Здесь мы документируем использование анализа образования колоний мягкого агара для проверки влияния ингибитора фермента пептидиларгининдеиминазы (PADI), BB-Cl-амидина, на опухолевую генность рака молочной железы in vitro.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Использование мягких агар колонии Формирование анализе для идентификации ингибиторов туморогенности в клетках рака молочной железы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Учитывая трудности, присущие исследованию механизмов прогрессии опухоли in vivo, клеточные анализы, такие как анализ образования колоний мягкого агара (далее называемый анализом мягкого агара), который измеряет способность клеток к пролиферации в полутвердых матрицах, остаются отличительной чертой исследований рака. Ключевым преимуществом этого метода по сравнению с обычными 2D-монослойными или 3D-анализами сфероидных клеточных культур является близкая имитация трехмерной клеточной среды к той, которая наблюдается in vivo. Важно отметить, что анализ мягкого агара также является идеальным инструментом для тщательного тестирования влияния новых соединений или условий лечения на пролиферацию и миграцию клеток. Кроме того, этот анализ позволяет количественно оценить потенциал клеточной трансформации в контексте генетических возмущений. Недавно мы идентифицировали пептидиларгининдеиминазу 2 (PADI2) в качестве потенциального биомаркера рака молочной железы и терапевтической мишени. В данной статье мы подчеркиваем полезность анализа мягкого агара для доклинических противораковых исследований путем проверки влияния ингибитора PADI, BB-Cl-амидина (BB-CLA), на онкогенность клеток протоковой карциномы человека in situ (MCF10DCIS).
Введение
Как нетрансформированные (нормальные), так и трансформированные клетки могут легко размножаться в 2D-монослойной культуре. Эта форма роста адгезивных клеток сильно отличается от той, которая происходит in vivo, где в отсутствие митогенной стимуляции клетки часто не делятся быстро в своем микроокружении. С другой стороны, анализ мягкого агара отличается от систем 2D-культивирования, поскольку он количественно оценивает онкогенность путем измерения способности клетки к пролиферации и образованию колоний в суспензии внутри полутвердогоагарозного геля. В этих условиях нетрансформированные клетки не могут быстро размножаться в отсутствие привязки к внеклеточному матриксу (ВКМ) и подвергаются апоптозу, процессу, известному как анойкис. Напротив, клетки, подвергшиеся злокачественной трансформации, теряют свою якорную зависимость из-за активации сигнальных путей, таких как фосфатидилинозитол-3-киназа (PI3K)/Akt и Rac/Cdc42/PAK. Таким образом, эти клетки способны расти и образовывать колонии внутри полутвердой матрицы мягкого агара2.
Обычно анализ мягкого агара используется для проверки того, способны ли определенные соединения, такие как ингибиторы PADI, подавлять рост опухоли in vitro. В целом, количество колоний или размеры колоний являются количественными показаниями анализа, которые можно сравнивать между контрольной и лечебной группами для оценки различий в клеточной онкогенности. Таким образом, если обнаружить, что образование колоний обратно коррелирует с увеличением концентрации препарата, то можно сделать вывод, что препарат является эффективным ингибитором онкогенности in vitro. С другой стороны, если препарат не влияет на колониеобразование, препарат либо не в подходящей дозировке, либо он не является эффективным ингибитором опухолей. Помимо использования анализа мягкого агара для проверки противоопухолевого эффекта препарата, этот анализ также может быть использован для изучения взаимосвязи между конкретным геном и онкогенезом. Например, влияние подавления экспрессии PADI2 на онкогенность может быть устранено с помощью PADI2-специфичного лечения миРНК.
PADI — это кальций-зависимые ферменты, которые посттрансляционно модифицируют белки, превращая положительно заряженные остатки аргинина в нейтрально заряженный цитруллин в процессе, известном как цитруллинирование или деиминирование3-5. Недавно мы обнаружили, что пептидиларгининдейминаза 2 (PADI2) может функционировать как новый биомаркер рака молочной железы и что ингибиторы PADI представляют собой кандидаты в методы лечения рака молочной железы на ранних стадиях. Например, ранее мы продемонстрировали, что ингибитор «пан-PADI», Cl-амидин, подавляет пролиферацию клеток рака молочной железы с помощью 2D-монослоев, и что ингибитор подавляет рост 3D-сфероидов опухолей6. В этом отчете мы расширяем эти исследования и подчеркиваем полезность анализа мягкого агара, проверяя эффективность нового ингибитора PADI, BB-CLA, в подавлении роста колоний рака молочной железыMCF10DCIS 7. Отметим, что для этого эксперимента мы использовали MCF10DCIS клетки, поскольку они являются онкогенными производными нетрансформированных клеток MCF10A человека и поскольку они содержат высокие уровни устойчивого белка PADI28. Мы предполагаем, что ферментативная активность PADI2 играет ключевую роль в онкогенности этой клеточной линии и что BB-CLA-опосредованное ингибирование активности PADI2 будет подавлять прогрессирование рака.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Получение 3% 2-гидроксиэтил агарозном
- В чистую, сухую стеклянную колбу на 100 мл, добавляют 0,9 г 2-гидроксиэтил агарозы (агарозном VII) с последующим 30 мл дистиллированной воды.
