Использование мягких агар колонии Формирование анализе для идентификации ингибиторов туморогенности в клетках рака молочной железы

Как нетрансформированные (нормальные), так и трансформированные клетки могут легко размножаться в 2D-монослойной культуре. Эта форма роста адгезивных клеток сильно отличается от той, которая происходит in vivo, где в отсутствие митогенной стимуляции клетки часто не делятся быстро в своем микроокружении. С другой стороны, анализ мягкого агара отличается от систем 2D-культивирования, поскольку он количественно оценивает онкогенность путем измерения способности клетки к пролиферации и образованию колоний в суспензии внутри полутвердого^{агарозного} геля. В этих условиях нетрансформированные клетки не могут быстро размножаться в отсутствие привязки к внеклеточному матриксу (ВКМ) и подвергаются апоптозу, процессу, известному как анойкис. Напротив, клетки, подвергшиеся злокачественной трансформации, теряют свою якорную зависимость из-за активации сигнальных путей, таких как фосфатидилинозитол-3-киназа (PI3K)/Akt и Rac/Cdc42/PAK. Таким образом, эти клетки способны расти и образовывать колонии внутри полутвердой матрицы мягкого агара².

Обычно анализ мягкого агара используется для проверки того, способны ли определенные соединения, такие как ингибиторы PADI, подавлять рост опухоли in vitro. В целом, количество колоний или размеры колоний являются количественными показаниями анализа, которые можно сравнивать между контрольной и лечебной группами для оценки различий в клеточной онкогенности. Таким образом, если обнаружить, что образование колоний обратно коррелирует с увеличением концентрации препарата, то можно сделать вывод, что препарат является эффективным ингибитором онкогенности in vitro. С другой стороны, если препарат не влияет на колониеобразование, препарат либо не в подходящей дозировке, либо он не является эффективным ингибитором опухолей. Помимо использования анализа мягкого агара для проверки противоопухолевого эффекта препарата, этот анализ также может быть использован для изучения взаимосвязи между конкретным геном и онкогенезом. Например, влияние подавления экспрессии PADI2 на онкогенность может быть устранено с помощью PADI2-специфичного лечения миРНК.

PADI — это кальций-зависимые ферменты, которые посттрансляционно модифицируют белки, превращая положительно заряженные остатки аргинина в нейтрально заряженный цитруллин в процессе, известном как цитруллинирование или деиминирование^3-5. Недавно мы обнаружили, что пептидиларгининдейминаза 2 (PADI2) может функционировать как новый биомаркер рака молочной железы и что ингибиторы PADI представляют собой кандидаты в методы лечения рака молочной железы на ранних стадиях^. Например, ранее мы продемонстрировали, что ингибитор «пан-PADI», Cl-амидин, подавляет пролиферацию клеток рака молочной железы с помощью 2D-монослоев, и что ингибитор подавляет рост 3D-сфероидов опухолей6. В этом отчете мы расширяем эти исследования и подчеркиваем полезность анализа мягкого агара, проверяя эффективность нового ингибитора PADI, BB-CLA, в подавлении роста колоний рака молочной железы^{MCF10DCIS 7}. Отметим, что для этого эксперимента мы использовали MCF10DCIS клетки, поскольку они являются онкогенными производными нетрансформированных клеток MCF10A человека и поскольку они содержат высокие уровни устойчивого белка PADI2⁸. Мы предполагаем, что ферментативная активность PADI2 играет ключевую роль в онкогенности этой клеточной линии и что BB-CLA-опосредованное ингибирование активности PADI2 будет подавлять прогрессирование рака.

1. Получение 3% 2-гидроксиэтил агарозном

1. В чистую, сухую стеклянную колбу на 100 мл, добавляют 0,9 г 2-гидроксиэтил агарозы (агарозном VII) с последующим 30 мл дистиллированной воды.
2. Микроволновая печь смесь в течение 15 сек и нежно вихревой. Повторите этот шаг, по крайней мере еще три раза, пока агарозном порошок полностью не растворится.
3. Автоклав, содержащий раствор бутылку в течение 15 мин.
4. Разрешить раствор агарозы остыть до комнатной температуры перед дальнейшим использованием. Хранить раствор при комнатной температуре.

