Генерация трехмерной всю толщину кожи Эквивалент техники и автоматизированных Ранение

Краткое содержание

Цель этого протокола — создать трехмерный эквивалент кожи полной толщины, который напоминает естественную кожу. С помощью специально сконструированного автоматизированного намоточного устройства можно создавать точные и воспроизводимые раны при соблюдении стерильности.

Аннотация

Модели in vitro являются экономически эффективной и этичной альтернативой для изучения процессов заживления кожных ран. Более того, используя человеческие клетки, эти модели лучше отражают ситуацию с ранами человека, чем животные модели. Хотя двумерные модели широко используются для исследования таких процессов, как миграция и пролиферация клеток, для получения более глубоких знаний о заживлении ран требуются более сложные модели. Помимо подходящей модельной системы, создание точных и воспроизводимых ран имеет решающее значение для обеспечения сопоставимых результатов между различными испытательными циклами. В этом исследовании показано создание трехмерной кожи полной толщины, эквивалентной исследованию заживления ран. Дермальная часть моделей состоит из дермальных фибробластов человека, встроенных в гидрогель коллагена типа I типа «крысиный хвост». После инокуляции эпидермальными кератиноцитами человека и последующего посева на границе раздела воздух-жидкость на верхней части моделей формируется многослойный эпидермис. Для изучения процесса заживления ран мы дополнительно разработали автоматизированное устройство для заживления ран, которое генерирует стандартизированные раны в стерильной атмосфере.

Введение

Кожа является самым большим органом тела. Это создает барьер между внешней средой и внутренними органами. Кроме того, кожа защищает организм от потери жидкости, воздействия окружающей среды, травм и инфекций и помогает регулировать температуру тела ^1. Из-за его открытом месте, кожа часто зависит от механического, термического или химического травмы. Хотя кожа, как правило, способны самовосстановления, несколько местные факторы, такие как инфекции, оксигенации и венозного достаточности может привести к нарушению заживления ран. Заживление ран может быть также препятствуют системных факторов, как ожирение, алкоголизм, курение, лекарства, питание и заболеваний, таких как диабет. ²

Процесс заживления ран можно разделить на три фазы: (I) воспалительной фазы, (II) пролиферативных и (III) фазы ремоделирования. По травма кожи, комплексный сигнал-каскад начинается, что приводит к закрытию раны. ³После травмы, раны кровотечение и сгусток крови формируется. Фибробласты двигаться в сгусток крови и заменить его новой ткани, которая впоследствии перестроенный в течение многих лет.

Современное понимание биологических процессов, лежащих кожного ремонта ограничено. Маленькие животные и свиньи модели были использованы для изучения заживления ран. Тем не менее, эти результаты не могут быть непосредственно переданы для человека из-за различий видоспецифичных. В дополнение к этим моделям в естественных условиях, некоторые аспекты заживления ран могут быть изучены путем имитации раны ситуацию с помощью царапин в пробирке монослойных культур на основе иммортализованных клеточных линий или первичных клеток. ⁴ Эти царапин модели, являются высоко стандартизованными, но не в достаточной степени отражает Комплекс в естественных физиологии. ⁵ Кроме двумерных моделей, трехмерные человека эквивалентов кожи были разработаны для дерматологических исследований. Кожная часть из этих моделей GEnerated, используя различные каркасы в том числе decellularized дермы, ⁶ коллагена гидрогели, ^7,8 гликозаминогликанов ⁹ или синтетических материалов. ¹⁰ Используя эти эквиваленты кожи, роль эпителиальных-мезенхимальных взаимодействий ^11, реэпителизацию, сотовый перекрестные помехи между фибробластов и кератиноцитов и Влияние различных факторов роста могут быть изучены. Кроме того, эти модели являются полезными, чтобы получить новые знания о том, как фибробласты мигрируют в раненого области и как хемотаксический факторы влияют на регенерацию тканей. ¹²

