Методическая статья

Метод измерения активности ферментов Deubiquitinating в клеточных линиях и образцы тканей

DOI:

10.3791/52784

⸱

10 мая 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, University of Minnesota, 2Institute for Translational Neuroscience, University of Minnesota, 3Department of Obstetrics, Gynecology, and Women’s Heath, University of Minnesota, 4Masonic Cancer Center, University of Minnesota

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Текущий протокол детали метод для измерения активности функционально гомологичны deubiquitinating ферментов. Специализированный зонды, ковалентно модифицировать фермент и позволяют для обнаружения. Этот метод имеет потенциал для выявления новых терапевтических мишеней.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Система убиквитин-протеасомный недавно был вовлечен в различных патологий в том числе нейродегенеративных заболеваний и рака. В свете этого, методы для изучения механизма регулирования этой системы имеют важное значение для выяснения клеточных и молекулярных процессов вышеупомянутых заболеваний. Использование гемагглютинина получены убиквитиновых зондов, описанных в этой статье служит ценным инструментом для изучения этой системы. В этом документе подробно описывается метод, который позволяет пользователю выполнять анализы, которые дают прямой визуализации deubiquitinating активность фермента. Deubiquitinating ферменты борьбы с деградацией протеасомной и поделиться функциональную гомологию в их активных сайтов, что позволяет пользователю исследовать деятельность нескольких ферментов в одном анализе. Лизаты получают посредством разрушения нежной механической клеток и инкубировали с активным сайтом направленных зондов. Функциональные ферменты помечены с зондами, а неактивные ферменты остаются несвязанными. По ходуНин этот анализ, пользователь получает информацию как о деятельности и потенциальных выражения нескольких deubiquitinating ферментов в быстрой и легкой манере. Нынешний метод является значительно более эффективным, чем при использовании отдельных антител для предсказанных сто deubiquitinating ферментов в клетке человека.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Система убиквитин-протеасомный (ИБП) служит одним из основных путей деградации в клетке млекопитающего. Основания, связанные деградации в протеасоме ковалентно помечен полимеров убиквитином (UB) 1. Перед мишенью субстрат поступает в протеасомы для деградации, поли-убиквитин метка должна быть удалена. Класс ферментов, известных как deubiquitinating ферменты (DUBs) несет ответственность за удаление и утилизацию молекул убиквитиновых 2. Было предсказано, из генома человека, что почти в сто DUBs, работающие в клетке 3. При таком большом количестве Dubs контролирующих Ub-клеточные процессы, опосредованные, изучение этих ферментов представляет собой сложную задачу, поскольку методы мРНК не дают информацию о деятельности и вестерн-блоттинга только дает информацию о уровней экспрессии.

Использование гриппа гемагглютинина (HA) помечены, Ub, полученных активных сайтов направлены зонды позволяет ковалентной модафикация функциональных называет и поэтому дает прямой визуализации активности этих ферментов на вестерн-блоттинга 4. Зонды имеют С-концевой тиоловую реактивную группу, которая служит в качестве субстрата для самоубийства активного сайта цистеина остатком 5. С помощью этих зондов, можно изучать деятельность и потенциал экспрессию многих называет по обе патологических и физиологических состояниях клетки.

Изменения DUB активности были вовлечены в диапазоне патологических состояний, таких как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, анемии и различных видов рака 6-10. Эта методика представляет собой мощный инструмент для изучения болезни. В настоящей работе мы показываем, применение этой методики в HeLa и M17 клеток, которые были лизированных с помощью стеклянных бусин. Кроме того, мы выделяем, как использовать этот метод в мышиных образцах ткани спинного мозга. Информация, полученная из этого метода могут быть использованы в качестве отправной точки для определениятерапевтические цели, а также устанавливающие модели для изучения различных заболеваний. Истинный полезность этого метода состоит в его способности обеспечивать информацию о нескольких называет в одном анализе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Лизис Подготовка буфера

  1. Растворите сахарозы в деионизованной (DI) воды, чтобы сделать маточный раствор 2 M. Фильтр 2 М раствора сахарозы при помощи вакуума, приводимый 0,22 мкм поливинилиденфторида (ПВДФ) фильтр.
  2. Растворите дитиотреитола (DTT) в деионизированной воде, чтобы сделать мМ маточного раствора и хранить 500 в анаэробных условиях. Растворить хлорид магния (MgCl 2) в деионизированной воде, чтобы сделать 100 мМ маточного раствора. Растворите аденозинтрифосфата (АТФ) динатриевой гидрат в DI воде, чтобы сделать 50 мМ маточного раствора.
  3. Составляют решение Трис при рН 7,4 путем растворения гидрохлорида Trizma в деионизированной воде и доведением рН, используя гидроксид натрия (NaOH).
  4. Смешайте части маточных растворов в деионизированной воде, чтобы сделать лизирующего буфера с концентрацией сахарозы 250 мм, концентрации DTT 1 мМ концентрации 5 мМ MgCl 2, концентрации АТФ и 1 мМ концентрации Трис 50 мМ , Например, смешать 535,3 мкл Трис, 500 мкл MgCl 2, 1,25 мл сахарозы, 20 мкл DTT, 200 мкл АТФ и 7,4947 мл деионизированной воды, чтобы сделать 10 мл буфера для лизиса. Это может быть использовано в течение приблизительно 20 экспериментов.

