Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Лимфоцит Изоляция из человеческой кожи для фенотипического анализа и

14.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52564

⸱

8 апреля 2016 г.

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Medical Immunology, Department of Laboratory Medicine, Radboud University Medical Centre, 2Department of Dermatology, Radboud University Medical Centre

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем протокол для эффективного выделения резидентных Т-клеток кожи из биопсии кожи человека. Этот протокол позволяет получить достаточное количество жизнеспособных резидентных лимфоцитов кожи человека для проточного цитометрического анализа и культивирования ex vivo.

Аннотация

Человеческой кожи имеет важную барьерную функцию, и содержит различные иммунные клетки, которые вносят вклад в гомеостаз ткани и защиты от патогенных микроорганизмов. Поскольку кожа является относительно легко получить доступ, он обеспечивает идеальную платформу для изучения периферические механизмы иммунных регуляторных. Иммунные клетки резидентные у здоровых поведения кожи иммунологического, но и играют важную роль в развитии воспалительных заболеваний кожи, таких как псориаз. Несмотря на возникающие идеи, наше понимание биологии, лежащей в основе различных воспалительных заболеваний кожи по-прежнему ограничено. Существует необходимость для хорошего качества населения (одиночный) клеток, выделенных из образцов биопсии кожи. До сих пор процедуры изоляции были серьезно затруднена из-за отсутствия получения достаточного количества жизнеспособных клеток. Выделение и последующий анализ также пострадали от потери иммунных маркеров клеточной линии дифференцировки, из-за механического и химического стресса, вызванного существующими процедурами диссоциации, чтобы получитьодноклеточной суспензии. Здесь мы опишем модифицированный метод для выделения Т-клеток от обоих здоровых и привлеченным псориатический кожи человека путем сочетания механической диссоциации кожи с использованием автоматизированной диссоциатор тканей и лечения коллагеназы. Эта методика сохраняет экспрессию большинства маркеров иммунной линии дифференцировки, таких как CD4, CD8, Foxp3 и CD11c при приготовлении одноклеточных суспензий. Примеры успешного выделения клеток CD4 + T и последующего фенотипических и функционального анализа показаны.

Введение

Кожа, в качестве основного интерфейса между телом и окружающей средой, обеспечивает первую линию защиты от внешних физических, химических и биологических оскорблений, таких как язву ультрафиолетового излучения и микроорганизмов. Кожа состоит из двух основных отделения, эпидермис и дерму, и содержит множество иммунных клеток , включая клетки Лангерганса, макрофаги, дендритные клетки (ДК) и около 20 миллиардов Т - клеток памяти, почти в два раза больше числа присутствующих во всем объеме крови 1 , 2. Все больше данных поддерживает идею о том, что кожа имеет существенные иммунологические функции, как во время гомеостаза тканей и при различных патологических состояниях. Иммунные клетки резидентные в нормальной коже , как полагают, проводят иммунологического 3 и было показано, играют важную роль в развитии воспалительных заболеваний , таких как псориаз 4. В псориатической пораженной кожи, и CD4 + и CD8 + Т - клетки проникали были наблerved и показано , что отношение CD4 и CD8 варьирует в зависимости от состояния заболевания 5. Тем не менее, эти популяции клеток трудно изучать, так как существующие методы позволяют изолировать только несколько клеток.

В настоящее время широко используются методы для выделения Т-клеток из человеческой кожи сочетают механическую диссоциацию кожи с ферментативной обработкой. Биопсий кожи человека широко фарша и инкубировали с ферментами , такими как трипсин, коллагеназа и / или ЭДТА 6-8. Принимая во внимание , что кожа является барьером ткани , которая обладает высокой устойчивостью к растягивающих сил и механической дезагрегации, установленные методы выделения Т - клеток получают очень мало клеток, и даже более низкие количества жизнеспособных клеток, что делает ех Vivo культуры клеток этих клеточных популяций трудно и испытывающий.

