Методическая статья

Busulfan как Myelosuppressive агента по приносящей стабильные высокого уровня костного мозга химеризм у мышей

13.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52553

⸱

1 апреля 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Physiology and Kinesiology, Simon Fraser University, 2The Biomedical Research Centre, University of British Columbia, 3Division of Neurology, Department of Medicine, Neuromuscular Disease Unit, VHHSC

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем протокол, в соответствии с которым кондиционирование бусульфаном позволяет заменить костный мозг мыши-реципиента клетками костного мозга мышей-доноров, повсеместно экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок, в отсутствие облучения. Эта методика полезна для изучения накопления клеток костного мозга в центральной нервной системе.

Аннотация

Трансплантация костного мозга (ТКМ) часто используется для замены компартмента костного мозга (КМ) мышей-реципиентов клетками КМ, экспрессирующими отдельный биомаркер, выделенный от донорских мышей. Этот метод позволяет идентифицировать донорские гемопоэтические клетки у мышей-реципиентов и может быть использован для выделения и характеристики донорских клеток с использованием различных биохимических методов. ТКМ обычно опирается на миелоаблативное кондиционирование с облучением всего тела для создания нишевого пространства в КМ компартмента мышей-реципиентов для приживления донорских клеток. В протоколе, который мы описываем здесь, используется миелосупрессивное кондиционирование химиотерапевтическим агентом бусульфаном. В отличие от облучения, которое требует использования специализированных средств, кондиционирование бусульфана проводится с помощью внутрибрюшинных инъекций 20 мг/кг бусульфана до введения общей дозы 60-100 мг/кг. Кроме того, миелоаблативное облучение может иметь токсические побочные эффекты и требует успешного приживления донорских клеток для выживания мышей-реципиентов. Напротив, кондиционирование бусульфаном с использованием этих доз, как правило, хорошо переносится, и мыши выживают без поддержки донорских клеток. Донорские клетки КМ выделяют из бедренных и большеберцовых костей мышей, повсеместно экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок (GFP), и вводят в боковую хвостовую вену кондиционированных мышей-реципиентов. Химеризм КМ оценивается путем количественной оценки количества клеток GFP+ в периферической крови после ТКМ. Уровни химеризма >80% обычно наблюдаются в периферической крови через 3-4 недели после трансплантации и остаются стабильными в течение как минимум 1 года. Как и в случае с облучением, кондиционирование с помощью бусульфана и ТКМ позволяет накапливать донорские клетки, полученные из БМ, в центральной нервной системе (ЦНС), особенно в мышиных моделях нейродегенерации. Это опосредованное бусульфаном накопление ЦНС может быть более физиологично, чем общее облучение организма, поскольку лечение бусульфаном менее токсично, а воспаление ЦНС, по-видимому, менее обширно. Мы предполагаем, что эти клетки могут быть генетически модифицированы для доставки терапевтических препаратов в ЦНС.

Введение

В последнее время наблюдается значительный интерес к роли микроглии и клеток, полученных из костного мозга (БМ) (БМДК) в центральной нервной системе (ЦНС), как во время болезни, так и при нормальном старении. В настоящее время известно, что микроглии, резидентные иммунные клетки ЦНС, развиваются в ЦНС после проникновения примитивных миелоидных предшественников во время эмбриогенеза. Микроглия сохраняет аспекты своей миеломоноцитарной линии и во взрослой жизни. Несмотря на то, что данные свидетельствуют о том, что вклад МПК в пул микроглии минимален у здоровых взрослых животных1, роль МПК в прогрессировании различных нейродегенеративных заболеваний остается неясной. Эта неопределенность усугубляется тем фактом, что трудно отличить МПК, которые накапливаются в ЦНС, от эндогенной резидентной микроглии, поскольку не было выявлено общепринятого дискриминирующего иммуногистохимического маркера. Для мониторинга МПК in vivo мы используем протокол трансплантации КМ (ТКМ), в соответствии с которым эндогенные клетки КМ мыши-реципиента заменяются клетками донорской мыши, повсеместно экспрессирующей зеленый флуоресцентный белок (GFP) под контролем промотора β-актина. Этот протокол позволяет определить как локализацию, так и морфологию GFP+ BMDC у мыши-реципиента с помощью иммуногистохимии, а также способствует дальнейшей характеристике этих клеток с помощью флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (FACS) с последующим последующим биохимическим анализом.

