Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Экс Utero электропорации и Органотипической фрагмент Культура мыши ткани гиппокампа

9.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52550

⸱

4 марта 2015 г.

 ,  , 
1Institute of Molecular and Cellular Anatomy, University of Ulm

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол, предоставляющий инструмент для изучения регуляторных механизмов конкретных генов во время развития гиппокампа. Использование внутриутробной электропорации и органотипической культуры срезов позволяет повышать и понижать экспрессию генов, представляющих интерес в отдельных клетках, и следить за их судьбой во время развития.

Аннотация

Мышиная генетика предлагает мощный инструмент, определяющий роль конкретных генов во время развития. Анализ полученных фенотипов иммуногистохимическими и молекулярными методами позволяет получить информацию о потенциальных генах-мишенях и сигнальных путях. Для дальнейшего выяснения конкретных регуляторных механизмов требуется система, позволяющая манипулировать лишь небольшим числом клеток конкретной ткани путем либо сверхэкспрессии, абляции, либо повторного введения определенных генов и следить за их судьбой в процессе развития. Для достижения этого ex utero электропорация структур гиппокампа, особенно зубчатой извилины, с последующим органотипическим культивированием срезов обеспечивает такой инструмент. Использование этой системы для генерации мозаичных делеций позволяет определить, регулирует ли интересующий ген процессы автономного развития клетки, такие как пролиферация клеток-предшественников или дифференцировка нейронов. Кроме того, он облегчает спасение фенотипов путем повторного введения удаленного гена или его генов-мишеней. В отличие от внутриутробной электропорации, внутриутробный подход улучшает скорость успешного нацеливания на более глубокие слои мозга, такие как зубчатая извилина. В целом, внутриутробная электропорация и органотипическая культура срезов являются мощным инструментом для изучения регуляторных механизмов в полуестественной среде, отражающей эндогенные условия.

Введение

Гиппокамп играет важную роль в памяти и обучения, а также эмоциональное поведение. Один основная функция состоит в консолидации кратковременной памяти в долговременную память, которая требует высокой пластичности нервной системы. Зубчатая извилина гиппокампа выступает в качестве основного шлюза для ввода информации, а также один из двух областей мозга с постоянной нейрогенеза в течение взрослой жизни 1,2. Развитие гиппокампа структуры происходит во время позднего эмбриогенеза и особенно в течение первого 3 до 4 недель послеродового 3. Во время раннего развития зубчатой ​​извилине пул стволовых клеток, учрежденного требуется для послеродового а также нейрогенез 4. Развивающиеся нейроны пройти через различные этапы, из стволовой клетки через несколько этапов клеток-предшественников в незрелые и, наконец, зрелого нейрона во время послеродового а также нейрогенез. На разных этапах нейрогенеза экспрессияспецифические гены требуется, чтобы созревание и интеграции новых нейронов в гиппокампе схемы 5,6.

Использование генетику мыши и анализ фенотипа с помощью иммуногистохимии, а также молекулярные методы позволили определить характер экспрессии и функции многих из этих генов. В дополнение анализа микрочипов, а также иммунопреципитации хроматина (чип) представил информацию о потенциальных прямых и косвенных генов-мишеней 7,8. Тем не менее, есть еще много открытых вопросов, касающихся механизмов регуляции гиппокампа развития, в частности развития зубчатой ​​извилины. Чтобы получить более глубокое представление, как специфические гены регулируются систему требуется позволяя манипулировать небольшим количеством клеток ВНИЗ или повышающей регуляции гена интереса и / или его генов-мишеней и следить за их судьбу во время разработки. Внутриутробное электропорации из shRNAs, кДНК генов интересов или Cre рекомбинацииSE обеспечивает такой инструмент. В целях обеспечения присутствия плазмиды экспрессии нужной ДНК или малых РНК должны использоваться для электропорации. Этот подход очень успешно применяется в изучении развития коры 9,10, но более сложные подходы, изучения развития зубчатой ​​извилине из-за позиции гиппокампа структур в более глубоких слоях мозга.

