Этот протокол описывает метод детальной оценки подмножеств лейкоцитов в микроокружении опухоли мыши в модели. Хемерин-экспрессирующие клетки меланомы B16 были имплантированы подкожно сингенным мышам. Затем клетки из опухолевого микроокружения окрашивали и анализировали с помощью проточной цитометрии, что позволило провести детальный анализ подпопуляций лейкоцитов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Оценка опухоли инфильтрирующие лейкоцитов подмножеств в подкожной опухоли модели
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Специализированный иммунные клетки, которые проникают в микроокружение опухоли регулировать рост и выживание неоплазии. Злокачественные клетки должны ускользать или подорвать противоопухолевые иммунные ответы, чтобы выжить и процветать. Опухоли воспользоваться рядом различных механизмов иммунной "побега", включая вербовку толерогенную округ Колумбия, иммунодепрессанты регуляторные Т-клетки (регуляторные Т-клетки), и миелоидного происхождения супрессоров (MDSC), которые ингибируют цитотоксические реакции противоопухолевые. С другой стороны, противоопухолевый эффекторные иммунные клетки могут замедлить рост и расширение злокачественных новообразований: иммуностимулирующих дендритных клеток, естественных клеток-киллеров, которые несут врожденный иммунитет против опухоли, и цитотоксических Т-клеток все могут участвовать в подавлении опухоли. Баланс между про- и анти-опухолевых лейкоцитов в конечном счете определяет поведение и судьбу трансформированных клеток; Множество клинических исследованиях у человека уже это подтвердили. Таким образом, детальный анализ лейкоцитов подмножеств вмикросреда опухоль становится все более важным. Здесь мы опишем метод для анализа Проникнув лейкоцитов подмножеств, присутствующие в опухоли микроокружения в опухолевой модели мыши. Мышь В16 опухолевые клетки меланомы инокулировали подкожно в мышей C57BL / 6. В указанное время, опухоли и окружающую кожу иссекают единым блоком и обрабатываются в отдельных клеточных суспензий, которые затем окрашивали в течение многоцветной проточной цитометрии. Используя различные лейкоцитов подмножества маркеров, мы смогли сравнить относительные проценты проникновения лейкоцитов подмножеств между контролем и chemerin-выражения опухоли. Исследователи могут использовать такой инструмент для изучения иммунной присутствие в опухоли микроокружения и в сочетании с традиционными измерения размеров суппорт опухолевого роста потенциально позволит им выяснить влияние изменений в иммунной композиции на рост опухоли. Такой метод может быть применен к любой модели опухоли, в котором опухоль и его микроокружение Cбыть резекции и обрабатывается.
Введение
Баланс между ростом опухоли и поощрения и регрессии, в частности, зависит от баланса про- и анти-опухолевых проникновения лейкоцитов, присутствующих в микросреде 1,2. С целью изучения микросреды опухоли (TME) и, в частности выявления Проникновение субпопуляций лейкоцитов, мы разработали метод для оценки подкожных опухолей на мышиной модели опухоли. Важность изучения микроокружение опухоли хорошо известна и поддерживается в литературе. Многочисленные исследования показали, что баланс про- и анти-опухолевых проникновения иммунных клеток может повлиять на результаты роста опухоли, а не только в мыши, но и человеческие исследования (обзор в 3,4). На....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с утвержденным Стэнфорд, Пало-Альто А. ЖКХ, а также Национальные институты здравоохранения Институциональная AnimalCare и использования Комитетом руководящих принципов.
1. Подготовка для образца сбора и обработки (Необходимое время: ~ 10-15 мин)
- Посев мышиных клеток меланомы B16F0 (0,5-1 × 10 6) подкожно на или вблизи средней линии живота в женских C57BL / 6 мышей, как описано ранее 6. Кроме того, инокуляции опухолевых клеток на дополнительных анатомических участков (например, боковая, жировой ткани молочной железы и т.д.).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Наши результаты показали, что вынуждены сверхэкспрессии chemerin в мышиных опухолей В16 увеличивало процент опухолевых проникновения лейкоцитов (Tīls). Кроме того, были выявлены изменения в относительной пропорции лейкоцитов подмножеств, представленных в опухоли микроокружения, связанного с выражением chemerin. Повторная печать с разрешением от Pachynski и др. 6.
Рисунок 1 показывает, что существует значительное увеличение в общем объеме CD45 + клеток (TILS.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Выполнение подробный анализ микросреды опухоли имеет решающее значение в определении механизмов и последствий иммуномодуляцию. С увеличением присутствия иммунотерапевтических в клинической сфере человека, понимания воздействия этих препаратов на опухолевые проникновения лейкоцитов становится реквизит в определении механизма их действия. У человека часто существуют клинические и / или логистических трудностей в получении и анализе опухолевой ткани для анализа лейкоцитов подмножества, и, таким образом, анализ периферическ.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантами R01-CA169354 и R01-047822 из Национального института здоровья и поощрительных выплат от Департамента по делам ветеранов (ЕЦБ). РКП была поддержана NIH T32 CA009287-30A1, в ASCO для молодых исследователей Award, Калифорния груди Cancer Research Project стипендий и Американского общества рака наставником ученый-исследователь гранта; БАЗ была поддержана NIH грант AI07....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| RPMI | Cellgro | 10-040 | http://cellgro.com; держать на льду |
| FBS | Cellgro | 35-011-CV | http://cellgro.com |
| 50 мл конические тубы | Falcon | 14-432-22 | fischersci.com |
| 40 μ м фильтр | Falcon | 08-771-1 | fischersci.com |
| шприц 5 мл | BD | 14-823-35 | fischersci.com |
| хирургические ножницы/щипцы | Roboz | RS-5910 | roboz.com |
| PBS | Cellgro | MT-21-030-CM | http://cellgro.com; держать на льду |
| трипан синий | Cellgro | MT-25-900-CI | fischersci.com |
| гемацитометр | Hausser Scientifice | 02-671-54 | fischersci.com |
| Живые/мертвые пятна | Life Technologies | L34957 | lieftechnologies.com |
| программное обеспечение FlowJo TreeStar | , Inc | flowjo.com |
Ссылки
- Mantovani, A., et al. Chemokines in the recruitment and shaping of the leukocyte infiltrate of tumors. Semin Cancer Biol. 14 (3), 155-160 (2004).
- Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunos....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
