Методическая статья

Количественный анализ восхождение дефектов в Drosophila модели нейродегенеративных расстройств

DOI:

10.3791/52741

⸱

13 июня 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, University of Alberta, 2Montreal Neurological Institute and Hospital, McGill University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем оптимизированный, недорогой и надежный отрицательный геотаксис-анализ у Drosophila melanogaster в качестве модели нейродегенеративных заболеваний. Будучи более чувствительным к легким дефектам опорно-двигательного аппарата, этот анализ поможет выявить потенциальные генетические взаимодействия и мишени для лекарств.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Двигательного дефекты в результате нейродегенеративных расстройств может быть позднее начало симптом болезни, после многих лет субклинического дегенерации, и, таким образом, текущие терапевтические стратегии лечения не лечебная. Благодаря использованию всей ExoME последовательности, большее число генов были идентифицированы, чтобы играть роль в локомоции человека. Несмотря идентификации этих генов, не известно, как эти гены имеют решающее значение для нормального функционирования опорно-двигательного. Таким образом, надежность анализа, который использует модели организмов для выяснения роли этих генов с целью выявления новых целей терапевтического интереса, нужен более чем когда-либо. Мы разработали сенсибилизированной версию отрицательные geotaxis анализа, который позволяет для обнаружения дефектов мягких ранее и имеет возможность оценить эти дефекты с течением времени. Анализ проводят в стакане градуированный цилиндр, который герметизируют с помощью воска барьерной пленки. При увеличении порогового расстояния для поднялась до 17,5 См и увеличение продолжительности эксперимента до 2 мин, мы наблюдали большую чувствительность при обнаружении мягкий дисфункций мобильности. Анализ является экономически эффективным и не требует интенсивную подготовку, чтобы получить высокую воспроизводимость результатов. Это делает его отличной техникой для скрининга лекарств-кандидатов в Drosophila мутантов шагающих с дефектами.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Разрушительные нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз, и наследственной спастической параплегии все чаще признается. К сожалению, большинство из этих нейродегенеративных расстройств по-прежнему не лечения. Широкое распространение клиническое применение генома, объективных генетических тестов, таких, как весь ExoME последовательности привело к увеличению числа генов в причастности локомотивных расстройств человека. Несмотря на этот прогресс, патологическая прогрессии от раннего к поздних стадиях, остается неуловимым в этих расстройств. Дрозофилы обеспечивает один с генетическими инструментов для изучения требование гена в контролируемой пространственной и временной основе. Кроме того, дрозофилы оказался полезным для скрининга лекарств для неврологических заболеваний, таких как болезнь Паркинсона 1, болезнь Альцгеймера 2, интеллектуальной инвалидности 3,4 и 5,6 эпилепсии среди других. Наша цель в том, чтобы разработать экономически эффективными надежный анализ, который позволит высокого анализ пропускной что все равно будет достаточно чувствительным, чтобы обнаружить небольшие изменения в производительности двигателя.

Есть несколько анализы, используемые для количественной оценки последствий генетической мутации и / или состояния окружающей среды на поведение альпинистской Drosophila. Большинство анализов выгоду из естественной склонности мух расти, известных как отрицательные geotaxis или подъемного анализа. Бензер 7 предложил в 1967, что противоток Устройство, используемое для изучения фототаксиса также может быть использован для изучения gravitaxis. С тех пор, Ганецкий 8 и многие другие 9 -12 построили на начальном анализе. Принцип заключается в размещении известное число мух в ампулу и нажмите флакона твердо на твердую поверхность, в результате чего мухи, чтобы упасть на дно флакона. Как это врожденное поведение, мухи будут пытаться подняться на верхней части флакона, против силы тяжести. Этот анализ количественных и measuRES сколько мухи поднялись мимо маркера на флаконе во время, отведенное период времени. Измерение скорости вместо общего числа мух восхождения стал надежным параметром и показали дефекты в тех случаях, когда количество мух критериев не было значительным 13.

Лазание анализа оказалось полезным при изучении многих нейродегенеративных расстройств, включая болезнь Паркинсона 14. Тем не менее, мы отметили, что локомотив дефекты не могут быть обнаружены во время, когда нейродегенерация уже видели в патологических исследований 14. Таким образом, использование традиционных анализа может ограничить способность к обучению на ранних стадиях патогенеза заболевания. Появление дефектов опорно-двигательного аппарата в течение более поздних стадиях патологии может отражать заболевание, прогрессирование слишком передовые для полного спасения.

Это поднимает потенциальную проблему с чувствительностью традиционной восхождение анализа. Потенциал неспособность традиных восхождение анализа для обнаружения дефектов мягких локомотива может быть связано с высоты, на которую мухи требуемой подниматься. Традиционные анализа 15,16 измеряет количество мух успешно подняться над высоту от 2 до 5 см от 10 до 20 сек.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследование дрозофилы было в соответствии с университетом научно-исследовательских принципов Альберты.

