Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Двухфотонное изображений внутриклеточного Ca

10.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52734

⸱

10 июня 2015 г.

 ,  ,  ,  , 
1Departments of Physiology, Medical College of Wisconsin, 2Human and Molecular Genetics Center, Medical College of Wisconsin, 3Cardiovascular Center, Medical College of Wisconsin, 4Blood Research Institute of Wisconsin

В этой статье

Краткое содержание

Функция сосудистых клеток зависит от активности внутриклеточных мессенджеров. Здесь описан метод двухфотонной визуализации ex vivo, который позволяет измерять внутриклеточные уровни кальция и оксида азота в ответ на физиологические и фармакологические стимулы в отдельных эндотелиальных и гладкомышечных клетках изолированной аорты.

Аннотация

Кальций очень важный регулятор многих физиологических процессов в тканях сосудов. Большинство эндотелиальных и гладкомышечных функции сильно зависят от изменений внутриклеточного кальция ([Ca2 +] I) и оксида азота (NO). Для того, чтобы понять, как [Ca 2+] я, нет и вниз по течению молекулы обрабатываются кровеносного сосуда в ответ на сосудосуживающих и сосудорасширяющих, мы разработали новый метод, который применяется кальций-маркировку (или NO-маркировку) красители с двумя фотонов микроскопии для измерения обработку кальция (или NO) производства в отдельных кровеносных сосудов. Описанный здесь подробно, шаг за шагом процедура, которая демонстрирует, как изолировать аорты от крыс, этикетки кальция или НЕТ в эндотелиальных или гладкомышечных клеток, и изображение кальция переходные (или НЕТ производство), используя два фотона микроскоп следующие физиологические или фармакологические раздражители. Преимущества использования метода являются несколько раз: 1) это возможно одновременноелы измерения переходных кальция в обоих эндотелиальных клеток и гладкомышечных клеток в ответ на различные стимулы; 2) позволяет изображения эндотелиальных клеток и клеток гладких мышц в их родной обстановке; 3) этот метод очень чувствителен к внутриклеточного кальция или без изменений и генерирует изображения высокого разрешения для точных измерений; и 4) Описанный подход может быть применен к измерению другими молекулами, такими как активными формами кислорода. В целом, применение двух фотонов микроскопии лазерного излучения для контроля переходных кальция и не производство в эндотелиальных и гладкомышечных клеток изолированного кровеносного сосуда предоставил высококачественные и количественные данные способствовало наше понимание механизмов, регулирующих функции сосудов.

Введение

Кальций является основным вторичным посредником в сосудистых клетках, таких как эндотелиальных и гладкомышечных клеток. Это основной стимул для сокращения сосудов и играет важную роль в расширении сосудов, в том числе его последствий через NO поколения в эндотелия. Из-за ограничений технологии формирования, это было практически невозможно наблюдать обработку кальция в неповрежденной судна. Развитие двух систем визуализации фотонов и создания новой кальция или Нет маркировки красителей, делает возможным изображение на достаточной глубине и разрешения, чтобы начать понимать динамику кальция и не производство внутри сосудов.

Два фотона микроскопии недавно были применены в ткани, органы и даже целые исследования на животных из-за его превосходной способностью глубоко проникать в ткани с низкой фоновой флуоресценции и высокой чувствительностью сигнала. 1,2 узкий спектр возбуждения двух фотонов в Подсветкаионная фокусом и использование не-descanned детекторов причины, почему два фотона микроскопии превосходит традиционные конфокальной микроскопии. Конфокальной микроскопии не может производить высококачественные изображения на необходимую глубину тканей вследствие авто-флуоресценции и рассеяния из фокуса света в конфокальной обскуры. Следовательно, мы разработали метод, используя два фотона микроскоп для измерения [Ca 2+] я сигнализации и нет производства в неповрежденных, отдельных клеток кровеносных сосудов с высоким разрешением и низким коэффициентом сигнал-шум.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Экспериментальные методики, описанные ниже, были одобрены уходу и использованию комитета Институциональные животных (IACUC) в Медицинском колледже штата Висконсин в и были в соответствии с Национальными Институтами Здоровья Руководства по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Выделение аорты крыс