- Микроволновая печь смесь в течение 15 сек и нежно вихревой. Повторите этот шаг, по крайней мере еще три раза, пока агарозном порошок полностью не растворится.
- Автоклав, содержащий раствор бутылку в течение 15 мин.
- Разрешить раствор агарозы остыть до комнатной температуры перед дальнейшим использованием. Хранить раствор при комнатной температуре.
2. Подготовка нижнего слоя: 0,6% агарозном геле
- Предварительно теплой несколько 5 мл и 10 мл пипетки в 37 ° С инкубатор, чтобы предотвратить затвердевание агарозы в пипетку при обращении.
- Частично ослабить крышку бутылки и микроволновой печью готовые 3% 2-гидроксиэтил раствор агарозы в течение 15 сек. Затем нежно вихревой решение и микроволновая печь еще 15 сек. ВНИМАНИЕ: Будьте осторожны при закрученной AgaroРаствор существу, потому что раствор поднимается при контакте с воздухом, и может распространиться.
- Если остаточная твердый гель в бутылке, микроволновая печь на несколько секунд.
- Держите бутылку, содержащую агарозы решение в водяной бане при 45 ° в течение следующих шагов по предотвращению раствора агарозы затвердевание преждевременно.
- Теплый MCF10DCIS СМИ в С на водяной бане 37 °. Примечание: MCF10DCIS носитель состоит из DMEM / F12, 5% лошадиной сыворотки, 5% пенициллина стрептомицина.
- Передача 3 мл 3% -ного раствора агарозы с использованием подогретого пипетки в стерильный 50 мл коническую пробирку.
- Сразу добавить 12 мл теплой MCF10DCIS СМИ и аккуратно переверните коническую трубку, чтобы смешать агарозы со СМИ. Старайтесь не образуют пузырьки, как это будет мешать колонии считая позже.
- Осторожно добавляют 2 мл этой смеси в каждую лунку планшета для культивирования 6-луночный без образования пузырьков воздуха.
- Выдержите культура пластины Horizonta 6-аLLY на плоской поверхности при 4 ° С в течение 1 ч, чтобы дать смеси затвердеть.
- После того как смесь затвердеет, поместите пластину в 37 ° C инкубаторе в течение 30 мин. Нижний слой готов к использованию.
3. Подготовка клетки, содержащие слой: 0,3% агарозном геле
- Trypsinize MCF10DCIS клетки и разбавить их концентрации клеток 4 х 10 4 / мл.
- Возьмите 2 мл 3% агарозы с использованием подогретого пипеток и передать в стерильный 50 мл коническую трубку.
- Сразу добавить 8 мл MCF10DCIS СМИ конической трубе и аккуратно переверните смешать агарозы со СМИ. Избегайте образования пузырьков.
- Принимать 2 мл клеток MCF10DCIS (4 х 10 4 / мл) и обработать BB-CLA (0 мкм (ДМСО) или 1 мкМ).
- В разведении 1: 1, смесь клеток с 0,6% агарозы.
- Принимать по 1 мл смеси клеток-агарозы и осторожно добавить на нижнем слое культуральной р 6-луночногоконце (2 х 10 4 клеток / мл).
- Место культуры пластины 6-а горизонтально на плоской поверхности при 4 ° С в течение не менее 15 мин, чтобы верхний слой затвердевать.
- После того как смесь затвердеет, поместите пластину в 37 ° C инкубаторе в течение недели, прежде чем добавлять фидерного слоя.
4. Подготовка фидерного слоя: 0,3% агарозном геле
- Микроволновая печь готовые 3% 2-гидроксиэтил раствор агарозы в течение 15 сек. нежно вихревой решение и микроволновая печь еще 15 сек.
- Равновесие агарозы бутылку раствора в водяной бане при 45 ° C.
- Теплый СМИ MCF10DCIS на водяной бане 37 ° C.
- Смешайте 1 мл 3% раствора агарозы с 9 мл теплой MCF10DCIS СМИ в 50 мл коническую трубку и аккуратно переверните смешать агарозы со СМИ. Избегайте образования пузырьков воздуха.
- Treat смеси с BB-CLA (0 мкм (ДМСО) или 1 мкМ).
- Аккуратно добавить 1 мл этой смеси (без дляМин пузырьков) в каждую лунку культуральной пластины 6-луночный содержащей дно и мягкие слои.
- Место культуры пластины 6-а горизонтально на плоской поверхности при 4 ° С в течение не менее 15 мин, чтобы дать смеси затвердеть.
- После подачи слой затвердевает, поместите пластину в 37 ° C инкубатора.