Здесь мы сообщаем модифицированный метод для выделения лимфоцитов из обоих здоровых и привлеченным псориатический кожи человека путем объединения Mechanскую диссоциация кожи с использованием автоматизированной диссоциатор ткани вместо установленного метода широко мясорубки вместе с ферментативное расщепление с помощью коллагеназы. Различные жизнеспособные подмножества иммунных клеток, включая контроллеры домена и Т-клетки наблюдались после приготовления одной клеточной суспензии. Важно, что экспрессия поверхностных маркеров CD3, CD4 и CD8 хорошо сохранился. Клетки , полученные таким способом, будут готовы к использованию в бывших клеточных культурах или естественных условиях анализа проточной цитометрии. Этот протокол был успешно применен для анализа единичных биоптатах кожи (4 мм), полученные из повреждений кожи у пациентов с псориазом. Результаты показали , что кожа пациента житель Т - клетки получают более провоспалительных цитокинов , таких как IL-17 и IFN & gamma ; по сравнению со здоровыми добровольцами 9.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: биопсию кожи у здоровых индивидуумов были получены из брюшной кожи пережиток лиц, перенесших плановое пластическую операцию после устного или письменного информированного согласия для научного использования. Использование человеческой кожи был утвержден и в соответствии с правилами, установленными Медицинским этическими комитетами для человеческого исследования в медицинском центре университета Radboud, Неймеген, Нидерланды и Университет Эссен, Германия.

1. Подготовка одноклеточных суспензий из человеческой кожи (работа стерильного в потоке-кабинете, если последующее Культура клеток требуется)

  1. Готовят среду для культивирования клеток: среда RPMI 1640 + пенициллин / стрептомицин (конечные концентрации 100 единиц / мл и 100 мкг / мл, соответственно) + пирувата (0,02 мМ) и Glutamax (0,02 мМ) без сыворотки добавлены.
  2. Подготовить всю питательную среду: питательная среда, полученного на стадии 1.1 + 10% человек объединяли сыворотку (HPS); Хранить при температуре 4 ° С. Доведите среды до 20 ° С ± 2 перед намиING.
  3. Получение биопсии кожи с использованием 4мм круглый инструмент трепанобиопсия и держать его в RPMI1640 полной культуральной среде при температуре 20 ° С ± 2 до 4 часов или при температуре 4 ° C ON. Процесс биопсии как можно скорее по прибытии в лабораторию.
    Примечание: более длительное хранение кожи будет влиять на выход клеток и жизнеспособность клеток.
  4. Этикетка синего шапками диссоциации трубки и добавляют 5 мл полной культуральной среды в помеченную пробирку.
  5. Добавляют 2 мл полной культуральной среды в каждую лунку (в общей сложности 3 скважины) стерильного 6-луночный планшет для культивирования. Используйте стерильные инструменты, чтобы поместить биопсии в одну лунку, промыть, переместить его на второй скважине и повторить этот шаг еще раз, таким образом достигая в общей сложности трех полосканий.
  6. Перенести хорошо промыты биопсии кожи в стерильную чашку Петри, добавляют 100 мкл полной культуральной среды на верхней биопсии, и осторожно соскабливают подкожно-жировой ткани, используя нержавеющей стали одноразового использования стерильным скальпелем.
    Примечание: Thэто очень важный шаг.
  7. Разрежьте каждую биопсию кожи на 4 мелкие кусочки на стерильную чашку Петри. Образцы передачи (до четырех 4 мм биопсий на пробирку) к подготовленному диссоциации пробирку, содержащую 5 мл полной культуральной среды.
  8. Плотно закройте пробирки с крышкой, и прикрепить вниз головой к рукаву автоматизированной диссоциатора ткани. Убедитесь, что все образцы материала находится в зоне ротора.
  9. Запустить процесс диссоциации, запустив "Программа m_spleen _01" (предопределенный программу, представленную внутренней памяти прибора или в сопровождении программной картой) отделиться биопсии при соответствующей скорости вращения в течение 56 сек.
  10. После обработки отсоединения диссоциации трубки от диссоциатора и убедитесь, что все диссоциированного материал собирается в нижней части трубы.
  11. Добавьте 150 мкл коллагеназы IA (80 мг / мл) в диссоциации трубки и инкубировать образец в встряхивании на водяной бане при температуре 37° С в течение 60 мин. Добавляют 100 мкл ДНКазы I (5 MU / мл) в thedissociation трубку, хорошо перемешать.
    Примечание: Более высокая концентрация коллагеназы или более длительного времени инкубации будет изменять жизнеспособность клеток.
  12. Прикрепите трубку диссоциации к рукаву автоматизированной диссоциатора ткани и запустить "программу m_ селезенка _01" отмежеваться биопсии еще один раз.
  13. Поместите нейлоновый клеточный фильтр 70 мкм на верхней части трубки сокола 50 мл. Применить диссоциированных образцы материалов для этой ячейки фильтра, чтобы удалить скопления клеток / мусора ткани.
  14. Промыть клеточный фильтр один раз 5 мл полной культуральной среды. Центрифуга при температуре 20 ° С ± 2, 450 мкг в течение 10 мин и супернатант аспирата.
  15. Повторите стадии промывки еще один раз. гранулы клеток Ресуспендируют в 300 мкл полной культуральной среды. Одноклеточные суспензии готовы для дальнейшего анализа; по- прежнему с протоколами для бывших естественных условиях культивирования клеток или проточной цитометрии анализа.
  16. В случае дальнейшего Intracellular окрашивание цитокинов, стимулируют клетки с PMA (12,5 нг / мл), Ionomycin (500 нг / мл) и Brefeldine А (5 мкг / мл) в течение 4 ч при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 инкубаторе в течение 4 часов перед выполнением потока цитометрии анализ.