  1. Обезболить крыс с ИФ (5% индукции, от 1,5 до 2,5%) технического обслуживания или другой метод IACUC одобрен.
  2. Поместите крысу в положении лежа на спине. Для того, чтобы разоблачить брюшной полости, сделать небольшой вентральный срединный разрез через кожу и подкожную ткань живота. Использование марлевые подушечки аккуратно отвлечь кишечник, чтобы разоблачить аорты и полой вены, как показано на рисунке 1.
  3. Вкратце, тупым рассекать аорты от соединительной ткани и от полой вены. Использование шов, галстук аорты как можно ближе к почке. Проанализируйте около 1 - 2 см аорты и поместить его в 15 мл конической втбыть, содержащий нормальный физиологический раствор соли (PSS, в мм: 140 NaCl, MgCl 2 1.2, 2 CaCl 2, 4,5 KCl, 6 глюкозы, 10 HEPES) на льду.
  4. После того, как аорта изолированы, усыпить животное в соответствии с утвержденными протоколами IACUC. По завершении всех не-выживания процедуры эвтаназии глубоко анестезировали животных от торакотомии, вызывающего пневмоторакс, чтобы обеспечить гуманное кончину животного. 3
  5. Использование рассечение микроскоп, остроконечный пинцет, и microscissors рассекают жира и соединительной ткани от аорты. После того, как аорта чистый, разрезать продольно аорты и поместить его в PSS на льду на потом.

2. Краска Загрузка и инкубация

  1. Пипеткой 7 мкл 1 мМ Fluo-4 утра красителя, который поставляется в ДМСО основе решения, в отдельных 500 мкл труб, которые были покрыты алюминиевой фольгой. Хранить в морозильнике при температуре -20 ° С, чтобы сохранить свойства красителей с течением времени. Примечание: эти аликвоты такlutions должно быть стабильным в течение по крайней мере шести месяцев.
  2. Перед использованием, позволяют решения красителя, чтобы согреться до комнатной температуры перед открытием. Подготовьте рабочие растворы непосредственно перед использованием. Не храните разведенный реагент для последующего использования.
  3. Добавить 7 мкл готового 1 мМ Fluo-4 утра красителя, растворенного в растворе ДМСО до 450 мкл PSS, не содержащем кальция. Добавить 40 мкл ДМСО несоблюдения на основе 10% -ного раствора Pluronic кислоты в загрузочном коктейль, чтобы помочь рассеять ацетоксиметиловые (AM) эфиры и улучшить загрузку красителя кальция.
  4. Поместите расчлененный аорты в 500 мкл пробирки, содержащие загрузки коктейль (как описано в разделе 2.3) в течение 1 ч. Обложка все трубы с фольгой и поместите на вращающуюся шейкере при комнатной температуре.
  5. Чтобы контролировать NO производства в сосудистой, используйте DAF-FM диацетат краситель. Инкубируйте аорты в растворе, содержащем 450 мкл PSS 40 мкл Pluronic кислоты и 5 мкл 10 мМ DAF-FM диацетата. Подобно протоколу инкубации кальция (описано в 2.3), поместите аортыв 500 мкл раствора, содержащего трубку не-красителя, покрытый фольгой и поместите на вращающуюся шейкере в течение 30 мин при 4 ° С с последующим следующих 30 мин при комнатной температуре.
  6. При отсутствии производства не измеряется, не использовать эндотелиального NO-синтазы блокатор, L-NAME, не блокировать NO производства в качестве контроля, как показано на рисунке 4В. Для этой процедуры, добавить в коктейль (как описано в 2.5) 100 нМ L-NAME в течение последних 30 мин инкубации (при комнатной температуре).