Для успешной ТКМ клетки КМ реципиента должны быть абляированы (так называемая миелоабляция), чтобы создать пространство ниши внутри КМ реципиента, позволяющее приживить донорские клетки. Часто миелоабляция достигается с помощью гамма-облучения всего тела, которое вызывает двухцепочечные разрывы в ДНК, что приводит к гибели клеток, особенно в активно делящихся клетках, таких как гемопоэтические клетки-предшественники2,3. Протоколы облучения проводятся для того, чтобы вызвать достаточную гибель клеток КМ, чтобы привести к летальности животного, если животное-реципиент не достигает адекватного приживления донорских клеток от ТКМ (так называемое «летальное облучение»). Однако для облучения требуется специализированная установка и оборудование, а также ветеринарные и животноводческие ресурсы, недоступные исследователям во всех учреждениях. Кроме того, миелоаблативное облучение может вызвать потенциально смертельное повреждение других тканей, а из-за иммуносуппрезии облученные животные более восприимчивы к вторичныминфекциям. Таким образом, были разработаны схемы кондиционирования с пониженной интенсивностью (так называемые «протоколы RIC»), которые предназначены для минимизации потенциально токсичных побочных эффектов протокола кондиционирования у пациентов, особенно для использования в группах риска, таких как детии пожилые люди.

Некоторые протоколы RIC полагаются на химиотерапию, такую как бусульфан, для кондиционирования отсека BM. Бусульфан является бифункциональным алкилирующим агентом ДНК, часто используемым в клинической практике в качествеальтернативы облучению. Примечательно, что бусульфан можно безопасно вводить мышам путем внутрибрюшинной инъекции (IP) и он не требует специализированных помещений и оборудования, необходимых для облучения мышей. Кондиционирование бусульфаном широко использовалось в нашей лаборатории7, а также в нескольких других недавних публикациях8–11. При использовании доз 60-100 мг/кг в периферической крови и КМ 7 могут устанавливаться высокие степени стабильного химеризма (>80% GFP+клеток). Важно отметить, что при таких дозах миелоабляция не является полной, и поэтому мыши способны выживать без получения поддерживающих клеток КМ (K. Peake, J. Manning, C. Lewis, and C. Krieger, неопубликованные наблюдения). Кроме того, при миелосупрессивном кондиционировании бусульфаном происходит быстрое восстановление миеломоноцитарных клеток периферической крови донорскими клетками. Тем не менее, замещение лимфоцитов периферической крови донорскими клетками происходит медленнее, что подчеркивает отсутствие иммуносупрессии, которая возникает при дозах бусульфана 60-100 мг/кг по сравнению собщим облучением организма.

Мы успешно использовали химеризм, индуцированный бусульфаном, для исследования BMDC у мышей дикого типа, а также на мышиных моделях нейродегенеративных расстройств бокового амиотрофического склероза (БАС)7 и болезни Альцгеймера. Было замечено, что при определенных условиях значительное количество GFP+ BMDC накапливается в пределах ЦНС7,12. Важно отметить, что, как и миелоаблативное кондиционирование с облучением, бусульфановое кондиционирование с последующей ТКМ достаточно для того, чтобы обеспечить накопление GFP+ BMDC в ЦНС как у мышей дикого типа, так и у мышей с неврологическими расстройствами7–11. В качестве основного препятствия в лечении нейродегенеративных расстройств является способность доставлять терапевтические молекулы из кровотока в ЦНС, где они могут оказывать благотворное воздействие, что повышает вероятность того, что BMDC могут быть сконструированы для экспрессии терапевтических молекул и впоследствии использованы в качестве средства доставки терапевтических средств в ЦНС реципиентов с бусульфаном. Механизм, который мы активно изучаем. Несмотря на то, что мы обнаружили, что миелоаблативное кондиционирование с облучением приводит к большему накоплению GFP+ BMDC в ЦНС по сравнению с бусульфаном7, облучение может иметь значительную токсичность у пациентов с нейродегенеративными расстройствами и в мышиных моделях заболевания ЦНС.

