Оценка эндотелиальной миграции клеток после воздействия токсичных химических веществ

Краткое содержание

Исследование ранней миграции эндотелиальных клеток (ЭЭК) важно для понимания патофизиологии некоторых заболеваний и потенциального определения новых стратегий терапевтического вмешательства. В следующем протоколе описаны методы оценки миграции клеток, которые были адаптированы для исследования ЭЭК.

Аннотация

Воздействие химических веществ (в том числе алкилирующих агентов химического оружия, как серы и азота горчицы) вызывают множество клинических симптомов, включая заживления ран расстройства. Физиологический процесс заживления ран является очень сложным. Формирование грануляционной ткани является ключевым шагом в этом процессе, в результате предварительного закрытия раны и обеспечивая сеть новых капиллярных кровеносных сосудов - либо через васкулогенеза (образование роман) или ангиогенез (прорастание существующих судов). Оба vasculo- и ангиогенез требует функциональной, направленную миграцию эндотелиальных клеток. Таким образом, исследование раннего эндотелиальных клеток (ЕЭС) миграции важно понимать, патофизиологии химически индуцированных расстройств заживления ран и потенциально идентифицировать новые стратегии для терапевтического вмешательства.

Мы оценили ухудшение заживления ран после алкилирования экспозиции агента и проходят потенциальных соединений-кандидатов для трeatment. Мы использовали набор методов, описанных в данном протоколе. Модифицированный Бойден камеру количественно исследовать хемокинез из ЕЭС описано. Кроме того, использование заживления раны анализа в сочетании с анализом трека качественно оценить миграцию показано. Наконец, мы демонстрируем использование TMRM флуоресцентный краситель для исследования митохондриальной мембраны потенциала для выявления основных механизмов возмущенного миграции клеток. Следующий протокол описывает основные методы, которые были адаптированы для расследования ЕЭС.

Введение

Миграция клеток важно во многих физиологических и патофизиологических процессах, включая развитие различных заболеваний, и заживления ран после повреждения кожи.

После травмы кожи, воспаление снимает повреждены или некротических тканей и грануляции дисководов предварительный закрытие раны и позволяет формирование сети новых капилляров через васкулогенеза (роман образование) или ангиогенез (прорастание существующих пузырьков) ^1-3. Оба vasculo- и ангиогенез требует миграцию эндотелиальных клеток. Растущая сеть кровеносных сосудов необходимо транспортировать кислород и питательные вещества пролиферирующих кератиноцитов, которые, в конечном счете подвергаются кератинизации, сформировать новый эпителий и обеспечить закрытие раны.

Нарушение миграции эндотелиальных клеток основной причиной заживления раны расстройства ^4,5. Таким образом, методы оценки миграции эндотелиальных клеток начале необходимо исследовать pathophysiolлогии нарушений клеточной миграции и выявить новые стратегии для терапевтического вмешательства.

Кожные воздействие алкилирующих агентов (например, серы и азота горчицы) вызывает заживление ран расстройства ^6. Такие соединения были использованы в качестве боевых отравляющих веществ в несколько конфликтов в 20 веке и остается причину сильного беспокойства из-за существующих запасов в политически нестабильных регионах и относительно простым синтезом. Хотя иприт был впервые синтезирован в 1822 году, молекулярной и клинической патологии воздействия SM не понимать в деталях и не противоядие воздействия SM выявлено не было.

Несколько исследований были проведены, чтобы понять и смоделировать ухудшение заживления ран после воздействия SM и проверить потенциальных кандидатов, способных соединений резервирования, что эффект. Шмидт и др. (2009) исследовали влияние хлорамбуцилом, алкилирующего соединения со свойствами, аналогичными СМ в муSE модели эмбриоидного тела и обнаружили значительное, иногда снижение образования сосудов ⁷ больше, чем 99%. Этот неблагоприятный эффект наиболее выражен на этапе развития, который, в физиологических условиях, доминируют в пролиферации и миграции эндотелиальных клеток-предшественников. Таким образом, эти клетки были идентифицированы, чтобы быть особенно чувствительны к алкилирующих агентов. Steinritz и др. (2010) протестированы поглотители активных форм кислорода (АФК), в частности, N-ацетилцистеин (NAC) и альфа-линоленовой кислоты (АЛК) за их способности снижать токсичность SM в мышиных моделях эмбриоидного тела и, в частности, к восстановить образование сосудов ^8. Временные защитные эффекты наблюдались, указывая, что избыточное образование АФК, вероятно, внести свой вклад в неблагоприятных эффектов СМ на заживление. Эти эффекты не являются постоянными, а два соединения-кандидаты могут быть не способны восстановить образование сосудов и заживлению ран в перспективе ^8. Howeveг, эти эксперименты были проведены в сложной 3D модели, которая позволит сделал исследование миграции клеток. Таким образом, мы в дальнейшем проходят NAC и ALA для благотворного воздействия на клеточную миграцию ЕЭС, которые имеют ключевую роль в процессе формирования сосуда ^9.