Не только поколение самой модели заживления раны является сложной задачей, но и установить максимально стандартизированные рана в модели является проблематичным. Общие методы, чтобы создать раны от царапин тесты, ¹³ ожоги, ¹⁴ ленты истиранию, ¹⁵ термическое повреждение, ¹⁶ всасывающие волдыри, ¹⁷ жидкий азот, ¹⁸ лазеров, ¹⁹ скальпели, ¹⁸ meshers ⁶ и биопсия удары. ²⁰ Большинство из этих методов имеет те же подводные камни. Травмы, осуществляемые вручную трудно стандартизировать и воспроизводить между многократными испытаниями. Размер, форма и глубина раны варьироваться в зависимости от исследований и тем самым отрицательно повлиять на качество исследовательских данных. Использование лазера для определенного ранения кожи может быть относительно легко стандартизировать, но приводит к тому, имитирующих ран ожога. Тепловая обработка с помощью лазера может привести к денатурации белка, агрегацию тромбоцитов или суда сужение, которое может привести к некротической ткани.

В качестве альтернативного подхода, мы разработали автоматизированную ранения устройство (AWD), которая позволяет нам создавать определенные и точные кожные раны в стерильных условиях. Ранении параметры, такие как глубина и скорость проникновения, а также оборотов буровой головки может регулироваться. В этом исследовании, мы совместили AWD с собственной разработки на полную толщину кожных эквивалентов (футыSE), что можно сравнить с протоколом, опубликованной Gangatirkar и др. ⁸ дермальный слой кожи эквивалента состоит из человеческих фибробластов кожи (HDF), которые встроены в коллагена I гидрогеля. На кожном слое, кератиноциты эпидермиса человека (НЕК) высевают. В течение двух недель на границе воздух-жидкость НЕК создать эпидермиса, состоящий из нескольких жизненно важных клеточных слоев и рогового слоя. Кроме того, поколения этой модели, это исследование показывает, использование AWD для создания определенным и точным раны в FTSE.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: протокол предназначен для производства 24 полной толщины кожных эквивалентов. Человек кожные фибробласты и эпидермальные кератиноциты выделяли из биопсий кожи в соответствии с ранее опубликованной протокола. ^21,22 было получено информированное согласие заранее и исследование было одобрено комитетом институциональные этики на человека исследований Юлиуса-Максимилиана университета Вюрцбурга (голосовать 182 / 10).

1. Производство кожного компонента

1. Растворить коллагена с 0,1% уксусной кислоты до конечной концентрации 6 мг / мл. Для решения нейтрализации гел, смешивание 232,5 мл 2x DMEM, 7,5 мл фетальной телячьей сыворотки, 7,5 мл 3 М HEPES, 2,5 мл хондроитин сульфат (5 мг / мл). Держите гель нейтрализации раствора и раствора коллагена на льду. Рассчитать 500 мкл геля на эквивалент вставки / кожи.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В гель нейтрализации раствора смешивают с двумя частями раствора коллагена препаRe двойном размере коллагена.
2. Поместите 24 пластины в 24-луночный планшет.
3. Ресуспендируют дермальные фибробласты человека (HDF) в 10 мл DMEM, центрифуге в течение 5 мин при 270 х г и подсчет клеток. Извлеките необходимое количество HDF (5 х 10 ⁴ клеток на 500 мкл геля коллагена) и центрифуги клеток в течение 5 мин при 270 х г.
4. Удалить супернатант и осторожно ресуспендируют HDF в 4 мл раствора геля охлаждали нейтрализации, не вызывая пузырьки воздуха. От этого шага убедитесь, что работать как можно быстрее, чтобы избежать преждевременного затвердевания геля коллагена.
5. Ресуспендируют раствор с 8 мл раствора коллагена.
6. Возьмите коллагена-Cell-смеси с многоступенчатой ​​пипетки и заполнить быстро 500 мкл смеси в каждой вставки. Инкубируйте гели в течение 20 мин в термостате (37 ° С, 5% СО _2), чтобы желе гели.
7. Погрузите гели в 2 мл Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) + 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS) на лункуи инкубировать ее в течение 24 ч в инкубаторе (37 ° С, 5% СО _2).