Экс маточно электропорации с последующим органотипической культуры среза, является одним из подходов, чтобы обойти эту проблему 11,12. В отличие от внутриутробного электропорации не весь эмбриона, но только головка используется позволяя таким образом, чтобы поместить электроды в более выгодном образом, чтобы направить shRNA / ДНК в сторону гиппокампа и зубчатой ​​извилины. Наша группа успешно применяются экс внутриутробно электропорации для изучения роли фактора транскрипции Bcl11b во зубчатой ​​развития извилины 8. Bcl11b имеет двойную роль в зубчатой ​​извилине развития на гegulating пролиферацию клеток-предшественников, а также дифференцировку как было показано с помощью иммуногистохимии. Для дальнейшего определения механизма участия Bcl11b в этих процессах, протоколы группы Polleux 11,12 доводили до изучения зубчатой ​​извилине, как описано ниже в разделе протокола. В первом приближении вопрос был рассмотрен Bcl11b регулирует ли нейронов дифференциации клеток клеточно автономно. Второй подход рассматривается ли Desmoplakin, непосредственным объектом ген Bcl11b, достаточно, чтобы спасти фенотип Bcl11b.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с немецким законом и были одобрены правительственных учреждений в Тюбингене.

1. Подготовка Дозаторы, растворов и мембран

  1. Подготовка микропипеток
    1. Потяните стеклянной микропипетки с помощью микропипетки съемник со следующей программой: Жара: 540, Pull: 125, Скорость: 20 и задержку: 140. Длина иглы суммы на 5,5 см.
    2. Конические иглы с использованием microgrinder, чтобы получить соответствующий размер наконечника 4 мм. Храните иголки в коробку или 15 см чашку Петри, чтобы предотвратить повреждение кончиков.
  2. Приготовление растворов
    1. ДНК плазмиды решение
      1. Подготовка плазмидной ДНК, содержащей нужную кДНК конструкцию, используя бесплатный Maxi-Prep Kit эндотоксина в соответствии с протоколом производителя.
      2. Регулировка раствора плазмиды ДНК в конечной концентрации 3 мкг / мкл (без GFP шип вектор) или 4 мкг /мкл (1 мкг GFP шип вектор) в эндотоксинов Трис-буфер, содержащий ЭДТА Fast Green (конечная концентрация 0,05%).
    2. Ламинин Stock решение
      1. Растворите 1 мг ламинина в стерильной воде до конечного объема 1 мл. Подготовьте 100 мкл аликвоты и хранят при температуре -80 ° С.
    3. Поли-L-лизин Исходный раствор
      1. Растворите 50 мг поли-L-лизина в 50 мл стерильной воды до конечной концентрации 1 мг / мл. Подготовка 1 мл аликвоты и хранить в -20 ° C.
    4. Заполните сбалансированный солевой раствор Хэнка (полный HBSS)
      1. Подготовьте полный HBSS путем объединения 100 мл 10x HBSS, 2,5 мл 1 М HEPES-буфера (рН 7,4), 30 мл 1 М D-глюкозы, 10 мл 100 мМ CaCl 2, 10 мл 100 мМ MgSO 4, и четыре мл 1 M NaHCO 3. Добавить стерильной водой до 1 л и хранят при температуре 4 ° С.
        Примечание: все решения Автоклав ожидать 1 М HEPES-буфера и 1 М D-глюкоза, которые являются филтер стерилизации.
    5. Кусочек культуральной среде
      1. Подготовка ломтик культуральную среду путем добавления 35 мл базальной среды Eagle, 12,9 мл полной HBSS (1.2.4), 1,35 мл 1 М D-глюкозы, 250 мкл 200 мМ L-глутамина и 500 мкл пенициллина-стрептомицина, чтобы получения конечного объема 50 мл. Добавить лошадиной сыворотки до конечной концентрации 5% и хранят при температуре 4 ° С.
    6. Low-Точка плавления (LMP) Агароза
      1. Подготовка 4% раствора агарозы LMP добавлением 2 г LMP агарозы с 50 мл полного HBSS (1.2.4) с последующим нагреванием в микроволновой печи в течение 1-2 мин при высокой мощности. Хранить этот раствор в водяной бане при 37 - 39 ° С. Хранить раствор при температуре 4 ° С и повторного использования.
    7. Параформальдегид Решение
      1. В вытяжном шкафу подготовить 4% параформальдегида (PFA) раствор добавлением 4 г параформальдегида в 100 мл 1х PBS. Раствор нагревают до 60 ° С и добавить несколько капель 1 н NaOH, пока раствор станет CЛир.
    8. Пермеабилизирующего Решение
      1. Растворите 9 г BSA в 300 мл 1х PBS, содержащим 0,3% Trition Х-100 и хранят при температуре 4 ° С. Добавить 10% азида натрия для длительного хранения.
  3. Покрытие мембранных вставками
    1. Развести одну аликвоту исходного раствора ламинин (1.2.2) и одну аликвоту поли-L-лизин раствора (1.2.3) в стерильной воде до конечного объема 12 мл.
    2. Поместите мембранные вставки в 6-луночные планшеты с каждой лунке, содержащей 2 мл стерильной воды. Добавить 1 мл раствора для нанесения покрытия на верхней части мембраны и инкубируют O / N при 37 ° С в 5% СО 2 инкубаторе.
    3. После инкубации промыть мембраны вставляет три раза 1 мл стерильной воды и высушить. Используйте покрытием мембранные вставки на тот же день или магазин при 4 ° С на срок до четырех недель в сухом 6-луночного планшета.