Кроме того, есть свидетельства, что ячейки полярность необходима для миграции клеток. Митохондриальной дисфункцией приводит к образованию активных форм кислорода было показано, ухудшает клеточной полярности и, таким образом, может неблагоприятно повлиять на миграцию клеток. Таким образом, живой клетки визуализации с учетом функции митохондрий проводили и эффекты АФК поглотители были исследованы. Следующий протокол описывает общие требования к выращиванию ЕЭС, камерный анализа Бойден, заживления ран анализа, включая анализ отслеживания клеток и использования TMRM для оценки митохондриальной функции в деталях. Важные аспекты экспериментальных протоколов для выращивания EEC и миграции будут выделены.

Протокол

Следующий протокол описывает методы для исследования ранней миграции эндотелиальных клеток. Надлежащее культивирование эндотелиальных клеток сосудов требуется предварительное покрытие из клеточной культуры колбы с желатином, чтобы обеспечить надлежащее пролиферацию и поддержание эндотелиальных фенотипа.

1. Предварительная покрытие клеточной культуры контейнерах

1. Растворить желатин в 0,1 М PBS до конечной концентрации 0,1%.
2. Автоклав решение с параметрами для жидкого автоклаве (подробнее см инструкции конкретного автоклава).
3. Добавить достаточный объем автоклавного раствора желатина в стерильную колбу для культивирования клеток (например, по крайней мере, 5 мл колбу для культивирования клеток, Т25).
4. Передача колбы в термостате (37 ° С, 5% СО ₂ не требуется, но не мешает) в течение по крайней мере 30 мин.
5. Удалите остатки раствора желатина. Используйте предварительно покрытых колб впоследствии (см выращивание клеток) или сразорвал в стерильных условиях до использования.

2. Сотовый Выращивание ранних эндотелиальных клеток

Примечание: Эмбриональные стволовые клетки получены первые эндотелиальные клетки (EEC) были получены из дифференцированных мышиных эмбриональных органов магнитным активирована сортировки клеток на РЕСАМ-1 положительной клеточной фракции, как описано ранее ^10,11.

1. Культура EEC на покрытые желатином чашки для культивирования клеток в среде DMEM, дополненной 15% FCS, 50 ед / мл пенициллина, 50 U / мл стрептомицина, 200 мкМ L-глутамина, 100 мкМ бета-меркаптоэтанол и 1% заменимых аминокислот. Ручка клетки в стерильных условиях. Выращивают клетки с 5% CO ₂ при 37 ° С и 95% влажности до суб-слияния (макс. 80%).
2. В суб-слияния, разделения клетки на соотношении 1: 5. Примечание: Отряд эндотелиальных клеток важный шаг.
   1. Урожай клетки с РТ Accutase. Удалить СМИ, промыть PBS и добавить 1 мл Accutase на 25 см ^2.
   2. Инкубируйте колбы при комнатной температуре в течение 2-10 мин до тех пор, пока клетки не были отключены. Дисперсные клеток и передать их в нужное приложение. Примечание: химическая нейтрализация Accutase не требуется, как это имеет место, когда отобранные клетки хранятся в инкубаторе при 37 ° С. Тем не менее, Accutase активность также может быть уменьшен путем добавления DMEM, содержащей FCS.

3. Бойден палата

Примечание: Бойден камеры анализы были осуществлены с помощью системы вставки светло-непрозрачным полиэтилентерефталата с размером пор 8 мкм.