Хотя мы, и многие другие, использовали модели ТКМ для изучения БМДК при нейродегенеративных расстройствах, возможность в значительной степени заменить БМ-компартмент мыши-реципиента четко идентифицируемой популяцией БМ-клеток является бесценным инструментом для изучения различных аспектов кроветворной системы. Это включает в себя широкий спектр исследовательских тем, таких как развитие гемопоэтической линии, лейкемия, трансплантация органов, реакция «трансплантат против хозяина» и иммунобиология.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Этика себе: Этот протокол был рассмотрен и одобрен Care комитета животное Университета Саймона Фрейзера в силу (ОАК; разрешить числа 1037K-12 и 1060K-03) и в соответствии с Канадским советом по Уходу за животными, Руководство NIH для Уход и использование лабораторных животных, и Директива EEC Совета.

1. Специальные Соображения

ПРИМЕЧАНИЕ: Busulfan цитотоксичен. Аккуратное использование и утилизация в соответствии с паспорте безопасности и институциональных принципов.

  1. Выполните все методы в асептических условиях в ламинарном боксе.
  2. Стерилизацию инструментов перед использованием упаковки в соответствующем упаковочном материале, например, на отрыв пакета, и в автоклаве.
  3. В то время как риск инфицирования ниже бусульфаном кондиционирования сравнению с облучением, ручка животных только в ламинарном боксе в течение первых 2 недель после трансплантации.

2. КондиционированиеПолучатель Мыши

  1. Развести Бусульфан до 3 мг / мл стерильного забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы сделать новый разбавление бусульфан непосредственно перед использованием каждый день инъекции.
  2. Администрирование 20 мг / кг, разбавленного бусульфан в мышей-реципиентов с помощью инъекции IP ежедневно.
  3. Повторите ежедневные инъекции IP 20 мг / кг бусульфана до общей дозы 60-100 мг / кг был доставлен (то есть, для 80 мг / кг общей дозы, администрирование 20 мг / кг бусульфана в течение 4 последовательных дней).

3. Выделение доноров клеток костного мозга

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был успешно использован для выделения и подготовки ВМ-клетки из до 5 доноров мышей. Обычно выход клеток на мышь составляет около 30-40 млн BMDCs, что достаточно, чтобы пересадить 12-16 мышей-реципиентов. Если больше доноров мышей необходимы протокол, возможно, придется быть соответствующим образом скорректированы.