2. Добавление человека кератиноцитов эпидермиса (НЕК)

1. Удалить среду после 24 часов. Растворить фибронектина человеческий белок сверхчистой водой до конечной концентрации 50 мкг / мл. Обложка каждого кожных эквивалентную 25 мкл фибронектина решения. Инкубируйте гели в течение 30 мин в термостате (37 ° С, 5% СО _2).
2. В то же время, ресуспендируют НЕК в 10 мл СРК-2 и установить концентрацию клеток до 1 × 10 ⁶ клеток / мл с КГМ-2 готов + 5% FCS. Семена 1 × 10 ⁵ клеток НЕК на каждый гель. Инкубируйте гели в течение 45 мин в инкубаторе (37 ° С, 5% СО _2), чтобы позволить клеткам прилипать.
3. Погружать гелей КГМ-2 готового + 5% FCS и культуры их в инкубатор (37 ° C, 5% CO _2).

3. Культура полной толщины кожных эквивалентов (FTSE)

1. Культура FTSE в течение 6-7 днейв нисходящем FCS-концентрации (5%, 2%, и 0% FCS). Изменение среды каждые 2-3 дней с последующим низкой концентрации FCS. Для этого полностью удалить носитель и добавить 1,6 мл свежей среды.
2. На 7-й день, удалить среду полностью.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь к поверхности FTSE кончиком пипетки, делая так.
3. Поместите каждой вставке в 1 лунку 6-луночного планшета с стерильным пинцетом. Добавить 1,5 мл воздушных перевозок среды на лунку, убедитесь, чтобы не замочить FTSE поверхность. Изменить среду каждые 2-3 дней для дополнительных 14 дней.
   ПРИМЕЧАНИЕ: уровень заполнения среды до мениска FTSE.