1. Предварительно смажьте фильтр вставки (что подходит для культивирования клеток внутри скважин, таким образом, создавая камеру Бойдена), добавив 500 мкл 0,1% желатина, растворенного в 0,1 М PBS в течение по крайней мере 30 мин.
2. Если клетки подвергаются воздействию токсичных химических веществ, не подвергайте зависимости от конкретного эксперимента до сбора клеток. Примечание: Клетки подвергаются до 12,5 мкг хлорамбуцилом / мл DMEM,в течение 24 ч. Что касается конкретного эксперимента, инструкции могут различаться.
3. Урожай ЕЕС и определения количества клеток с помощью подсчета клеток камеру. Примечание: Автоматический подсчет устройства могут быть использованы, но они должны быть использованы с осторожностью: подсчет клеток руководство является более точной, и настоятельно рекомендуется.
4. Добавить 500 мкл клеточную культуральную среду в нижнюю камеру отсеке Бойденом палаты.
5. Добавить точно 10 ⁴ ЕЭС в 500 мкл клеточной культуральной среды на фильтрующего в верхней палате отделения. Устранить пузырьки.
6. Инкубируйте фильтрующие элементы в инкубаторе в течение ровно 8 часов.
7. Промыть PBS один раз и заменить жидкость с 0,5 мл 4% параформальдегида в обоих отсеках в течение 25 мин для фиксации клеток. Промойте фильтр широко, но, по крайней мере 3 раза с 0,1 М PBS.
8. Акцизный мембраны с помощью скальпеля.
9. Установите мембрану между двумя стеклянная крышка скользит с монтажной среде, содержащей DAPI ядерной staininг. Обратите внимание на ориентацию. Убедитесь, что только клетки, которые мигрировали к нижней камере стороне мембраны подсчитываются.
10. Количество клеток, которые мигрировали к нижней камере стороне мембраны с флуоресцентным микроскопом при 400-кратном увеличении. Не путайте мембранные поры мигрировавших клеток (рис 1А, 1Б). Исследуйте разумное количество биологических повторяет (по крайней мере, 3 биологических повторяет в состоянии).

4. заживления ран Анализ

1. В зависимости от имеющегося оборудования, тщательно выбирать культуре клеток блюда или тарелки: При использовании DIC микроскопии, избежать пластиковой поверхности на основе культуры блюда или тарелки, но также использовать устройства, основанные стекла вместо этого.
   Примечание: При использовании фазово-контрастной микроскопии, пластиковые, блюд также могут быть использованы.
2. Развивайте ЕЭС в устройстве подходит для культивирования клеток (например, 4 см со стеклянным дном чашки Петри подходит для изображений живых клеток) До 80% слияния. Важно: не культивировать клетки для завершения слияния.
3. Потрите монослоев с стерильные 10 наконечников пипеток мкл. Нажмите наконечник осторожно без слишком большого давления на поверхности посуды и переместить его по прямой линии плавно от одной стороны к other.Wash клетки дважды 0,1 М PBS, чтобы удалить отдельные клетки.
4. Добавить достаточный объем среды в чашку с культурой. Если это применимо, добавить соединения, которые должны быть исследованы.
   Примечание: 1,5 мл среды, содержащей 15 нг / мл был добавлен альфа-линоленовой кислоты.
5. Установите культуры блюдо под микроскопом, способным изображений живых клеток. Убедитесь 5% CO _2, 37 ° C и влажной атмосфере.
   Примечание: увлажнение особенно важно, чтобы избежать испарения среды.
6. Приобретать покадровой изображения в течение 24 часов при 10-минутными интервалами. План больших размеров файлов. Примечание: разрешение 512 х 512 пикселей, как правило, достаточно; Однако, мы рекомендуем использовать изображения, по меньшей мере 1024 х 1,024.
7. Измерьте ширину зазора при Т = 0 ч и при Т = 24 ч, используя длины инструмента программного обеспечения, предоставляемого с микроскопом или использовать с открытым исходным кодом (например, ImageJ). Примечание: В общем конкретного приобретения и анализа изображений программное обеспечение предоставляется производителем. Таким образом, для технических деталей в отношении использования программного обеспечения, обратитесь к руководству.

Отслеживание 5. Сотовый

1. В зависимости от имеющегося оборудования, тщательно выбирать культуре клеток блюда или тарелки: При использовании DIC микроскопии, избежать пластиковой поверхности на основе культуры блюда или тарелки, но также использовать устройства, основанные стекла вместо этого.
   Примечание: При использовании фазово-контрастной микроскопии, пластиковые, блюд также могут быть использованы.
2. Семенной 5 х 10 ⁴ ЕЕС в дополненной среде DMEM в устройство подходит для культивирования клеток (например, 24-многоямный пластины) и культивировать клетки с 5% CO ₂ при 37 ° С и 95% влажности в течение 1-2 дней.
3. Когда клетки выросли до 80% Слияния, удалить средства массовой информации и культуры клеток с новыми медиа в присутствии соответствующих испытаний веществ (например, 12,5 мкг хлорамбуцилом / мл DMEM),. Всегда включать контрольные клетки (обработанные в растворителе, например, этаноле) при температуре 37 ° С в течение определенного периода времени (24 ч, в зависимости от индивидуальной системы анализа).
4. Установите культуры блюдо под микроскопом, способным живого изображения клеток (37 ° С, 5% СО ₂ и 95% влажности). Приобретать покадровой изображения в течение 24 часов в заданных интервалах. Получение изображений на 10-минутные интервалы.
5. Выполните вручную отслеживание ЕЭС с использованием плагина ImageJ MTrackJ. Выберите 10 ячеек случайным образом из поля зрения и отслеживать их перемещения, добавив точку данных за момент времени с помощью команды из MTrackJ "Добавить".

