Гидрогель Построить и фибрина-клей на основе подхода, чтобы доставить Therapeutics в мышиной модели инфаркта миокарда.

Краткое содержание

Этот протокол направлен на смягчение ограничения плохого приживления клеток для лечения инфаркта миокарда стволовыми клетками с помощью использования гидрогелевой системы и клея на основе фибрина. При таком подходе можно поддерживать контакт между клетками и тканями после инфаркта, увеличивая терапевтический потенциал полезных агентов в месте повреждения.

Аннотация

Мышиная модель ИМ широко признана в области сердечно-сосудистых заболеваний и постоянно используется в качестве первого шага для проверки эффективности лечения in vivo¹. Традиционный, установленный протокол был дополнительно доработан, чтобы свести к минимуму ущерб для животного. Примечательно, что слои грудных мышц удаляются, а не просто разрезаются, а к торакотомии подходят межреберно, а не ломают ребра при стернотомии, сохраняя целостность грудной клетки. Благодаря этим изменениям снижается общий стресс для животного.

Терапия стволовыми клетками, направленная на облегчение повреждений, вызванных ИМ, на протяжении многих лет демонстрировала многообещающие результаты благодаря своим проангиогенным и антиапоптотическим преимуществам. Современные подходы к доставке клеток на поверхность сердца обычно включают инъекцию клеток либо рядом с поврежденным участком, либо в коронарную артерию, либо в периферический кровоток^2-4. Несмотря на то, что доказано, что эти клетки являются домом для поврежденного миокарда, их функциональность ограничена их плохим приживлением в месте повреждения, что приводит к диффузии^{в кровоток}. В данной рукописи описывается процедура, которая позволяет преодолеть это препятствие с помощью гидрогелевого пластыря, инкапсулированного в клетки. Пластырь изготавливается до хирургического вмешательства и размещается на поврежденном миокарде сразу после окклюзии левой коронарной артерии. Чтобы закрепить пластырь на месте, биосовместимый внешний фибриновый клей помещается непосредственно поверх пластыря, что позволяет ему высохнуть как на пластыре, так и на поверхности сердца. Этот подход обеспечивает новый метод адгезии для применения тонкой терапевтической конструкции, инкапсулирующей клетки.

Введение

Инфаркта миокарда (ИМ) определяется как прерывание крови к области сердца, вызванные окклюзии крупной коронарной артерии. Ущерб от MI связано с ремоделирования жизнеспособного сердечной ткани в нефункциональной рубцовой ткани, что снижает способность сердца или, более конкретно, левый желудочек, чтобы правильно бить. Это приводит к уменьшению объема крови, который может быть доставлен к телу с каждым ударом сердца, известный как ударный объем, и процент крови, что перекачивается из сердца с каждым ударом сердца, известный как фракции выброса ^6. Они, наряду с другими функциями уменьшилась, увеличивает нагрузку на остальной части сердца для поддержания адекватной функции. Часто это увеличение деформации может стать настолько сильным, что вызывает второй сердечный приступ, явление наблюдается примерно 10% лиц, ^7.

В то время как медицинская практика превратилась для леченияСразу после ИМ, не метод не был разработан, чтобы остановить, медленно или обратить вспять негативные побочные эффекты ремоделирования ткани. Терапии стволовыми клетками появились в качестве возможного проспекте для такого лечения, однако, несмотря на их многообещающим потенциалом, стволовые клетки не доказали свою эффективность в клинических условиях. Одна теория для их недостатков является неспособность обеспечить благоприятные клетки остаются на месте инфаркта достаточно долго, чтобы произвести положительные результаты ^5. Было показано, что не более чем 24% клеток, которые просто вводят в месте миокарда не выжила и осталась на поврежденный участок 1 день после доставки ^2. Возможная перспектива для решения этого вопроса удержания клеток является разработка биосовместимых системы гидрогеля, которые инкапсулируют либо клетки или терапии, которые могут быть доставлены в поврежденном участке. Гидрогель выбора в данном протоколе является поли (этиленгликоль) диметакрилат из-за его использования в предыдущем клеток инкапсуляции прocedures, однако, любой гидрогель способен инкапсуляции могут быть использованы ^8. Доставка пластыря непосредственно в месте повреждения обеспечивает клетки к ткани контакт в течение продолжительного периода времени, увеличивая длину времени клетки могут обеспечить полезные факторы к базовому миокарда.