2. Поликлональные Активация кожи резидентных Т - клеток (Ex Vivo культуры клеток)

  1. Кратные суспензии одноклеточные 100 мкл (полученного на стадии 1.15) в круглым дном 96-луночного планшета.
    Примечание: Для каждого из 4 биопсии кожи мм, приобретаемые одноклеточные суспензии могут быть разделены на по меньшей мере две лунки 96-луночного планшета.
  2. Добавить анти-CD28 микрогранулы анти-CD3 / монАТ напыление (25,000 шариков на ячейку), рекомбинантный человеческий цитокин РИЛ-2 (конечная концентрация 25 ед / мл) и RIL-1 & beta; (конечная концентрация 50 нг / мл).
  3. Накройте культуральную пластину с хорошо видную закрывающей пластины, инкубировать в 5% СО 2, 100% влажности, 37 ° C инкубатор. Изменение среды, когда среда цвет становится желтым.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Четкое клеток колонии можно наблюдать с 8-й день культивирования клеток.

3. Проточная цитометрия Анализ первичной / культивированный кожи резидентных Т-клеток

  1. Подготовка FACS буфера: PBS + 0,2% BSA.
  2. Передача клетки, представляющие интерес в V-дно 96-луночного планшета. Центрифуга при температуре 20 ° С ± 2, 450 мкг в течение 2 мин, и супернатант аспирата.
  3. Ресуспендируют осадок в 100 мкл PBS. Центрифуга при температуре 20 ° С ± 2, 450 мкг в течение 2 мин, и супернатант аспирата.
  4. Пятно клетки с 100 мкл приготовленных eFluorescence780 конъюгированных Fixable жизнеспособность красителя (1: 1000 разведение с использованием PBS) при 4 ° С в течение 30 мин. Добавьте 100 мкл FACS буфера, центрифуге при температуре 20 ° С ± 2, 450 мкг в течение 2 мин, и супернатант аспирата.
  5. Выберите требуемый маркера клеточной поверхности мАт, например: CD45-BV421 (HI30, 1:20), CD3-ECD (UCHT1, 1:50), CD4-PC5.5 (1388,2, 1: 200), CD8-АРС-AlexFluo700 (B9.11, 1: 400), CD14-FITC (TUK4, 1:50), CD19-APC-AlexFluo750 (13-119, 1:50), CD56-PE (MEM-188, 1:50), CD25-PeCy7 (BC96, 1:50), CD11c-PeCy7 (BU15, 1:10), и CD1c-APC (AD5-8E7, 1:10), готовят мАт-смеси с использованием FACS буфера по каждому фактору разбавления мАт тестировали. Определение настроек затвора с помощью управления изотипа антитела вместе с образцом без пятен.
  6. Добавьте 25 мкл приготовленной смеси мАт-в каждую лунку. Выдержите 20 минут при температуре 20 ° С ± 2, защищенном от света месте.
  7. Добавьте 100 мкл FACS буфера, центрифуге при температуре 20 ° С ± 2, 450 мкг в течение 2 мин, и супернатант аспирата.
  8. Для образцов, когда требуется только поверхностное окрашивание клеток, переходите к выполнению шага 3.16.
  9. В случае окрашивания внутриклеточной Foxp3:
    1. Подготовка фиксации и пермеабилизирующего буфера путем смешивания одной части концентрата с 3-х частей разбавителей.
    2. Приготовьте 1х буфер пермеабилизирующего: 1 часть буфера 10x пермеабилизирующего + 9 частей стерилизованной H 2 O.
  10. Ресуспендируют гранул в 100 мкл фиксации и permeabiliзация буфер, хорошо перемешать и инкубировать при температуре 4 ° С в течение 30 мин.
  11. Добавьте 100 мкл буфера пермеабилизирующего в каждую лунку центрифуге при 450 мкг при комнатной температуре в течение 2 мин, и супернатант аспирата.
  12. Вымойте клеток с пермеабилизации буфером еще один раз.
  13. Выберите требуемый внутриклеточные мАт, например, Foxp3-eFluo450 (PCH101, 1:50), IL-17A-AlexFluo488 (eBio64DEC1, 1:50) и IFN & gamma;-PeCy7 (4S.B3, 1: 400). Готовят смесь мАт с использованием пермеабилизирующего буфера, содержащего 2% сыворотки нормальной крысы, согласно каждому фактору мАт разведений тестируемого. Определение настроек затвора с помощью управления изотипа антитела вместе с образцом без пятен.
  14. Добавьте 20 мкл приготовленной MAB-смеси в каждую лунку. Выдержите в 4 ° С в течение 30 мин, защищенном от света месте.
  15. После 30-минутной инкубации, добавьте 100 мкл пермеабилизации буфера в каждую лунку. Центрифуга при температуре 20 ° С ± 2, 450 мкг в течение 2 мин, и супернатант аспирата.
  16. Вымойте клеток с пермеабилизации Buffeг еще один раз. Ресуспендируют осадок в 110 мкл буфера FACS и перенос клеточных суспензий в текущем microFACS трубку.
    Примечание: Образец готов к измерению с использованием 10-цветной проточной цитометрии.
  17. В случае точного количества клеток требуется, добавьте 10 мкл хорошо перемешанной однородной суспензии флуоросфер в каждом образце непосредственно перед выполнением измерений с использованием проточной цитометрии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Протокол, представленные здесь, даст между 2200 ± 615 (среднее значение ± SEM, кожа здоровых добровольцев) до 178000 ± 760 (среднее значение ± SEM, пораженной кожи пациентов, страдающих псориазом) жизнеспособных лимфоцитов из кожи человека при использовании одного 4 мм биопсии кожи.