2. Инъекции ДНК и Электропорация E15.5 и E18.5 эмбрионов

  1. Обезболить время повязана у самок мышей, поместив его в обезболивающим камере, насыщенной 5% ИФ и подключенного в испаритель. Циркуляцию изофлуран и кислород со скоростью 1 л / мин. Держите животное в коробке в течение 2-4 мин или до потери сознания, которое испытывает ущемление между лапами мыши.
  2. Эвтаназии бессознательное мышь, шейки дислокации на день эмбрионального развития (E) 15,5 или 18,5. Проанализируйте матку, содержащий эмбрионов 13 и поместить его в чашку Петри, содержащую 15-20 мл холодной полного HBSS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента, держите эмбрионов и тканей на льду.
  3. Используйте ножницы, чтобы отделить каждый эмбрион от рога матки и место во второй чашке Петри с холодными полный HBSS.
  4. Под микроскопом рассекает, разорвать стенку матки мышечной и плаценты с помощью пинцета (# 55) и ножницы. Осторожно освободите эмбриона, из желточного мешка.
  5. Используйте пару Бонн ножницами, чтобы decapitatе эмбрионы чуть выше передних под углом 60 °. Если эксперимент требует генотипирование эмбрионов, собрать образец ткани для изоляции геномной ДНК (небольшой кусочек хвоста).
  6. Передача голову чистой и сухой чашке Петри. Потому что голова была обезглавлена ​​в угол 60 °, голова должна наклоняться в одну сторону при размещении спинной стороной вверх.
  7. Поместите иглу тщательно в середине полушарии, близкой к темени (рис 1а, б). Вводят приблизительно 2-3 мкл (на 3 или 4 мкг / мкл) раствора ДНК, наступив на педали в picospritzer III с использованием 30 фунтов давления на протяжении 10-15 мс на импульс, применяя 5-8 импульсов. Продолжительность и количество импульсов зависит от диаметра отверстия иглы с небольших отверстий, требующих больше времени. Интервал между каждым импульсом составляет 1 сек.
  8. Перед размещением электродов, применять несколько капель полного HBSS на голове EMBRлет. Поместите электроды таким образом, что "отрицательное" терминал находится на той же стороне, что и введенного желудочка и "положительного" электрода на противоположной стороне впрыскиваемого желудочка ниже уха головы эмбриона (фиг 1С, D). Применить 5 импульсов 50 В.
    1. Используйте 3 мм электроды для E 15,5 и 5 мм Электроды Е 18.5.

3. Вскрытие мозга

  1. После электропорации, снимите кожу от головы с помощью пинцета. Используя пару пружинных ножниц сделать небольшой разрез в середине мозжечка на средней линии черепа.
  2. Вставьте пружинные ножницы в разрез и вырезать в продольном направлении вдоль стреловидного шва. Лупиться череп и отсоедините мозг от черепа с помощью тонких щипцов. Перевести весь мозг в 15-20 мл холодной полного решения HBSS.
  3. Между тем, влить 4% LMP агарозы,выдерживали при 37-39 ° С на водяной бане, в отслаиванию вдали формы.
  4. Возьмите мозг из полного HBSS небольшой совок шпателем и слейте избыток ССРХ с помощью тонкой папиросной бумаги или Kimwipes.
  5. Поместите весь мозг мягко в агарозы и отрегулируйте ее положение с помощью тонкой иглы. Держать форму на льду до тех пор, пока агарозном затвердевает и блок срезы (для корональных секций обонятельные луковицы указывают вверх).