Узким местом подхода является патч трудность соблюдения патч к поверхности сердца. Многие группы преодолеть это с помощью различных методов, наиболее распространенным является простой шов, чтобы связать конструкцию к сердечной поверхности ^9,10. Это оказалось успешным в ряде случаев, в которых конструкция выполнена из жесткого материала, но терпит неудачу, когда пытались в системе гидрогеля, из-за высокой концентрации воды и тонкой природы коммутационной конструкции. Чтобы преодолеть это, мы использовали фибрин клей систему внешнего клей, который имитирует химию образования сгустка. Фибриновый клей был использован в многочисленных медицинских операций, IncЛУДИНГ Dura слезы, бронхиальных свищей и трансплантации роговицы, подчеркивая биосовместимость продукта в виде раны герметика ^11-13. Кроме того, фибрин был использован для различных сердечных целей, в том числе хирургического лечения разрывов левого желудочка и аортокоронарное операций, однако, его применение в качестве адгезионного клея для сердечной патч обычно не используется ^14-17. Простой формулировка тромбина и фибриногена приводит к биосовместимым клеем, который может быть помещен непосредственно на внешней стороне внешнего сердечной пластыря, обеспечивая жизнеспособную систему, чтобы обеспечить адгезию патч к сердечной взаимодействия.

Протокол

Процедура в полной совместимости с протоколом IACUC числа 13302 и был одобрен разделения ресурсов животных.

1. Подготовка прибора

1. Автоклав все не-одноразовые инструменты, используемые до хирургического вмешательства, чтобы обеспечить стерильность.
2. Стерилизовать инструменты, используемые многократно в сессии с бисер стерилизатор между видами.

2. Подготовка Гидрогель

1. Оттепель и пластины стволовые клетки, по крайней мере 24 ч до создания гидрогеля конструкции.
2. Подготовка патчи один день до хирургической процедуры с использованием стереолитографии аппарата (или аналогичного инструмента), который был описан во всех подробностях в предыдущих публикациях ^8,18.
3. Чтобы создать гидрогель, сначала создать системы автоматизированного проектирования (САПР) модель требуемого патча и экспортировать дизайн в формате стереолитографического (STL).
4. Создать предварительного гель решение, dissolvinг поли (этиленгликоль) диметакрилат (PEGDMA) в стерильном PBS 1x, чтобы получить 20% вес / об раствора. Одновременно растворить фотоинициатор 1- [4- (2-гидрокси-этокси) фенил] -2-гидрокси-2-метил-1-пропан-1-она в ДМСО. Добавить фотоинициатор к решению PEGDMA на окончательный вес / объем 0,5%. Непосредственно перед сшиванием, добавить 100 мл желаемой плотности клеток. Примечание: плотность клеток между 2,0 х 10 ⁵ х 10 -2.0 ⁶ клеток / мл рекомендуется.
5. Пипетировать предварительно раствора геля в чашку в центре платформы SLA и запустить программное обеспечение SLA с ранее загруженного STL отформатирован конструкции.
6. Удаление исправления из аппарата и инкубировать гидрогели O / N в модифицированной среде Дульбекко Игла (DMEM) с добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 Ед / мл пенициллина и 100 мг / мл стрептомицина, чтобы обеспечить клетки для регулировки для окружающей среды в патче.