4. Гистологический анализ

1. Крепление и парафина вложение FTSE
   1. Удалить культуральной среды, передавать вставки в свежих 24-луночные планшеты и исправить ткани путем добавления 1,6 мл 4% параформальдегида в каждую лунку и инкубировали ткани в течение 2 часов при комнатной температуре. Внимание! Paraformaldehyd является токсичным, манипулировать под вытяжкой. ПереводFTSE к ткани-вложение кассеты. Удалить остатки фиксатор промывкой водой и обезвоживают ткани с использованием концентрации этанола возрастанию.
   2. Разделите эквивалент кожи, вертикальном разрезе в середине. Поместите две части в парафин заполнено металлической основе формы с поверхностей разрезов вниз. Добавить кассету ткани в верхней части пресс-формы в качестве подложки.
   3. Вырезать 3-5 мкм ломтиками и они плавали на водяной бане 40 ° С в течение straitening, установите слайды на подходящих для микроскопа. Тщательно высушите ломтики.
2. Окрашивание (IHC) гематоксилином и эозином (Н & Е) и иммуногистохимическое
   1. Место скользит в стойке и инкубируют в течение 1 ч при 60 ° С. Убедитесь, что парафин плавится. Пятно регидратации ломтиков с H & E в виде стандартного окрашивания обзора.
   2. Для H & E окрашивания подготовить 4x окрашивания стекла кюветы с ксилол, 3x этанолом 96%, 2x с этанолом 70%, 1x этанолом 50%, 4-кратным деионизированной воды, 1x гематоксилином, 1x HCl-еthanol (13,7 мл 1 М HCl объявления 200 мл 50% этанола), 1x вкладка вода, 1x эозином (1 г эозина в 100 мл деионизированной воды) и 2x 2-пропанола.
   3. Место слайды 10 мин в ксилол I и 10 мин в ксилол II к deparaffinize и увлажняет слайдов. Dip слайды 3 раза в этанол 96% I, 3x в этаноле 96% II, 3x в этаноле 70% и в 3 раза в этаноле 50%. Поверните слайды в деионизированной воде. Чтобы дифференцировать гематоксилин краситель, окуните 2x в HCl-этанол. Промыть в деионизированной воде. Для посинения, место слайды 5 мин на вкладке воды. Для окрашивания эозином, место скользит 1 мин в эозином и мыть после этого в деионизированной воде. Для обезвоживания, погружные скользит 2x в этаноле 70%, 2x в этаноле 96% и поместить их в течение 5 мин в 2-пропаноле I, в течение 5 мин в 2-пропаноле II, 5 мин в ксилоле Я и 5 мин в ксилоле II. После H & E окрашивания ядра клеток окрашиваются в синий, цитоплазмы и внеклеточного матрикса окрашивают в красный цвет.
   4. Для поиска антигена, удалите парафин в ксилоле и увлажняет дольки, окрашивания. Место ломтикив пароварке и готовьте парафина и Регидратированные ломтики в течение 20 мин в подогретые 10 мМ цитрат буфера (рН 6).
   5. Место слайды в стиральной буфера (PBS буфера + 0,5% Polysorbat 20) и кусочки круг с жидким репеллентом слайд-маркером или алмазной иглы.
   6. Поместите слайды в камере влажности. Блок эндогенной пероксидазы, путем добавления 100 мкл 3% раствора перекиси водорода на каждый срез. Внимание! Очень опасными в случае кожу и в глаза. Обращаться с индивидуальной защиты. Вымойте слайды в стиральной буфера.
   7. Применение первичного антитела и инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре. Промыть слайды три раза промывочным буфером. С этого образцы должны храниться в темноте.
   8. Использование биотин-стрептавидин системы обнаружения для обнаружения специфического антигена связывания антитела.
   9. Контрастное ядер с гематоксилином в течение 1 мин. Дегидрировать и смонтировать слайдов.
   10. Образцы изображение, используя обратную микроскопом.

5. Травмы от использования устройства Автоматизированная ранив (AWD)

1. Подготовка AWD по дезинфекции рабочей зоной с 70% этанола и ультрафиолетового света. Убедитесь, что буровой головки нужного размера (например, 1 мм) прилагается.
2. Поместите их эквиваленты кожи в специально отведенных местах автоклавного образца несущей пластиной с помощью стерильного пинцета. Поместите образец несущую пластину в гнездо под буровой головки.
3. Используйте программное обеспечение управления, чтобы задать ранив параметры следующим образом: спина скорость: 15000 оборотов в минуту; Проникновение: 1,5 мм; Привод: 100 Гц. Эти параметры должны быть определены для каждого типа образца индивидуально. Передача ранив параметры в AWD.
4. Начните ранив процедуру. Снять образец несущую пластину из розетки. Передача раненых FTSE обратно в вставками, используемых для культивирования с использованием стерильного пинцета.
5. Далее с культурой раненых FTSE в инкубаторе (37 ° С, 5% СО ₂₎ для исследования регенерации. Альternatively, использовать модели для гистологического анализа в любое время.

Результаты

Изолированные HDF и НЕК различаются как по морфологии и экспрессии типичных маркеров. HDF показали типичную морфологию шпинделя-формы, в то время как морфология НЕК может быть описана булыжником морфологии. Клетки характеризуются иммуногистохимического окрашивания (рис 1), прежде чем использовать их для FTSE. HDF являются позитивными для виментина (рис 1А), маркера для фибробластов. Первичная НЕК высоко выразить ранней дифференциации белка цитокератин-14 (рис 1B), но по...