  1. После последнего дня бусульфан кондиционирования euthanize в GFP мыши-донора, (5:59 месяцев) с помощью CO 2 (или другой процедуры эвтаназии, принятой на учреждение). Чтобы избежать привитые осложнения использовать сингенные доноров, которые же пола, что и получателей.
  2. Спрей мышь с 70% этанола. Подтяжка кожи на животе и с помощью хирургических ножниц сделать надрез через кожу от брюшной полости до ноги по направлению к лодыжке. Проведение ногу, твердо тянуть кожу от лодыжки к бедру подвергая ноги ткани.
  3. Срежьте мышц и жировой ткани из бедра, чтобы выставить тазобедренного сустава.
  4. Аккуратно потянув за ноги, чтобы продлить ногу, нажимайте ножницы против тазобедренного сустава. Вырезать чуть выше головки бедренной кости, стараясь не разрезать сам бедра.
  5. Для поддержания стерильности, держите ногу на ногу и очистить любые оставшиеся ткани от костей, протирая поверхность кости с автоклавного тканей.
  6. Отделите бедра и голени путем перерезания коленного сустава иразместить бедра в культуральной чашке, содержащей стерильную PBS. Инкубировать на льду.
  7. Снимите и выбросьте малоберцовой кости за счет сокращения в точках, где малоберцовой кости соединяется с голенью. Поместите голени в культуральной чашке с бедренной кости и инкубировать на льду.
  8. Повторите шаги 3.2-3.7 для другой ноги, и, если необходимо, дополнительные мышей-доноров. После удаления костей, стерилизации хирургических инструментов с горячей борта стерилизатора или использовать новый набор стерильных инструментов для последующих шагов.
  9. Для бедер, держите бедро с пинцетом и с помощью хирургических ножниц тщательно "бритье" дальние концы от кости. Удалить всего кости при необходимости подвергать полость BM.
  10. Заполните шприц с 3 мл стерильного PBS и приложите 23 г иглу. Тщательно родила иглы в полость Б. и промойте BM в стерильную чашку для культивирования. Будьте уверены, чтобы очистить мозгового полость с точки иглы для обеспечения удаления всех нужных клеток. После экстракции,убедитесь, что красный BM больше не видны и кости теперь появляется белый.
  11. Повторите шаги 3.9-3.10 для последующих бедрах, объединение всех БМ в то же блюдо культуры.
  12. Для голеней, удерживая голень щипцами и осторожно "бритья" конец, где большая берцовая кость была прикреплена к колену, чтобы разоблачить полость BM. Сделайте второй разрез вдоль кости, где видимый красный BM заканчивается.
  13. Заполните шприц с 3 мл стерильного PBS и приложите 25 G иглу. Осторожно введите иглу в полость ВМ (с конца, что был прикреплен к колену) и промойте BM в культуральную чашку, содержащую БМ от бедренных костей. Собрать стенки полости BM с иглой, чтобы удалить все клетки. После экстракции, убедитесь, что красный BM больше не видны и кости теперь появляется белый.
  14. Повторите шаги 3.12-3.13 для последующего голеней, объединение всех БМ в то же блюдо культуры.
  15. Аккуратно растирают BM с наконечником пипетки 1 мл до диссоциации Слоктей.
  16. Проход клеточной суспензии через корзину фильтра 40 мкм в стерильный 50 мл центрифужную пробирку. Промыть блюдо с PBS, чтобы получить любые оставшиеся клетки и передавать это через фильтр в центрифужную пробирку.
  17. Центрифуга в течение 5 мин при 450 х г при 4 ° С. Снимите и выбросьте супернатант.
  18. Повторное приостановить осадок в 3 мл эритроцитов лизирующего буфера. Инкубируют на льду в течение 8,5 мин.
  19. Добавить ~ 30 мл стерильной PBS, чтобы утолить буфер лизиса.
  20. Центрифуга в течение 5 мин при 450 х г при 4 ° С. Снимите и выбросьте супернатант.
  21. Повторное приостановить осадок в 1 мл стерильной PBS. Держите на льду.
  22. Возьмем небольшой аликвоты гомогената клеток и разбавляют PBS (1: 100 в течение 1 мыши; 1: 200 в течение 2 мышей и т.д.), чтобы определить число клеток с помощью гемоцитометра.
  23. Развести клеточной суспензии в 8 × 10 6 клеток / мл, и не инкубировать на льду до инъекции.

4. Трансплантация костного мозга

  1. FiLL 0,5 мл шприц (с 28 г инсулиновую иглу) с 300 мкл разбавленного клеточной суспензии для каждой мыши, чтобы быть введены. Будьте уверены, чтобы удалить воздушные пузыри, имеющиеся в шприце.
  2. Поставьте клетку мыши, содержащий обусловленные мышей-реципиентов на грелку и дайте хвостовой вены расширяются.
  3. Возьмите мышь получатель и место в запретительного устройства. Протрите хвост с хирургической марли, смоченной 70% этанола.
  4. Крепко держите хвост и со скосом вверх, аккуратно вставьте иглу в одной из боковых хвостовых вен и вводят клеточной суспензии.
  5. Удержание хирургического марли на месте инъекции, пока кровотечение не остановится перед введением мыши в новую чистую клетку.

5. Оценка Протяженность BM химеризм

ПРИМЕЧАНИЕ: Уровни химеризм, как правило, переменная в периферической крови через 1 неделю после пересадки, а также такие уровни химеризм, как правило, оценивается как минимум 2 недели после пересадки. Уровни Чимerism должны достигать> 80% GFP + клеток в периферической крови в течение 3-4 недель после пересадки.