2. культивирования клеток для эксперимента

  1. Сделать носитель информации, на аликвоты 30 мл DMEM + 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), в 50 мл коническую пробирку.
  2. Перевести замороженные M17 или HeLa клетки от хранения в жидком азоте в небольшой стакан с теплой водой.
  3. Передача клеток в 50 мл коническую трубку. Во-первых, добавить некоторые средства массовой информации, чтобы флакон клеток. Затем перенесите Ресуспендированный клетки в течение 5 сек таяния.
  4. Центрифуга клеточной суспензии при 450 х г в течение 5 мин, чтобы получить клеточный осадок. Добавьте 20 мл среды в колбе Т75.
  5. Выньте носители из клеток с использованием всасывания. Добавьте 5 мл свежей среды к осадку клеток и ресуспендируют.
  6. Передача 5 мл клеточной суспензии в 20 мл среды в колбе Т75 и инкубируют при 37 ° С. Ч.Ange СМИ каждые 3 дня.

3. Сотовый урожая

  1. Удалить СМИ с помощью всасывания, стараясь не прикасаться к клеток.
  2. Промыть клетки 5 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS). Удалить PBS с помощью всасывания.
  3. Добавьте 3 мл трипсина-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) с T75 колбу и инкубировать при 37 ° С в течение 3 мин.
  4. Добавить 6 мл свежей среды в колбу и ресуспендирования клеток.
  5. Перевести суспензии в 15 мл коническую трубку и центрифуги при 290 × г в течение 5 минут.
  6. Удалить супернатант и добавить 5 мл PBS. Аккуратно нажмите на нижнюю часть трубы, чтобы разбить шарик. Центрифуга при 290 мкг в течение 5 мин.
  7. Повторите шаг 3,6 три раза.
  8. Удалить PBS и клетки вновь суспендируют в 1 мл свежей PBS. Трансфер в пробирку Эппендорф (1,5 мл). Спин при 290 мкг в течение 5 мин.

4. лизиса клеток

  1. Измерьте Ориентировочный объем осадка с помощью пипетки апD взвесить стеклянные бусины в массы: объемном соотношении 1: 1. Добавить удвоенного объема осадка в буфере для лизиса.
    Примечание: Добавить буфер перед добавлением стеклянных шариков.
  2. Лизиса клеток в пробирку Эппендорфа на максимальной перемешивании в течение 30 мин при 4 ° С на вортексе в холодной комнате.
  3. Центрифуга кратко на 200 мкг в течение 30 сек, чтобы урегулировать бисером. Собирают супернатант.
  4. Добавить такой же объем, как стеклянные бусы, прежде чем к надосадочной жидкости.
  5. Вихревой раз при максимальной перемешивании в течение 30 мин при 4 ° С.
  6. Центрифуга кратко на 200 мкг в течение 30 сек, чтобы урегулировать стеклянные бусы. Собирают супернатант.
  7. Центрифуга при 5030 мкг в течение 5 мин, чтобы удалить ядра, мембран и неразрушенных клеток. Собирают супернатант, который клеточный лизат.

5. Ткань Гомогенизация

  1. Сделайте массы: объем 1: 9 решения мыши ткани спинного мозга к буфера для лизиса.
    Примечание: Этот метод применим к различным отличаютсяОбразцы тканей ЛОР.
  2. Однородный ткани с помощью настройки уровня 2 на гомогенизаторе в течение 30 сек, чтобы гарантировать, что нет никаких куски остальные.
  3. Спин вниз на 5030 мкг в течение 3 мин, чтобы удалить ядра, мембран и неразрушенных клеток.
  4. Собирают супернатант, который лизат.

6. Пример Дериватизация

  1. Выполнение бицинхониновой кислоты (BCA) в анализе 96-луночного планшета для определения концентрации белка в ткани лизата с использованием колориметрического 96-луночный планшет-ридера, как указано в протоколе набора для анализа белка Pierce BCA.
  2. Доведите аликвоту, соответствующую 20 мкг общего белка в 50 мкл с помощью деионизированной (ДИ) воды.
  3. Добавьте 2 мкл 1,35 мкМ HA-UB-винилсульфона (VS) к раствору и инкубируют в течение 1 ч при 37 ° С. Это приводит 20 мкг лизата до 50 нМ зонда в конечной реакционной смеси. Это в значительной молярном избытке, чтобы обеспечить мечение функциональных называет.
  4. Яncubate образца в буфере образца Лэммли в течение 5 минут при 95 ° С. Для 52 мкл реакционной объем использования 26 мкл 2x буфера для образца, 13 мкл буфера для образца 4-кратным или 8,87 мкл 6x буфера для образца.
  5. Прохладный на льду перед загрузкой геля.

