., Satoh, K., Nishida, N. Real-time quaking-induced conversion: a highly sensitive assay for prion detection. Prion. 5 (3), 150-153 (2011).
  25. Ladner-Keay, C. L., Griffith, B. J., Wishart, D. S. Shaking Alone Induces De Novo Conversion of Recombinant Prion Proteins to beta-Sheet Rich Oligomers and Fibrils. PLoS One. 9 (6), e98753(2014).
  26. Mathiason, C. K., et al. Susceptibility of domestic cats to chronic wasting disease. J Virol. 87 (4), 1947-1956 (2013).
  27. Seelig, D. M., et al. Lesion Profiling and Subcellular Prion Localization of Cervid Chronic Wasting Disease in Domestic Cats. Vet Pathol. , (2014).
  28. Stewart, P., et al. Genetic predictions of prion disease susceptibility in carnivore species based on variability of the prion gene coding region. PLoS One. 7 (12), e50623(2012).
  29. Russell, W. M., Burch, R. I. The Principles of Humane Experimental Technique. Metheun. , Methuen. (1959).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Оценка межвидового барьераанализ in vitroкоэффициент эффективности конверсииустойчивость к протеиназе Киммуноблоттинг с использованием SDS-ПАГЭгомогенат ткани мозгаинкубация агента ТСЭденатурация PrP Cпротокол анализа CER
Оценка Трансмиссивные губчатой ​​энцефалопатии видов барьеров с
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.