2. Подготовка нижнего слоя: 0,6% агарозном геле

1. Предварительно теплой несколько 5 мл и 10 мл пипетки в 37 ° С инкубатор, чтобы предотвратить затвердевание агарозы в пипетку при обращении.
2. Частично ослабить крышку бутылки и микроволновой печью готовые 3% 2-гидроксиэтил раствор агарозы в течение 15 сек. Затем нежно вихревой решение и микроволновая печь еще 15 сек. ВНИМАНИЕ: Будьте осторожны при закрученной AgaroРаствор существу, потому что раствор поднимается при контакте с воздухом, и может распространиться.
3. Если остаточная твердый гель в бутылке, микроволновая печь на несколько секунд.
4. Держите бутылку, содержащую агарозы решение в водяной бане при 45 ° в течение следующих шагов по предотвращению раствора агарозы затвердевание преждевременно.
5. Теплый MCF10DCIS СМИ в С на водяной бане 37 °. Примечание: MCF10DCIS носитель состоит из DMEM / F12, 5% лошадиной сыворотки, 5% пенициллина стрептомицина.
6. Передача 3 мл 3% -ного раствора агарозы с использованием подогретого пипетки в стерильный 50 мл коническую пробирку.
7. Сразу добавить 12 мл теплой MCF10DCIS СМИ и аккуратно переверните коническую трубку, чтобы смешать агарозы со СМИ. Старайтесь не образуют пузырьки, как это будет мешать колонии считая позже.
8. Осторожно добавляют 2 мл этой смеси в каждую лунку планшета для культивирования 6-луночный без образования пузырьков воздуха.
9. Выдержите культура пластины Horizonta 6-аLLY на плоской поверхности при 4 ° С в течение 1 ч, чтобы дать смеси затвердеть.
10. После того как смесь затвердеет, поместите пластину в 37 ° C инкубаторе в течение 30 мин. Нижний слой готов к использованию.

3. Подготовка клетки, содержащие слой: 0,3% агарозном геле

1. Trypsinize MCF10DCIS клетки и разбавить их концентрации клеток 4 х 10 ⁴ / мл.
2. Возьмите 2 мл 3% агарозы с использованием подогретого пипеток и передать в стерильный 50 мл коническую трубку.
3. Сразу добавить 8 мл MCF10DCIS СМИ конической трубе и аккуратно переверните смешать агарозы со СМИ. Избегайте образования пузырьков.
4. Принимать 2 мл клеток MCF10DCIS (4 х 10 ⁴ / мл) и обработать BB-CLA (0 мкм (ДМСО) или 1 мкМ).
5. В разведении 1: 1, смесь клеток с 0,6% агарозы.
6. Принимать по 1 мл смеси клеток-агарозы и осторожно добавить на нижнем слое культуральной р 6-луночногоконце (2 х 10 ⁴ клеток / мл).
7. Место культуры пластины 6-а горизонтально на плоской поверхности при 4 ° С в течение не менее 15 мин, чтобы верхний слой затвердевать.
8. После того как смесь затвердеет, поместите пластину в 37 ° C инкубаторе в течение недели, прежде чем добавлять фидерного слоя.

4. Подготовка фидерного слоя: 0,3% агарозном геле

1. Микроволновая печь готовые 3% 2-гидроксиэтил раствор агарозы в течение 15 сек. нежно вихревой решение и микроволновая печь еще 15 сек.
2. Равновесие агарозы бутылку раствора в водяной бане при 45 ° C.
3. Теплый СМИ MCF10DCIS на водяной бане 37 ° C.
4. Смешайте 1 мл 3% раствора агарозы с 9 мл теплой MCF10DCIS СМИ в 50 мл коническую трубку и аккуратно переверните смешать агарозы со СМИ. Избегайте образования пузырьков воздуха.
5. Treat смеси с BB-CLA (0 мкм (ДМСО) или 1 мкМ).
6. Аккуратно добавить 1 мл этой смеси (без дляМин пузырьков) в каждую лунку культуральной пластины 6-луночный содержащей дно и мягкие слои.
7. Место культуры пластины 6-а горизонтально на плоской поверхности при 4 ° С в течение не менее 15 мин, чтобы дать смеси затвердеть.
8. После подачи слой затвердевает, поместите пластину в 37 ° C инкубатора.
9. Повторите эту процедуру кормления еженедельно путем наложения 1 мл 0,3% раствора агарозы / средний / лечения на существующей фидерного слоя для пополнения клетки с новыми СМИ, пока не наблюдается образование колоний. Примечание: Агар в мягких и фидерных слоях очень мягким и, следовательно, добавлены питательные вещества из фидерного слоя будет легко диффундируют в слой клеток, содержащих достичь клетки.