3. Подготовка животных и устные intubatiна

1. Оценка каждой мыши до процедуры, чтобы обеспечить животное находится в добром здравии, а определяется из их уходом привычек и взаимодействия с их клетки товарищей. Примечание: Мужской 8-10 недельных мышей C57BL / 6J были использованы для этой процедуры, однако, любого возраста или типа мышь можно использовать.
2. Поместите животных в анестезии камеры и выставить до 5% изофлуораном с поддержкой 1 л / мин O _2. Контроль за уровнем анестезии пальца щепоткой рефлекса.
3. После того, как животное правильно наркозом, взвесить и разместить их на стенде интубации.
4. Направьте источник света в сторону животного грудной полости и использовать пинцет, чтобы убрать поверхность гортани и выставить голосовые связки. Тщательно направлять 20 G angiocath между голосовыми связками, и плавно вставьте в трахею. Обнаружение правильное подключение с помощью механического движения грудной полости после того, как катетер подключен к небольшой животных вентилятора.
5. Настройка параметров вентиляции в гое вес животного на основе принципов изготовителя.
6. После того, как интубация, поместите животное в положении лежа на спине на грелку, чтобы предотвратить переохлаждение. Убедитесь, что грелку не превышает 40 ° C. При необходимости, поместите барьер между животным и грелку, чтобы свести к минимуму вероятность ожогов.
7. Удалить волосы от места операции путем использования депиляционного крема. Стерилизовать сайт на 3 чередующихся скрабы из бетадином и 75% этанола, чтобы обеспечить надлежащее стерилизации. Поставьте драп, чтобы выставить только хирургическое сайт, и разместить ветеринар мазь на глаз, чтобы предотвратить сухость во время процедуры.

4. Хирургические процедуры

1. Торакотомии выполняется на левой стороне животного, таким образом, чтобы разрез кожи приблизительно 1 см слева от грудины, который работает длину грудины.
2. Используйте пинцет, чтобы отделить мышечного слоя от основной грудной клетки в двух шагах. Соблюдайте DELINEтем создания линии, которая представляет большой грудной мышцы животного. Поднимите эту мышцу немного, отделить его от основной наружной косой мышцы и убрать медиально. Затем освободить наружной косой мышцы от основной грудной клетки таким же образом, и убрать с боков, обеспечивая просторный вид на второй, третьей, четвертой и ребер.
3. Выполнение торакотомии между третьим и четвертым ребрами. Аккуратно поднимите четвертый ребро и использовать cauterizer, чтобы открыть грудную полость между третьим и четвертым ребрами. Поместите втягивающие дальнейшего открытия полости и подвергать сердце.
4. Используйте пинцет, чтобы разорвать тонкую перикарда сердца.
5. Лигирования левой коронарной артерии с нейлоновой мононити 8-0 шва. Поместите шва примерно 4 мм от верхушки сердца, непосредственно под нижней оконечности левого предсердия. Определить правильное размещение шва на побледнение миокарда желудочков и увеличению размера левого предсердия после ŞuţuRe была привязана.

Патч Размещение 5. Клей и

1. Хранить патчей при 37 ° С и 5% СО ₂ условия до использования.
2. Аккуратно поднимите патч, используя плоскую лопаточку концами и аккуратно поместите его на поверхности сердца, на месте миокарда.
   Примечание: Для предотвращения соскальзывания левый желудочек, патч может быть проведен в месте, слегка поддерживая контакт либо с помощью шпателя или кончиком пинцета.
3. Приготовьте клей путем смешивания 4: соотношение фибриногена с тромбином 1. Смешайте раствор повторным пипетированием, пока она не начнет сгущаться, как правило, в течение 1 мин после начала подготовки.
4. После того, как вязкость раствора достигнет желаемого уровня, быстро передавать примерно 10 мл на поверхность пластыря. Примечание: Время свертывания из фибринового клея является быстрым, обеспечивая небольшое окно возможностей для эффективной передачи клея.

6. Наложение швов

Выполнить все швы закрытия с помощью нейлоновой нити 6-0 мононити.
1. Закрыть грудную слой от трех до четырех отдельных швами.
2. До полного закрытия межреберной слоя, вставить ПЭ-10 канюли в разрез эвакуировать грудной полости после закрытия завершена и восстановить правильное внутриплевральной давление.
3. Закрыть грудные мышцы 3:57 отдельных швами.
4. Уплотнение поверхностного слоя с непрерывным швом.
5. После полного закрытия, приложите 1.0 мл шприц к концу канюли и использовать его, чтобы эвакуировать грудной полости.
6. Нанесите клей ткани в месте разреза, чтобы укрепить шов сайт.