  1. Подготовка FACS буфера (2 мМ ЭДТА + 2% фетальной бычьей сыворотки в PBS).
    Примечание: FACS буфера можно хранить при температуре 4 ° С в течение нескольких недель.
  2. Наведите в запретительного трубки и брить шерсть на задней ноге, чтобы выставить боковой подкожной вены.
  3. Тонко пальто ножка с вазелином и проткните подкожной вены с помощью иглы 25 G.
  4. Собирают примерно 50 мкл крови с гепарином покрытием капиллярной трубки. Добавить крови к микро-центрифужную пробирку, содержащую 1 мл FACS буфера. Смешайте трубки путем инверсии и хранить на льду.
  5. Удерживайте хирургического марли на месте инъекции, пока не остановится кровотечение до возвращения мышь обратно в клетку.
  6. Центрифуга образцы крови в течение 5 мин при 900 х г. Снимите и выбросьте супернатант.
  7. Повторное приостановить осадок в 500 мкл эритроцитов лизирующего буфера. Инкубируют на льду в течение 8,5 мин.
  8. Добавить 1 мл FACS буфера, чтобы утолить буфер лизиса.
  9. Центрифуга образцы в течение 5 мин при 900 х г. Снимите и выбросьте супернатант.
  10. Выполните второй шаг лизиса в 500 мкл эритроцитов лизирующего буфера. Инкубируют на льду в течение 8,5 мин.
  11. Добавить 1 мл FACS буфера, чтобы утолить буфер лизиса.
  12. Центрифуга образцы в течение 5 мин при 900 х г. Снимите и выбросьте супернатант. Убедитесь, что шарик сейчас белый.
    Примечание: Если осадок еще появляется красный, дополнительный этап лизиса может быть необходима, прежде чем приступить к следующему шагу.
  13. Повторное приостановить осадок в 1 мл FACS буфера. Центрифуга образцы в течение 5 мин при 900 х г. Снимите и выбросьте супернатант.
  14. Повторное приостановить осадок в 300 мкл FACS буфера, и количественно GFP + клеток с помощью проточной цитометрии (Примечание: В этот момент любое желаемое иммуноокрашивание клеток может быть выполнена, используя стандартные методики, до анализа проточной цитометрии).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Администрация 60-100 мг / кг бусульфана, как правило, хорошо переносится мышами. Однако, животные, как правило, теряют вес во время фазы кондиционирования (~ 5-10%) и, таким образом, диеты, возможно, потребуется дополнить с угощениями, таких как облученных семян подсолнечника по стимулированию еды. Уровни химеризма из> 80% GFP + клеток в периферической крови и BM должны быть достижимы с помощью последовательно 60-100 мг / кг Бусульфан 7. Наша лаборатория успешно использовал этот протокол для создания более...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Бусульфан кондиционирования позволяет для генерации высокого уровня BM химеризма у мышей с кроветворных клеток, которые легко обнаружить. Это кондиционирование может быть выполнена без необходимости облучения объектов. Кроме того, миелосупрессии с дозами бусульфана, изложенной в настоящем протоколе хорошо переносится, сводя к минимуму побочные токсические эффекты, вызванные миелоаблативной доз облучения, и, таким образом, может быть более подходящим способом для получения BM химеризм в молодой, старый, или больной мышей...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Мемориальной стипендией Рональда Питера Григгса в области исследований БАС (для KP) и грантом Программы партнерства в области нервно-мышечных исследований от CIHR, Общества БАС Канады и Muscular Dystrophy Canada (JNM-69682) для CK и FMR. Дополнительную поддержку также оказало Американское общество БАС (57969). Мы хотели бы поблагодарить доктора Р. Кита Хамфриса из Лаборатории Терри Фокса / Отделения патологии Агентства по борьбе с раком Британской Колумбии, Ванкувер, Канада, и сотрудников Университета Саймона Фрейзера по уходу за животными

.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
BusulfexOtsuka Canada Pharmaceutical Inc.DIN 02240602Разбавьте бусульфан до 3 мг/мл стерильным PBS непосредственно перед применением. Бусульфан является цитотоксичным. Обрабатывайте и утилизируйте в соответствии с MSDS и институциональными рекомендациями.
ACK Лизирующий буферLife TechnologiesA10492-01Другой лизисный буфер может быть заменен, но время инкубации может потребоваться соответствующим образом скорректировано
Фетальная бычьясыворотка Life Technologies12483-020