Обсуждение

В пробирке клеток, как правило, расширены в двумерных клеточных культур, в которых клетки прилипают к пластиковой поверхности. Тем не менее, эти условия культивирования не отражают физиологическое трехмерные условий, в которых клетки растут в естественных условиях. Под трехмерных условиях, клетки могут образовывать природные вложения клетка-клетка и клетка-матрица и мигрировать в трех измерениях. Особенно в кожной заживления ран сходство ситуации в естественных условиях имеет решающее значение...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Трипсин ЭДТА (1:250) 0,5% в DPBS	PAA	L11-003	0,05%
Дульбекко s Фосфатно-солевой буфер	Sigma	D8537
Коллаген (6 мг/мл в 0,1% уксусной кислоте)	Производится в собственном
фибронектине Человеческий белок, плазма (50  &микро; г/мл)	Life Technologies	33016-015
Вкладыши	Nunc	140627
6 луночных планшетов	Nunc	140685
24-луночный планшет	Nunc	142485
предметные стекла для микроскопа	R. Langenbrinck	03-0070
Культивирование фибробластов (500 мл):
DMEM, высокий уровень глюкозы	Life Technologies	11965-092	89% (445 мл)
Фетальная бычья сыворотка	Bio & Продать	FCS. ADD.0500	10% (50 мл)
Пенициллин-стрептомицин (10,000 Ед/мл)	Life Technologies	15140-122	1% (5 мл)
Keratinozyten культуральная среда (500 мл):
Keratinocyte Growth Medium 2	Promocell	C-20111	89% (445 мл)
Среда для роста кератиноцитов 2 SupplementPack	Promocell	C-39011
Пенициллин-стрептомицин (10,000 Ед/мл)	Life Technologies	15140-122	1% (5 мл)
<сильно>Раствор для нейтрализации геля (250 мл):
Dulbecco' s Модифицированный порошок Eagle Medium, с высоким содержанием глюкозы и L-глутамином	PAA	G0001,3010	93% (232,5 мл)
Хондроитин сульфат натрия соль из акульего хряща	Sigma	C4384-1g	1% (2,5 мл)
Фетальная бычья сыворотка	Bio & Продать	FCS. ADD.0500	3% (7,5 мл)
HEPES	Sigma	H3375-1кг	3% (7,5 мл)
Skin модель погружает среду (500  ml):
Keratinocyte Growth Medium 2	Promocell	C-20111
Среда для роста кератиноцитов 2 SupplementPack	Promocell	C-39011
Фетальная сыворотка для теленка	Bio & Продать	FCS. ADD.0500	5%-2% (25 мл-10 мл)
Пенициллин-стрептомицин (10 000 ЕД/мл)	Life Technologies	15140-122	1% (5 мл)
Skin model воздухо-жидкая среда на границе раздела воздух-жидкость (500 мл):
Keratinocyte Growth Medium 2
Keratinocyte Growth Medium 2 Supplement Pack	Promocell	C-39011	добавление только добавок: инсулин, гидрокортизон, эпинефрин, трансферрин, CaCl<суб>2
Пенициллин-стрептомицин (10 000 ЕД/мл)	Life Technologies	15140-122	1% (5 мл)
CaCl<суб>2 (300 мМ)	Сигма	C7902-500g	0,62% (3,1 мл)
Histology:
IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP	DCS	PD000KIT
антитело к виментину	Abcam	ab92547
антитело CK14 Sigma		HPA023040-100&микро; l
CK10 антитело	Dako	M7002
Антитело к филаггрину	Abcam	ab81468
H& E окрашивание:
Mayer´ s Haemalaun	AppliChem	A0884,2500
Xylol	Sigma Aldrich	296325-4X2L
Этанол	Sigma Aldrich	32205-4X2.5L
HCl	Sigma Aldrich	H1758-500ML
Eosin	Sigma Aldrich	E4009-5G
2-пропанолол	Sigma Aldrich	I9516-500ML
Монтаж средний	Sigma Aldrich	M1289-10ML