7. После хирургического лечения

1. Дайте мышам инъекции бупренорфина (0,05-1,0 мг / кг) и карпрофена (2,2 мг / кг) подкожно сразу после коронарного лигирования и наименее 20 мин до возрождения. Администрирование оба препарата 6-8 ч после операции, А затем дать два раза в день на срок до трех дней, чтобы контролировать боль и страдания.
2. Постоянно следить за животным, пока сознательного и каждый час в течение первых 4 ч после операции. Выполните вторую обследование в ночь на операции (2-4 ч позже), чтобы управлять вторую дозу анальгетика.
3. Daily Monitor животных после второго дня после процедуры, пока животные не появляются стабильной.

8. Анализ сердца функции и гистологии

1. Выполните echocardiographs на мышах 4 недель после процедуры, чтобы определить степень повреждения следующей МИ.
2. Обезболить мышей с 4-5% изофлуран в анестезии камеры для индукции ингаляционной анестезии, а затем 2% изофлуран через маску для обслуживания анестезии.
3. Очистите область изображения с депиляции кремом и использовать небольшое УЗИ животных, чтобы получить 2D М-режим эхокардиографии сканирование бьющимся сердцем и записывать функциональные параметры Ассолем, связанных с ним.
4. Эвтаназии мышей в камере с диоксидом углерода, затем собирать сердца у животных и поместить в 10% растворе формалина в течение 24 ч. Через 24 часа передавать сердца с 70% -ным этанолом и держать при температуре 4 ° С до обработки тканей.
5. Процесс сердца и вставлять их в парафиновые блоки.
6. Вырезать 5 мм срезы через желудочка области сердца, начиная с вершины и заканчивается в предсердие.
7. Пятно срезы срезы с обеих трихромом и гематоксилином Массона и эозином пятно, используя стандартные протоколы.

Результаты

Во время хирургической процедуры, лигирование левой коронарной артерии может быть идентифицирован заметное побледнение ниже по потоку от закупоренной артерии. В качестве теста перед связывать себя узами брака, шов может быть кратко затянуты, чтобы проверить, если он находится в соответствующем месте. Кроме того, поскольку окклюзии артерии результатов в почти мгновенной снижение способности левого предсердия, чтобы правильно бить, левое предсердие будет увеличить в ответ на обратного потока крови в системе.

Обсуждение

При таком подходе к мышиной модели MI, мы разработали систему, которая сводит к минимуму повреждения, не миокарда областях, которые связаны с другими методами мышиных ИМ. Эти области включают в себя ущерб, причиненный трахеостомии, резку мышечного слоя, и поломку ребер, чтобы разоблачить грудной полости. Мы считаем, что эти изменения улучшают общие хирургические итоговые благодаря тщательности, чтобы как можно больше крупных структур, в том числе ребер и мышечные с...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Harvard Model 687 Аппарат искусственной вентиляции легких для мышей	Harvard Apparatus	55-0001
Inintech Biosciences LLC Стерилизатор сухих стеклянных шариков	Fisher Scientific	NC9531961
Leica MZ6 хирургический микроскоп Leica
Caugery Kit Gemini		GEM 5917
Нежные щипцы - наконечники 0,4 мм Угловые	инструменты	для тонкой науки11063-07
Втягивающее устройство Agricola - 3,5 см Разворот	Инструменты для тонкой науки	17005-04
Пружинные ножницы - 2,5 мм Лезвия прямые	Инструменты для тонкой науки	15000-08
Иглодержатель Castroviejo - с замком Карбид вольфрама 14 см	Инструменты для тонкой науки	12565-14
Ножницы с диафрагмой - тонкие прямые 10,5 см	Инструменты для тонкой науки	14060-10
8-0 Монофиламентный шовный материал	Ethicon	8730P
6-0 Шелковый шовный материал	Ethicon	639G
Тромбин	Sigma	T7009
Фибриноген	Sigma	F3879
Vetbond Тканевый клей	3M	1469SB