Ссылки

  1. Ginhoux, F., et al. Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  2. Hickey, W. F., Kimura, H. Perivascular microglial cells of the CNS are bone marrow-derived and present antigen in vivo. Science (New York, N. Y.). 239 (4837), 290-292 (1988).
  3. Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 48 (1), 11-22 (2009).
  4. Jimenez, M., Ercilla, G., Martinez, C. Immune reconstitution after allogeneic stem cell transplantation with reduced-intensity conditioning regimens. Leukemia. 21 (8), 1628-1637 (2007).
  5. Ellen Nath, C., John Shaw, P. Busulphan in blood and marrow transplantation: dose, route, frequency and role of therapeutic drug monitoring. Current clinical pharmacology. 2 (1), 75-91 (2007).
  6. Galaup, A., Paci, A. Pharmacology of dimethanesulfonate alkylating agents: busulfan and treosulfan. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 9 (3), 333-347 (2013).
  7. Lewis, C. -A. B., et al. Myelosuppressive Conditioning Using Busulfan Enables Bone Marrow Cell Accumulation in the Spinal Cord of a Mouse Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. PLoS ONE. 8 (4), e60661(2013).
  8. Capotondo, A., et al. Brain conditioning is instrumental for successful microglia reconstitution following hematopoietic stem cell transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (37), 15018-15023 (2012).
  9. Wilkinson, F. L., Sergijenko, A., Langford-Smith, K. J., Malinowska, M., Wynn, R. F., Bigger, B. W. Busulfan Conditioning Enhances Engraftment of Hematopoietic Donor-derived Cells in the Brain Compared With Irradiation. Molecular Therapy. 21 (4), 868-876 (2013).
  10. Lampron, A., Pimentel-Coelho, P. M., Rivest, S. Migration of bone marrow-derived cells into the CNS in models of neurodegeneration: Naturally Occurring Migration of BMDC into the CNS. Journal of Comparative Neurology. , 3863-3876 (2013).
  11. Kierdorf, K., Katzmarski, N., Haas, C. A., Prinz, M. Bone Marrow Cell Recruitment to the Brain in the Absence of Irradiation or Parabiosis Bias. PLoS ONE. 8 (3), e58544(2013).
  12. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. V. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nature Neuroscience. 14 (9), 1142-1149 (2011).
  13. Down, J. D., Tarbell, N. J., Thames, H. D., Mauch, P. M. Syngeneic and allogeneic bone marrow engraftment after total body irradiation: dependence on dose, dose rate, and fractionation. Blood. 77 (3), 661-669 (1991).
  14. Van Pel, M., van Breugel, D. W. J. G., Vos, W., Ploemacher, R. E., Boog, C. J. P. Towards a myeloablative regimen with clinical potential: I. Treosulfan conditioning and bone marrow transplantation allow induction of donor-specific tolerance for skin grafts across full MHC barriers. Bone Marrow Transplantation. 32 (1), 15-22 (2003).
  15. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. V. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nature Neuroscience. 10 (12), 1538-1543 (2007).
  16. Andersson, B. S., et al. Conditioning therapy with intravenous busulfan and cyclophosphamide (IV BuCy2) for hematologic malignancies prior to allogeneic stem cell transplantation: a phase II study. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 8 (3), 145-154 (2002).
  17. Hassan, M., et al. Cerebrospinal fluid and plasma concentrations of busulfan during high-dose therapy. Bone Marrow Transplantation. 4 (1), 113-114 (1989).
  18. Hassan, M., et al. In vivo distribution of [11C]-busulfan in cynomolgus monkey and in the brain of a human patient. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 30 (2), 81-85 (1992).
  19. Jung, S., et al. Analysis of Fractalkine Receptor CX3CR1 Function by Targeted Deletion and Green Fluorescent Protein Reporter Gene Insertion. Molecular and Cellular Biology. 20 (11), 4106-4114 (2000).
  20. Harrison, D. E. Competitive repopulation: a new assay for long-term stem cell functional capacity. Blood. 55 (1), 77-81 (1980).
  21. Evans, T. A., et al. High-resolution intravital imaging reveals that blood-derived macrophages but not resident microglia facilitate secondary axonal dieback in traumatic spinal cord injury. Experimental Neurology. 254, 109-120 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

GFP

Похожие статьи