1. Fly Коллекция

  1. Соберите 20 мух, используя СО 2 (г) обезболивание и место в 25 мм х 95 мм сбора флакон, содержащий пищу.
  2. Хранить флаконов, содержащих мух горизонтально, чтобы избежать захвата мух в любых жидкостей, которые могут накапливаться в нижней флакон.
  3. Инкубируйте мух в течение по крайней мере 21 часов при 22 ° С в 45% -ной влажности в инкубаторе в течение приблизительно 15 ч. Установите инкубатор с 12 ч свет: темнота цикла.

2. Восхождение Анализ

  1. На следующее утро, 20 передачи мух от одного флакона в стакан 250 мл мерный цилиндр. Отметьте положение цилиндра держать его постоянное каждый день. Используйте один стеклянный цилиндр, на генотип, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение между генотипами. Промыть в конце каждого эксперимента и роТейт их между генотипами.
    1. Проведение экспериментов в окружающего света (или красный свет, если существует потенциальная дефект в видении) при температуре и влажности 22 ° С и 40% соответственно. Чтобы избежать циркадный ритм посрамить всегда проводить эксперименты в то же время суток.
  2. Печать на вершину цилиндра с барьерной пленки (восковой пленки), чтобы предотвратить утечку любых мух (рис 2).
  3. Установите видеокамеру на штативе. Фокус камеры на 190 мл линии 250 мл мерный цилиндр (17,5 см).
  4. Подсчитайте число мертвых мух в нижней части цилиндра и в пищевой флаконах. Запишите этот номер как смертности.
  5. Очень слегка постучите цилиндр от закрытой пены ячейки площадку многократно с достаточно сил, чтобы вытеснить мух с внутренней нижней поверхности. Нажмите 5 - 10 раз, а другой рукой нажать запись на камере.
  6. Нажмите кнопку "Запись" на камере.
  7. Начните VIDео записи камеры и нажмите цилиндр шесть раз в отдельном без ритмического рисунка.
  8. Провести испытание каждый в течение 2 мин с момента мухи в прошлом постучал и записывать количество мух, пересекающих высоту 17,5 см (190 мл) в каждый момент времени, выбранного (количественно каждые 10 сек). Примечание: маркировка на мл цилиндра будет варьироваться от одной модели к другой цилиндра в зависимости от диаметра. Чтобы избежать ошибки, измерить высоту на каждом цилиндре используется.
  9. После того, как суд закончился, избавиться от мух в 95% этанола.
  10. Повторите шаги 2.1 до 2.9, пока все дублированные не были проверены со свежими мух каждый раз.
    Примечание: Несмотря на то, 5 повторов может быть достаточно с мутацией, имеющих сильное влияние на передвижение, 10 биологических повторностях 20 мух (200) мух рекомендуется для обнаружения мелких различий.
  11. По окончании эксперимента, мыть цилиндры в лабораторном посудомоечной машиной и сухой O / N, чтобы использовать повторно.

3. Анализ

  1. АнаZE видео каждый летать суда. Каждый 10 сек, записывать общее количество мух, которые проходят целевой линии.
    1. Если муха лезет обратно или падает, запись летят, как -1 и рассчитывать на следующий муху пересечь целевой линии, как тот же номер лету, что поднялся обратно или упал. Например, если 15-й муха падает ниже целевой линии, рядом муха, чтобы пересечь линию (16-й летать) считается 15-й муха, а не 16-го.
  2. Вычитание смертности от общего количества мух (20), чтобы получить количество мух, которые остаются в испытании. В каждый момент времени, получить фракцию пролетает над целевой линии.
  3. Участок каждый процент на каждый момент времени (рисунок 3).
  4. Анализ производительности в точке данных 120 сек и выполнять Стьюдента при 2 группы присутствуют или ANOVA и пост-тест для множественных сравнений (с Бонферрони модификации для плановых и внеплановых Тьюки для сотрудничестваmparisons). Колмогорова-Смирнова тесты 17 также выполняется, чтобы установить нормальность и равного дисперсию, но также сравнить распределения мутантного группы контроля.
  5. Представить данные по старению, построить процент мух восхождение на 120 сек с мухами разных возрастов (2 дня, 1 неделю, 2 недели), чтобы увидеть, если есть прогрессивная дефицит (Рисунок 4).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Восхождение сильным и воспроизводимые поведение. Действительно, в один прекрасный день старые мухи дикого типа достичь целевого расстояния производительность скалолазания быстро (25 - 30 сек). Мутант летает представить диапазон характеристик от легкой (или с задержкой), чтобы завершить неспособность подняться к цели. Проиллюстрируем это здесь с двумя различными мутантных аллелей. Первый тяжелый аллель гена spastin вызванной полной делеции гена spastin (Курорты и велнесс 5.75) 18. В этой строке (Курорты и велн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дрозофилы уже доказано, отличная модель в болезни 14 и других нейродегенеративных условий 1,2 Паркинсона. В дополнение к генетических инструментов, доступных в Drosophila, его геном высоко консервативен для генов, вовлеченных в неврологических расстройств 19. Появление генома широких методов генетического скрининга (в том числе всей ExoME последовательности), скорее всего, по-прежнему обеспечивают больший список генов-кандидатов, связанных с нарушениями двигательных чел...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа поддержана грантом команды Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR) доктору Болдуку (co-PI) и доктору Ги Руло (PI). Мы хотели бы поблагодарить доктора Оксану Суховерски, доктора Кэтрин Тодд, членов клуба полетов Университета Альберты и доктора Клейтона Диксона за помощь в разработке метода и статистическом анализе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ПодвоиПодвои подбираются в зависимости от проводимых экспериментов. Температура и влажность в помещении и в инкубаторе должны контролироваться и быть постоянными, чтобы мухи не были слишком статичными или слишком влажными.
Видеокамераподойдет любой цифровой видеокамере. Убедитесь, что они могут сфокусироваться на близком объекте.
Градуированный цилиндрKimble20028WРазные модели градуированных цилиндров могут иметь разный диаметр. Поэтому важно измерить высоту.
КомпьютерПодойдет любая модель. Мы использовали компьютер для наблюдения за подъемом мух и записи количества мух в каждой временной точке.
дрозофил