Различные типы CD45 + клеток , были идентифицированы в одноклеточных суспензий , полученных из кожи здоровых лиц , включая CD4 + T-клеток (около 45%), CD8 + Т-клетки (~ 30%), и CD...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы приводим протокол, чтобы эффективно изолировать резидентные кожи Т-клеток из биопсий кожи человека. Преимуществом этого протокола является выделение относительно большого числа жизнеспособных лимфоцитов, экспрессирующих и соответствующие поверхностные маркеры. Подмножества клеток были идентифицированы: CD11c + DCs, клетки CD4 + и CD8 + Т - клетки и Foxp3 + CD25 +. Важно отметить, что экс естественных условиях культуры изолированных резидентов кожи ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

биопсии кожи у пациентов с псориазом были любезно предоставлены доктором Андреасом Koerber (дерматологии отдела в Университете г. Эссен, Германия) после устного или письменного информированного согласия для научного использования.

XH также поддерживается NSFC 61263039 и 11101321 NSFC.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Одноразовый биопсийный перфораторKai EuropeBP-40F4 мм
Одноразовые стерильные скальпелиDalhausen1100000510
gentleMACS C tubeMiltenyi Biotech130-093-237Синий колпачок, используется как диссоциационная трубка.
gentleMACS DissociatorMiltenyi Biotech130-093-235Автоматизированный тканевый диссоциатор. Использование «программы spleen_01» для диссоциации биопсии кожи.
Сетчатый фильтр для ячеек BD35235070 & микро; m нейлоновая
96-луночная U-образная нижняя пластинаGreiner Bio-One650180
RPMI 1640Life Technologies22409-015
Пируват натрияLife Technologies11360-039
GlutaMAXLife Technologies35050-061
Пенициллин/стрептомицинLife Technologies15140-122
Человек Объединенная сыворотка (HPS)собственного приготовления
Collagenase ISigma-AldrichC2674Type 1-A, подходит для клеточной культуры
DNase ICalbiochem260913
PBSB Braun3623140
BSASigma-AldrichA4503-500G
Корректируемая жизнеспособность красителя (FVD) APC-eFluo780eBioscience65-0865-18Окрашивание мертвых клеток перед фиксацией клеток; разбавление PBS в соотношении 1:1,000
Концентрат фиксации/пермеабилизацииeBioscience00-5123-43
Разбавитель фиксации/пермеабилизацииeBioscience00-5223-56
Буфер для пермеабилизации (10x)eBioscience00-8333-56
BV421 Мышиный античеловеческий CD45BD563879клон: HI30; фактор разведения 1:50
FITC Мышь античеловеческий CD14DakoT0844Клон: TUK4; фактор разведения 1:50
PE Мышь античеловеческий CD56DakoR7127Клон: MOC-1; фактор разведения 1:50
ECD Мышь античеловеческий CD3Beckman - CoulterA07748Клон: UCHT1; коэффициент разведения 1:50 для поверхностного окрашивания; коэффициент разведения 1:25 для внутриклеточного окрашивания.
PC5.5 Мышиный античеловеческий CD4Beckman - CoulterB16491Клон: 13B8.2; коэффициент разведения 1:200
PeCy7 Мышиный античеловеческий CD11cBeckman - CoulterA80249Клон: BU15; фактор разведения 1:50
APC Мышиный античеловеческий CD1cMiltenyi Biotech130-090-903Клон: AD5-8E7; коэффициент разбавления 1:10
APC-AlexFluo700 Мышиный античеловеческий CD8Beckman - CoulterA66332Клон: B9.11; коэффициент разведения 1:400
APC-AlexFluo750 Мышь против человека CD19Beckman - CoulterA94681Клон: J3-119; фактор разведения 1:50