4. Vibratome секционирования и нарезать Культура

  1. Обрезать агарозном блоки LMP и приклейте их к сцене образца с использованием «супер клей". После клей высохнет передачи стадии образца в буферном лоток vibratome и залить охлажденным льдом HBSS до завершения блок не погружен в раствор.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стерилизовать все инструменты и оборудование поверхностей с 70% этанола до секционирования.
  2. Подготовка 250 мкм разделы vibratome использованием нового диска, как следует.
    1. Обрезать блок Wiго следующих условиях; Частота - 60 Гц, амплитуда - 0,7 мкм, скорость 16-18 мм / сек. Вырезать разделы, содержащие нужную ткань с вышеуказанными настройками на замедленной скорости (9 мм / сек). Запуск срезов от заднего мозга, собирать 5-7 части из головного мозга.
    2. Передача участков с чистой культуральной чашке 6 а, содержащего 5 мл охлажденного льдом HBSS завершить с помощью изогнутого шпателя и держать на льду, пока все секции собраны (фиг 1E).
  3. Смочите мембраны в поперечном моды с 100 мкл полной ССРХ до размещения секций на мембране, чтобы облегчить ориентацию разделах.
  4. Передача участков с помощью изогнутого шпателя на мембране (подобрать угол разделе пинцетом и вытащить на шпателем, а затем использовать пинцет, чтобы нажать на раздел на мембране). Поместите до пяти разделов на одной мембраны и организовать с помощью щипцов (рис 1F). Не перекрывать секции друг с другом.
    1. Возьмите избыток ССРХ от мембраны использованием пипетки. Конкретные Мембраны, используемые здесь, прикреплены к раме и вставляется в планшет для тканевых культур, что позволяет ткани, чтобы быть в контакте, но не покрыт продуктом.
  5. Поместите мембранные вставки в 6-луночный планшет, содержащий 1,8 мл культуральной среды срез (1.2.5) (рис 1G, H). Инкубируют культуры блюдо при 37 ° С с 5% СО 2 в течение 11 DIV или 14 DIV. Изменить половину среды (0,9 мл) каждый второй день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе, добавляйте реагенты, как бромдезоксиуридин (ВДУ; 10 мкМ конечная концентрация) для маркировки пролиферирующих клеток в средствах массовой информации в течение первых 20 ч от времени культивирования.

5. Фиксация секций Вслед за иммунофлюоресцентного окрашивания

  1. Используйте чистую и резкое лезвие скальпеля вырезать и обрезать мембраны в зависимости от ориентацииразделы.
  2. Передача участков вместе с мембраной в 24-луночный планшет, содержащий 1 мл 4% PFA (1.2.7). Инкубируйте разделы в течение 1 ч при комнатной температуре с последующим промыванием 3 1x PBS в течение 15 мин каждый. Инкубируйте секций O / N с пермеабилизации растворе при 4 ° С при осторожном перемешивании.
  3. На следующий день, инкубировать секций с соответствующими первичными антителами, разводили в пермеабилизации раствора, O / N или в течение 48 ч при 4 ° С при осторожном перемешивании.
  4. Вымойте разделах 3 раза в течение 15 мин с 1x PBS и инкубировать O / N при 4 ° С с соответствующими вторичными антителами разводят в пермеабилизации решения.
  5. После инкубации с вторичными антителами, мыть секций один раз 1x PBS в течение 15 мин с последующим окрашиванием DAPI в течение 10 мин.
  6. Вымойте разделах 3 раза 1x PBS в течение 15 минут каждый и трансфер в микроскоп слайды. Добавить ImmunoMount и осторожно поместить покровное в верхней части секций. Высушите слайды O / N при 4 ° С и селенааль лаком для ногтей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите слайды всегда при 4 ° С.
    1. Проанализируйте срез культуры от конфокальной микроскопии (рис 1I).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Удаление фактора транскрипции Bcl11b вызывает ухудшение пролиферации клеток-предшественников и нейрональной дифференцировки приводит к снижению зубчатой ​​извилины размера и количества клеток. Кроме того мутантные нейроны не интегрироваться в гиппокампе схемы, вызывая обучения и ухудшение памяти 8. Чтобы ответить на вопросы, касающиеся механизма регулирования (ов) Bcl11b в этих процессах экс внутриутробно электропорации был использован.