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Auluck, P. K., Bonini, N. M. Pharmacological prevention of Parkinson disease in Drosophila. Nature medicine. 8, 1185-1186 (2002).
  2. Bonini, N. M., Fortini, M. E. Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila. Annual review of neuroscience. 26, 627-656 (2003).
  3. Bolduc, F. V., Bell, K., Cox, H., Broadie, K. S., Tully, T. Excess protein synthesis in Drosophila fragile X mutants impairs long-term memory. Nature neuroscience. 11, 1143-1145 (2008).
  4. McBride, S. M., et al. Pharmacological rescue of synaptic plasticity, courtship behavior, and mushroom body defects in a Drosophila model of fragile X syndrome. Neuron. 45, 753-764 (2005).
  5. Parker, L., Padilla, M., Du, Y., Dong, K., Tanouye, M. A. Drosophila as a model for epilepsy: bss is a gain-of-function mutation in the para sodium channel gene that leads to seizures. Genetics. 187, 523-534 (2011).
  6. Marley, R., Baines, R. A. Increased persistent Na+ current contributes to seizure in the slamdance bang-sensitive Drosophila mutant. Journal of neurophysiology. 106, 18-29 (2011).
  7. Benzer, S. Behavioral Mutants Of Drosophila Isolated By Countercurrent Distribution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 58, 1112-1119 (1967).
  8. Ganetzky, B., Flanagan, J. R. On the relationship between senescence and age-related changes in two wild-type strains of Drosophila melanogaster. Experimental gerontology. 13, 189-196 (1978).
  9. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
  10. Toma, D. P., White, K. P., Hirsch, J., Greenspan, R. J. Identification of genes involved in Drosophila melanogaster geotaxis, a complex behavioral trait. Nature genetics. 31, 349-353 (2002).
  11. Inagaki, H. K., Kamikouchi, A., Ito, K. Methods for quantifying simple gravity sensing in Drosophila melanogaster. Nature protocols. 5, 20-25 (2010).
  12. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
  13. Botella, J. A., et al. The Drosophila carbonyl reductase sniffer prevents oxidative stress-induced neurodegeneration. Current biology : CB. 14, 782-786 (2004).
  14. Feany, M. B., Bender, W. W. A Drosophila model of Parkinson's disease. Nature. 404, 394-398 (2000).
  15. Chakraborty, R., et al. Characterization of a Drosophila Alzheimer's disease model: pharmacological rescue of cognitive defects. PLoS One. 6, e20799(2011).
  16. Orso, G., et al. Disease-related phenotypes in a Drosophila model of hereditary spastic paraplegia are ameliorated by treatment with vinblastine. J Clin Invest. 115, 3026-3034 (2005).
  17. Lehmann, E. L., D'Abrera, H. J. M. Nonparametrics : statistical methods based on ranks. , 1st edn, Springer. (2006).
  18. Sherwood, N. T., Sun, Q., Xue, M., Zhang, B., Zinn, K. Drosophila spastin regulates synaptic microtubule networks and is required for normal motor function. PLoS biology. 2, e429(2004).
  19. Inlow, J. K., Restifo, L. L. Molecular and comparative genetics of mental retardation. Genetics. 166, 835-881 (2004).
  20. Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in Drosophila. Genetics. 161, 1197-1208 (2002).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Climbing AssayDrosophila ModelNeurodegenerative DisordersNegative GeotaxisVideo AnalysisGlass Graduated CylinderWax Barrier FilmFly MortalityTime Point RecordingCandidate Drug Screening

Похожие статьи