5. Сбор данных

1. Через 2,5 недели роста клеток в мягком агаре, подсчитывают количество колоний в каждой лунке с помощью светового микроскопа. Для облегчения количественного, распечатать сетку на прозрачности и прикрепите сетку6-луночный планшет, чтобы помочь определить, где клетки во время подсчета голосов. Так размер колонии (как количественно диаметра каждой колонии) будет изменяться, заранее определить размер опорного колоний, чтобы определить, какие колонии будет забито. Например, включают размеры колонии 70 мкм или больше, при анализе данных.
2. Хранить образцы при температуре 4 ° С, чтобы предотвратить дальнейшее образование колоний и для будущего подсчета. Печать культуру пластину 6-а с парафильмом, чтобы предотвратить гели от высыхания.

Мягком агаре анализа образования колоний может быть использован для широкого диапазона приложений, документирующих онкогенность раковых клеток. Основным преимуществом этого метода является то, что полутвердой матрице избирательно способствует росту клеток, которые могут размножаться в опоре-независимым способом. Эта черта в основном выставлены раковых клеток, но не нормальные клетки. Мы в первую очередь использовать эту технику, чтобы проверить эффективность торможения роста опухоли по наркотикам и для проверки влияния повышенной экспрессией или истощения наших генов интерес, в том числе генов PADI, на туморогенности клеток рака молочной железы. Здесь мы оценили воздействие BB-CLA на онкогенного ингибирования PADI2 сверхэкспрессией MCF10DCIS клетки (фиг.1 и 2).

Результаты показывают, что BB-CLA значительно ингибирует образование MCF10DCIS клеток, полученных колоний. Рисунок 3 показывает, что в присутствии ингибитора PADI, т Здесь отмечено снижение как образование колоний и колонии размера по сравнению с контролем ДМСО. [Примечание:. BB-КЛК растворяли в ДМСО и таким образом, ДМСО использовали в качестве контроля] Размер колоний для BB-CLA обрабатывают MCF10DCIS клетки были преимущественно в пределах от 20 до 100 мкм, а размер колоний для ДМСО контроль выставлены более широкий диапазон от 70 до 150 мкм после 2,5 недель роста.

Колонии больше, чем 70 мкм подсчитывали и анализировали (рисунок 4). Был в среднем 3536 колоний в контроле ДМСО в то время как только 1967 колонии были замечены в BB-CLA группе, получавшей после 2,5 недель мягкой агаровой культуры. Это представляет собой 44% -ное снижение средней образования колоний в присутствии 1 мкМ BB-CLA, что указывает на значительное онкогенного ингибирование раковых клеток молочной железы (MCF10DCIS клетки) ингибитором PADI.

pload / 52727 / 52727fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Химическая структура BB-CLA.

Рисунок 2. Схема Обзор протокола для формирования анализе Мягкая агар колонии. В каждую лунку с культурой пластин 6-а был сначала покрывают 0,6% агарозном геле (нижний слой). Смесь агарозном геле 0,3%, содержащий клетки MCF10DCIS и либо BB-CLA ингибитор (1 мкМ) или ДМСО (контроль), то слой поверх на 0,6% геле. Раз в неделю, 0,3% агарозном геле смесь (содержащую BB-CLA) добавили в верхней части слоя мягкой. После 2 до 4 недель, образование колоний наблюдалось и подсчитывали для анализа данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3. Изображения колонии формирование в BB-CLA-обработанных клеток. MCF10DCIS MCF10DCIS клетки выращивали в мягком агаре в присутствии 1 мкМ (BB-CLA) или отсутствие BB-CLA (0 мкМ ДМСО). После 2,5 недель, колонии были обследованы с помощью инвертированного микроскопа для низких изображений увеличения и светового микроскопа для высоких увеличениях изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4. Количественное определение MCF10DCIS колонии номер после BB-КЛК Лечение. MCF10DCIS клетки выращивали в мягком агаре при различных концентрациях BB-CLA (0 мкМ (ДМСО), или 1 мкМ BB-CLA). Через 2,5 недели, отдельные колонии больше гоА.Н. 70 мкм подсчитывали. Эксперименты были повторены 4 раза (п = 4). Статистическая значимость общей разницей между клеточной массы контрольных образцов и лечения определяли по т-двухвыборочный Стьюдента (* р <0,005).

Авторам нечего раскрывать.