Обращаясь вопрос о том, Bcl11b клет...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Гиппокамп играет важную роль в процессах обучения и памяти. Зубчатая извилина также является одним из двух областей мозга, где нейрогенез происходит не только во время разработки, но и во всей взрослой жизни. Послеродовая и взрослых гиппокампа нейрогенеза происходит в аналогичным образом с участием многих общих факторов. Определение механизмов регуляции этих факторов будет очень полезна для понимания нейродегенеративных заболеваний, которые в свою очередь приведет к новым методам лечения и профилактических мер. Для полу...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами от Deutsche Forschungsgemeinschaft для SB (BR-2215; SFB 497/A9).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Пылающий/коричневый пуллер микропипетокSutter Instruments Company (США)P-97
Тонкие стеклянные пипеткиWarner InstrumentsG100F-4
Микрошлифовальный аппаратНаришиге, ЯпонияEG-44
Блок анестезирующего кронштейнаГарвардский аппаратPY2 34-0412
Испаритель HalovetГарвардский аппаратPY2 34-0398
Система FluovacГарвардский аппаратPY2 34-0387
IMS FluosorberГарвардский аппаратPY2 34-0415
Анестезирующая камераГарвардский аппаратPY2 34-0460
ЭлектропораторBEX КомпанияCUY21 EDIT
Пинцет с дисковыми электродамиBEX Компания LF650P33 мм электроды для E15.5
Пинцет с дисковыми электродамиBEX CompanyLF650P55 мм электроды для E18.5
Picospritzer IIIParker Hannifin CorporationP/N 052-0500-900
HM 650 V Вибрационное лезвие Микротом, 230 ВThermo Scientific920120
Диссекционный микроскопCarl Zeiss Микроскопия GmbhStemi SV8
Инвертированный микроскопLeicaLeica DM IL LED
Конфокальный микроскопLeicaSp5II
6-луночная чашкаBD Falcon#353502
6-луночная чашкаCELLSTAR#657160
Вставки для культуры тканейBD Falcon#353090
Fast GreenSigmaF7252
LamininSigma
Поли-L-лизинSigma#P5899
Пружинные ножницыFine Science Tools15003-08
Extra Fine BonnKnifes Fine Science Tools14084-08
ЩипцыDumont #5511255-20 Inox
HBSS 10xLife Technology14180-046
BMELife Technology41010-26
#L2020

Ссылки

  1. Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).
  2. Frotscher, M., Zhao, S., Forster, E. Development of cell and fiber layers in the dentate gyrus. Prog Brain Res. 163, 133-142 (2007).
  3. Muramatsu, R., Ikegaya, Y., Matsuki, N., Koyama, R. Neonatally born granule cells numerically dominate adult mice dentate gyrus. Neuroscience. 148, 593-598 (2007).
  4. Li, G., Pleasure, S. J. Morphogenesis of the dentate gyrus: what we are learning from mouse mutants. Dev Neurosci. 27, 93-99 (2005).
  5. Hsieh, J. Orchestrating transcriptional control of adult neurogenesis. Genes Dev. 26, 1010-1021 (2012).
  6. Li, G., Pleasure, S. J. Genetic regulation of dentate gyrus morphogenesis. Prog Brain Res. 163, 143-152 (2007).
  7. Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).
  8. Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. Embo J. 31, 2922-2936 (2012).
  9. Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex. J Vis Exp. (88), (2014).
  10. Pacary, E., et al. Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation. J Vis Exp. (65), (2012).
  11. Hand, R., et al. Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex. Neuron. 48, 45-62 (2005).
  12. Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development. Sci STKE. (136), 19(2002).
  13. Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. J Vis Exp. (2), (2007).
  14. Sugiyama, T., Osumi, N., Katsuyama, Y. The germinal matrices in the developing dentate gyrus are composed of neuronal progenitors at distinct differentiation stages. Dev Dyn. 242, 1442-1453 (2013).
  15. Lechler, T., Fuchs, E. Desmoplakin: an unexpected regulator of microtubule organization in the epidermis. J Cell Biol. 176, 147-154 (2007).
  16. Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development. J Vis Exp. (74), (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Таргетинг зубчатой извилиныконфокальная микроскопияиммунофлуоресцентное окрашиваниесрезы на вибратомезаливка в агарозусредовая смесь для культуры срезовпервичные антитела
Экс Utero электропорации и Органотипической фрагмент Культура мыши ткани гиппокампа
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.