3. Лазерное сканирование двух фотонов Протокол микроскопия

  1. После 1 ч инкубации, мыть аорты 2 - 3 раза в чистой PSS для удаления внеклеточного краситель.
  2. Перевести аорты в силиконовым покрытием блюдо, содержащей либо нормальный PSS или Ca 2+ -free буфер (зависит от экспериментального протокола). Pin аорту вниз на силиконовым покрытием с адвентиции в контакте с силиконом (т.е., эндотелиальные просвета подверженных отверстие блюдо) с использованием μ-образный булавки. Кроме того, используйте Slice ЯкорьСетка или клей, чтобы зафиксировать ткань.
    Примечание: Для того, чтобы уменьшить стресс и возможные механические артефакты, передача и исправить аорты в Са 2+ -бесплатно решение и ждать 5 - 10 минут до начала эксперимента.
  3. Подключите перистальтического насоса или шприца в силиконовым покрытием пластины для автоматического или ручного применения препаратов или изменения внеклеточного раствора.
  4. Поместите блюдо под нос кусок вертикальном два фотона микроскопом, и установить и расположить 25 × (Н.А. 1,05 и рабочее расстояние 2 мм) воды погружение объектив над образцом. Примечание: Если этот конкретный объектив не доступны, используйте цель специально изготовленного для двух фотонов изображений, потому что это может увеличить разрешение сигнала драматически сравнению с обычной цели.
  5. Активируйте двух фотонов лазера с помощью программного обеспечения (лазер начинает качать и включите). Настройтесь лазерного возбуждения до 820 нм.
  6. Использование эпифлуоресцентной, найдите аорты и сосредоточиться на целиповерхности эндотелиальных помощью грубой регулировки.
  7. Включите микроскоп в два фотона режиме лазерного сканирования, гарантируя, что лазер возбуждения режим заблокирован, не-descanned детекторы занимаются и выбросов фильтры, подходящие для спектров излучения ожидаемого установлены. Примечание: Здесь были использованы FV10-MRL / R (495 540 нм).
  8. Начало живой сканирование с использованием примерно 5% мощности лазера и точной фокусировки цели для визуализации эндотелиальные клетки.
    Примечание: эндотелиальные клетки будут демонстрировать сильный флуоресцентный сигнал при инкубации в обычном PSS. Это будет заметно слабее, когда сосуды инкубировали в бескальциевой буфера. Эндотелиальные клетки будут присутствовать в верхней части открытой аорты и гладкомышечные клетки можно увидеть чуть ниже эндотелиальных клеток (рисунок 2). Поскольку кровеносные сосуды ни гладкой, ни даже, будет места, где оба клетки гладкой мышцы и эндотелиальные клетки присутствуют.
  9. После того, как клетки находятся в фокусе, программа программное обеспечение микроскоп для сбора последовательных изображений в режиме быстрого сканирования (растрового сканирования, 512 х 512 пикселей окно с частотой кадров сбора 1,1 с). Параллельно с Fluo-4 флуоресценции AM, собирать проходящем свете изображения для того, чтобы обнаружить изменения в сужении сосудов и лучше визуализировать экспериментальные условия.
  10. После сбора исходных изображений сигнала, изменить концентрацию ионов Ca 2+ во внешнем растворе или медленно применяются фармакологические агенты по стимулированию при помощи перистальтического насоса при визуализации. Соблюдайте флуоресцентный увеличение сигнала в загруженных клеток.
    Примечание: эндотелиальные клетки реагируют на изменения расхода, при этом рекомендуется использовать низкие ламинарные приложений и тестирование автомобиля перед применением фармакологических активаторов Ca 2+ или без сигнализации. Для пересчета внутриклеточный кальций в значения концентрации нМ в сосудах, нагруженных Fluo-4 (константы диссоциации для Fluo-4 Iс 345 нМ), интенсивность флуоресценции может быть записан в начале и после того иономицина и MnCl 2. 4

4. Обработка изображений и расчеты

  1. Скачать и установить Фиджи обработки изображений пакет.
  2. Откройте файл изображения на Фиджи. По импортировать файл, разделить каналы (в проходящем свете и флуоресцентные сигналы), когда будет предложено. Используйте только флуоресцентный сигнал для анализа данных.
  3. В рамках программы Фиджи, нажмите на вкладке анализа и прокрутите вниз до опции инструментов. В опции инструментов, найти вкладку, которая говорит менеджер ROI и нажмите на нее; Появится новое окно.
  4. После этого, нажмите на набор измерений на вкладке анализа. Выберите конкретные измерения интереса. Для кальция переходных измерений, используйте опцию среднее значение серого.
  5. С круговой инструмент трассировки, начинают проследить регионы интереса (ROI) и нажмите кнопку "Добавить" на экране менеджера ROI для каждого RО.И.. После того, как все клетки интересом были прослежены в окне менеджера ROI, выберите Мульти Мера под "больше" вкладке. Запомнить либо сохранить измерения непосредственно или скопировать и вставить все эти измерения в таблицу.
  6. Открыть файл * .txt или Excel таблицы с Фиджи и передачи чисел в новый лист происхождения. Примечание: В качестве альтернативы, использовать любую программу, как Sigma участок или Prism для дальнейшего анализа.
  7. В рамках программы происхождения, использовать участок → Строка меню + Symbol наблюдать обзор всех переходных процессов. Отмените выбор негибких клетки.
  8. Пересчитать трассировки число в шкале времени (ось X), используйте столбцов → заданных значений столбцов и умножить столбец частоты сбора изображений Трейс (в нашем случае 1.1s).
  9. Использовать анализ → Статистика по строкам для всех выбранных записей для расчета среднего (ось Y) и стандартный трассировки ошибки. Участок окончательной график для текущей группы клеток Участок → Line + Symbol.
  10. МЭАп кальция переходных расчет описано, как следует.
    1. Для полного высвобождения кальция в рамках программы происхождения, нажмите на график, а затем использовать меню Analysis → исчисление → интеграции. Всего интеграл площади под кривой появляется в результатах Вход.
    2. Для переходных кинетики, нажмите на график, а затем использовать меню: Анализ → Нелинейная Кривая Fit → Выбрать набор данных (выбор оси X в пределах от максимальной до конца переходного ответ). Начните Место → Выберите функцию → экспоненциальное затухание 1 → Готово.
      Примечание: Экспоненциальная Место появляется в Graph окна и Результат журнал. Полученные данные (значения) представляют собой общее количество кальция выпущен, и кинетика каналов опосредуется переходную характеристику.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для того, чтобы точно оценить вклад кальция в сосудистой физиологии (вазодилатации и вазоконстрикции), протокол был разработан, чтобы загрузить красители кальция в обоих эндотелиальных клеток и клеток гладких мышц в изолированных неповрежденной аорты. Вообще Экспериментальная установка изображена на рисунке 1, показывает основные стратегии для изоляции и подготовке судна до визуализации. Вкратце, после выделения из аорты крысы с, он должен быть очищен от жира и соединительной ткани и разрезать в продоль...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Экспериментальная Обзор. Чтобы лучше понять вклад кальция и НЕТ сосудистой физиологии, новый метод был разработан для измерения [Ca 2+] я и НЕТ в гладких мышцах и клетках эндотелия аорты изолированных интактных. Вместе этот протокол состоит из следующих основных шагов: 1) механической изоляции и подготовка (не ферментативное расщепление) судна. Важно, чтобы ткань здоровыми и нетронутыми, насколько это возможно, чтобы получить оптимальные физиологические записи. 2) Инкубация в кальций-марки...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим доктора Уильяма Cashdollar, и Northwestern Mutual Foundation Imaging центр в крови научно-исследовательского института штата Висконсин за помощь в исследованиях изображений. Мы также благодарим доктора Дарья Ilatovskaya для критического чтения этой рукописи и полезные обсуждения. Это исследование было поддержано Национальным институтом здравоохранения грантов HL108880 (как) и DP2-OD008396 (в AMG).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DAF-FMLife TechnologiesD-23842
Fluo-4 AMLife TechnologiesF14217500 &; l in DMSO
Pluronic F-68 solutionSigma-AldrichP5556
L-NAMETocris0665
Olympus вертикальный микроскопOlympusFluoview FV1000
MaiTai HP DeepSee-OL Spectra PhysicsTi:сапфировый лазер 690 нм — 1040 нм
фильтрыOlympusFV10-MRL/R 495 до 540 нм 
25&кратный; водно-погружной объективобъектив OlympusXLPL25XWMPN.A. 1.05 и рабочий отрезок 2 мм
Срез Анкерная сетка Уорнер Инструмент SHD-27LH
Другие основные реагенты Сигма-Олдрич