- Повторите эту процедуру кормления еженедельно путем наложения 1 мл 0,3% раствора агарозы / средний / лечения на существующей фидерного слоя для пополнения клетки с новыми СМИ, пока не наблюдается образование колоний. Примечание: Агар в мягких и фидерных слоях очень мягким и, следовательно, добавлены питательные вещества из фидерного слоя будет легко диффундируют в слой клеток, содержащих достичь клетки.
5. Сбор данных
- Через 2,5 недели роста клеток в мягком агаре, подсчитывают количество колоний в каждой лунке с помощью светового микроскопа. Для облегчения количественного, распечатать сетку на прозрачности и прикрепите сетку6-луночный планшет, чтобы помочь определить, где клетки во время подсчета голосов. Так размер колонии (как количественно диаметра каждой колонии) будет изменяться, заранее определить размер опорного колоний, чтобы определить, какие колонии будет забито. Например, включают размеры колонии 70 мкм или больше, при анализе данных.
- Хранить образцы при температуре 4 ° С, чтобы предотвратить дальнейшее образование колоний и для будущего подсчета. Печать культуру пластину 6-а с парафильмом, чтобы предотвратить гели от высыхания.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Мягком агаре анализа образования колоний может быть использован для широкого диапазона приложений, документирующих онкогенность раковых клеток. Основным преимуществом этого метода является то, что полутвердой матрице избирательно способствует росту клеток, которые могут размножаться в опоре-независимым способом. Эта черта в основном выставлены раковых клеток, но не нормальные клетки. Мы в первую очередь использовать эту технику, чтобы проверить эффективность торможения роста опухоли по наркотикам и для проверки влияния ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Скорость образования колоний в мягком агаре варьируется в зависимости от типа клеток 9. Таким образом, количество клеток, чтобы начать с должны быть оптимизированы и соответствующим образом скорректированы. Предложил начать диапазон от 5 × 10 2 до 1 · 10 4 клеток на лунку, используя 6-луночный планшет. Кроме того, размер колонии изменяется в зависимости от скорости роста каждой клетки. Таким образом, предопределенный отсечки по размеру колонии необходимо, чтобы комментировать отдельные к...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарны доктору Ричарду Цериону, доктору Марку Антоньяку и Келли Салливан из Корнельского университета за предоставление технических советов, а также доктору Герлинде Ван де Валле из Корнельского университета за предоставленный ими инвертированный микроскоп Olympus CKX41.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Zeiss Axiopot | Carl Zeiss Микроскоп | 1021859251 | |
| инвертированный микроскоп | Olympus | CKX41 | |
| DMEM/F-12 | Lonza BioWhittaker | 12-719F | |
| HyClone Донор лошадиной сыворотки | Fisher Scientific | SH30074.03 | |
| Пенициллин стрептомицин | Life Technologies | 15140-122 | |
| 2-Гидроксиэтилагароза: тип VII, низкая температура гелеобразования | Sigma-Aldrich | 39346-81-1 |
Ссылки
- Hamburger, A. W., Salmon, S. E. Primary bioassay of human tumor stem cells. Science. 197, 461-463 (1977).
- Wang, L. H. Molecular signaling regulating anchorage-independent growth of cancer cells. Mt Sinai J Med. 71 (6), 361-367 (2004).
- Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease. Bioessays. 25 (11), 1106-1118 (2003).
- Horibata, S., Coonrod, S. A., Cherrington, B. D. Role for peptidylarginine deiminase enzymes in disease and female reproduction. J Reprod Dev. 58 (3), 274-282 (2012).
- Mohanan, S., Cherrington, B. D., Horibata, S., McElwee, J. L., Thompson, P. R., Coonrod, S. A. Potential role of peptidylarginine deiminase enzymes and protein citrullination in cancer pathogenesis. Biochem Res Int. , 895343(2012).
- McElwee, J. L., et al. Identification of PADI2 as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target. BMC Cancer. 12, 500(2012).
- Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition disrupts NET formation and protects against kidney, skin and vascular disease in lupus-prone MRL/lpr mice. Ann Rheum Dis. , 1-8 (2014).
- Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ. J Natl cancer Inst. 92, 1185-1186 (2000).
- Fan, D., Morgan, L. R., Schneider, C., Blank, H., Fan, S. Cooperative evaluation of human tumor chemosensitivity in the soft-agar assay and its clinical correlations. J Cancer Res Clin Oncol. 109, 23-28 (2000).
- Hamburger, A. W., White, C. P., Dunn, F. E., Citron, M. L., Hummel, S. Modulation of human tumor colony growth in soft agar by serum. Int J Cell Cloning. 1 (4), 216-229 (1983).
- Anderson, S. N., Towne, D. L., Burns, D. J., Warrior, U. A high-throughput soft agar assay for identification of anticancer compound. J Biomol Screen. 12, 938-945 (2007).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