Примечание: MTrackJ предоставляется бесплатно в течение и ImageJ в зонах [Meijering, Mtrackj "http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/".]ле на [Расбанд, ImageJ ". http://rsbweb.nih.gov/ij/"]. Подробное руководство о плагине MTrackJ доступна на "http://www.imagescience.org".

6. живых изображений сотовый / Оценка митохондриальной мембраны Потенциал

1. Развивайте ЕЭС в подходящей для культивирования клеток устройства (например, 4 см со стеклянным дном чашки Петри подходит для изображений живых клеток) до 80% слияния.
   Важно: Не культивировать клетки для завершения слияния.
2. Если применимо, подвергать клетки к воздействию химических веществ. Примечание: Клетки подвергали воздействию 12,5 мкг / мл хлорамбуцил в течение 24 ч. Что касается конкретного эксперимента, инструкции могут различаться.
3. Подготовка 10 мМ исходного раствора тетраметилродамин (TMRM) в ДМСО. Защищать от света. Примечание: Исходный раствор можно хранить при -20 ° С.
4. Развести маточного раствора в клеточной культуральной среде для рабочего раствора с концентрацией 10 мкМ (1: 1000 разведение). Защищать от светаи использовать как можно скорее. Примечание: рабочий раствор может храниться при комнатной температуре в течение некоторого времени (> 1 ч), однако, подготовка свежего рабочего раствора рекомендуется.
5. Добавьте 2 мкл рабочего раствора до 1 мл свежей среды для культивирования клеток (загрузки раствора).
6. Загрузка клеток путем замены клеточную культуральную среду с загрузкой раствора. Инкубируют в течение 15 мин при 37 ° С, 5% СО ₂ и влажной атмосфере (инкубатор). Внимание: Почти все показатели флуоресценции экспортируются живых клеток с течением времени; Поэтому избегайте длительного загрузку или задержки анализа.
7. Без мытья, разместить блюдо под микроскопом подходит для изображений живых клеток. Важно: показатели флуоресценции очень чувствительны к свету, поэтому, во избежание ненужного воздействия света.
8. Получение изображений без изменения параметров измерения для обеспечения сопоставимости между различными изображениями.

Результаты

Кожные воздействие алкилирующих агентов вызывает эритему, образование пузырей и кожной язвы, связанный с заживления ран расстройства. Заживление ран требует ангио- и васкулогенез которые основаны на миграции эндотелиальных клеток. Количественное миграции могут быть оценены с использованием камеры анализа Бойденом. Как показано на рисунке 1С воздействия на ЕЭС алкилирующего агента хлорамбуцил привело к значительному снижению клеточной миграции ^9. Добавление РОС-поглотитель альфа-линоленовой ки...

Обсуждение

Кожные воздействие токсичных химических веществ часто приводит к тяжелым расстройством заживления ран. Основные механизмы в значительной степени неизвестны. Заживление ран представляет собой сложный процесс, который состоит из различных фаз (гемостаз, воспаление, пролиферация и ремоделирования). Миграция клеток участвует в каждой фазе, однако, имеет первостепенное значение для формирования грануляционной ткани. Здесь новые кровеносные сосуды формируются либо ангио- или васкулогенеза.

Оба про...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Палата Бойдена
Вставки Corning FluoroBlok для обработки культуры тканей (TC), 24 лунки - 3 &; m	Corning Incorporated	#351151
Вставки Corning FluoroBlok, обработанные культурой тканей (TC), 24 лунки - 8 &; m	Life Sciences	#351152
(для использования с Falcon Insert 24 лунки Companion Plate (353504)
Ран  заживляющий анализ
Стеклянные донные тарелки	Word Precision Instruments, Inc.	#FD35-100
Оценка митохондриального потенциала
TMRM (метиловый эфир тетраметилродамина)	Life Technologies	#T669
Клеточная культура
Accutase	PAA, Пашинг, Австрия#	L11-007
α-Линоленовая кислота	Fluka (Sigma), Steinheim, Германия	# L2376
Chlorambucil	fluka (Sigma), Steinheim, Германия#	23125
Желатин	Sigma-Aldrich, Steinheim, Германия	# G2500-100G