Ссылки

  1. Molitoris, B. A. Using 2-photon microscopy to understand albuminuria. Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc. 125, 343-357 (2014).
  2. Burford, J. L., et al. Intravital imaging of podocyte calcium in glomerular injury and disease. J. Clin. Invest. 124, 2050-2058 (2014).
  3. Palygin, O., et al. Real-time electrochemical detection of ATP and H(2)O(2) release in freshly isolated kidneys. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 305, F134-F141 (2013).
  4. Ilatovskaya, D. V., et al. Single-channel analysis and calcium imaging in the podocytes of the freshly isolated. J Vis. Exp. In Press, (2015).
  5. Zhu, J., et al. Role of superoxide and angiotensin II suppression in salt-induced changes in endothelial Ca2+ signaling and NO production in rat aorta. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 291, H929-H938 (2006).
  6. Endres, B. T., et al. Mutation of Plekha7 attenuates salt-sensitive hypertension in the rat. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 12817-12822 (2014).
  7. Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2. Nature. 318, 558-561 (1985).
  8. Mansfield, J., et al. The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy. J. Anat. 215, 682-691 (2009).
  9. Sathanoori, R., et al. Shear stress modulates endothelial KLF2 through activation of P2X4. Purinergic Signal. 11, 139-153 (2015).
  10. Hall, A. M., Molitoris, B. A. Dynamic Multiphoton Microscopy: Focusing Light on Acute Kidney Injury. Physiology. 29, 334-342 (2014).
  11. Campese, V. M. Salt sensitivity in hypertension. Renal and cardiovascular implications. Hypertension. 23, 531-550 (1994).
  12. Cowley, A. W. Genetic and nongenetic determinants of salt sensitivity and blood pressure. Am. J. Clin. Nutr. 65, 587S-593S (1997).
  13. Flister, M. J., et al. Identification of hypertension susceptibility loci on rat chromosome 12. Hypertension. 60, 942-948 (2012).
  14. Flister, M. J., et al. Identifying multiple causative genes at a single GWAS locus. Genome Res. 23, 1996-2002 (2013).
  15. Mattson, D. L., et al. Genetic mutation of recombination activating gene 1 in Dahl salt-sensitive rats attenuates hypertension and renal damage. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 304, R407-R414 (2013).
  16. Rudemiller, N., et al. CD247 modulates blood pressure by altering T-lymphocyte infiltration in the kidney. Hypertension. 63, 559-564 (2014).
  17. Flister, M. J., et al. CXM - a new tool for mapping breast cancer risk in the tumor microenvironment. Cancer Res. 74, 6419-6429 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Двухфотонное изображений внутриклеточного Ca
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.