PeCy7 Мышь против человека CD25eBioscienceAD5-8E7Клон: BC96; коэффициент разведения 1:50
  PE Крыса античеловеческий CLAMiltenyi Biotech130-091-635клон: HECA-452; фактор разведения 1:
eFluo450 Крыса против человека Foxp3eBIoscience48-4776-42Клон: PCH101; внутриклеточное окрашивание; фактор разведения 1:50
AlexFluo488 Мышь против человека IL-17AeBioscience53-7179-42Клон: eBio64DEC17; внутриклеточное окрашивание; фактор разведения 1:50
PeCy7 Мышь против человека IFNgeBioscience25-7319-41Клон: 4S. В3; внутриклеточное окрашивание; коэффициент разбавления 1:400
Flow-Count FluorospheresBeckman -Coulter 7547053Счетные шарики, для проточной цитометрии

Ссылки

  1. Clark, R. A., et al. The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin. J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).
  2. Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. A. Normal human dermis contains distinct populations of CD11c+BDCA-1+ dendritic cells and CD163+FXIIIA+ macrophages. J Clin Invest. 117, 2517-2525 (2007).
  3. Gebhardt, T., et al. Memory T cells in nonlymphoid tissue that provide enhanced local immunity during infection with herpes simplex virus. Nature Immunol. 10, 524-530 (2009).
  4. Boyman, O., et al. Spontaneous development of psoriasis in a new animal model shows an essential role for resident T cells and tumor necrosis factor-alpha. J Exp Med. 199, 731-736 (2004).
  5. Christophers, E., Mrowietz, U. The inflammatory infiltrate in psoriasis. Clin Dermatol. 13, 131-135 (1995).
  6. Jiang, X., et al. Skin infection generates non-migratory memory CD8+ T(RM) cells providing global skin immunity. Nature. 483, 227-231 (2012).
  7. Havran, W. L., et al. Limited diversity of T-cell receptor gamma-chain expression of murine Thy-1+ dendritic epidermal cells revealed by V gamma 3-specific monoclonal antibody. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4185-4189 (1989).
  8. Campbell, J. J., et al. CCR7 expression and memory T cell diversity in humans. J Immunol. 166, 877-884 (2001).
  9. He, X., et al. Targeting PKC in human T cells using sotrastaurin (AEB071) preserves regulatory T cells and prevents IL-17 production. J Invest Dermatol. 134, 975-983 (2014).
  10. Clark, R. A., et al. A novel method for the isolation of skin resident T cells from normal and diseased human skin. J Invest Dermatol. 126, 1059-1070 (2006).
  11. Clark, R. A., Kupper, T. S. IL-15 and dermal fibroblasts induce proliferation of natural regulatory T cells isolated from human skin. Blood. 109, 194-202 (2007).
  12. Keijsers, R. R., et al. In vivo induction of cutaneous inflammation results in the accumulation of extracellular trap-forming neutrophils expressing RORgammat and IL-17. J Invest Dermatol. 134, 1276-1284 (2014).
  13. Hybbinette, S., Bostrom, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental dermatology. 8, 30-38 (1999).
  14. Hennino, A., et al. Skin-infiltrating CD8+ T cells initiate atopic dermatitis lesions. J Immunol. 178, 5571-5577 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

FACSex vivo
Лимфоцит Изоляция из человеческой кожи для фенотипического анализа и
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.