7. Вестерн-блот

  1. Загрузка 12-луночного 4-20% Трис-глицина гель с 40 мкл приготовленной пробы
  2. Запустите гель при 95 V до ионов фронт не достигнет дна.
  3. Провести ночь передачу геля на поливинилидендифторидную (ПВДФ) мембраны.
  4. Инкубируйте мембраны в амидной черного красителя и сканировать membane, чтобы получить изображение, показывающее количество белка в каждой полосе.
  5. Destain мембраны и инкубируют в 5% молоке в PBS в течение 1 ч, чтобы блокировать.
  6. Инкубируйте мембраны в основной анти-HA антитела в концентрации 1: 10000 в 5% молоке в PBS либо течение ночи при 4 ° С или в течение 4 ч при комнатной температуре.
  7. Выполните 3 моет еили 5 мин каждый в PBS с 0,1% твина-20 моющего средства.
  8. Инкубируйте мембраны в мышиной пероксидазы хрена в концентрации 1: 10000 в 5% молока в PBS в течение по крайней мере 2 ч.
  9. Выполнение 3 промывок в течение 5 мин каждый в PBS с 0,1% твина-20 моющего средства.
  10. Выполните 1 мытье в течение 5 мин в PBS.
  11. Инкубируйте мембраны в хемилюминесцентного реагента обнаружения в течение 10 мин и обнаруживать с использованием хемилюминесцентного детектора. Используйте автоматическую экспозицию на детекторе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Искусственный M17 и HeLa клетки собирают, используя метод подробно в (Cell извлечении 3.) протокол и мыши ткани спинного мозга был получен. Осадок клеток / ткани спинного мозга, помещают в пробирку с буфером для лизиса, описанной в разделе Подготовка реагентов. Сотовые гранулы лизируют с использованием стеклянных бусин (рис 1а) и мыши образцы ткани спинного мозга гомогенизировали с помощью гомогенизатора (рис 1B). После лизиса или гомогенизации, образец затем центрифугируют при 5030 мкг...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Так убиквитинирования является фундаментальным клеточная активность, понимание механизмов регулирования может быть ключом к раскопкам процессы болезни и патологии. Использование ГК помечены Ub-активные производные сайт направлено зонды, описанные здесь, обеспечивает легкий, но очень применимый метод для изучения Ub-опосредованной деградации белка. Этот метод быстрее и дешевле, чем изучение каждого из DUBs индивидуально.

В этом методе, лизис клеток достигается с помощью механических средств -...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить лабораторию Ли из Университета Миннесоты за предоставление образцов мыши ткани спинного мозга, которые были использованы. Эта работа была поддержана Департаментом оборонной программы рака яичников исследований (ОГОС) OC093424 к МБ, научно-исследовательским и сообщества Рак фонда Рэнди бритвы к МБ и Миннесота яичников Рак Альянс (MOCA) в МБ. Доноры не было никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
PowerGen 125 (гомогенизатор)Fischer Scientific14-261-02P
Вакуумные фильтры 0,22 &; mBPV2210
Стеклянные бусины, промытые кислотой и т.д.; 106 и микро; m (~140 сито США)Sigma-aldrichG4649-10G
СахарозаFischerScientific S6-212
DL-дитиотреитолSigma-AldrichD0632
Хлорид магнияSigma-AldrichM8266
Аденозин 5'-трифосфат динатриевой соли гидратSigma-AldrichA26209
Тризма гидрохлоридSigma-AldrichT3253
Модифицированный Eagle Dulbecco's MediumLife Technologies11965-092
Фосфат буферизированный физиологический растворLife Technologies10010-023
Колба для культуры тканей 75 см<суп>2 с фильтрующим стаканчиком 250 мл 120/ксCellstarT-3001-2
0,05% Трипсин-ЭДТА (1x)Life Technologies25300-054
HI FBSLife Technologies16140-071
Моноклональное антитело против HA, полученное у мышейSigma-AldrichH9658
Убиквитин винилсульфон (HA-tag)Enzo Life SciencesBML-UW0155-0025
Laemmli's SDS-Sample Buffer (4x, восстанавливающий)Boston BioProductsBP-110R
Pierce BCA Protein Набор для пробирныханализов Thermo Scientific23225

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ovaa, H., Kessler, B. M., Rolén, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).
  2. Wilkinson, K. D. Ubiquitination and deubiquitination: Targeting of proteins for degradation by the proteasome. Semin Cell Dev Biol. 11 (3), 141-148 (2000).
  3. Ziad, M. E., Wilkinson, K. D. Regulation of proteolysis by human deubiquitinating enzymes. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 114-128 (2014).
  4. Rolén, U., et al. Activity Profiling of Deubiquitinating Enzymes in Cervical Carcinoma Biopsies and Cell Lines. Mol Carcinog. 45 (4), 260-269 (2006).
  5. Borodovsky, A., et al. Chemistry-Based Functional Proteomics Reveals Novel Members of the Deubiquitinating Enzyme Family. Chem Biol. 9 (10), 1149-1159 (2002).
  6. Andersson, F. L., et al. The effect of Parkinson’s-disease-associated mutations on the deubiquitinating enzyme UCH-L1. J Mol Biol. 407 (2), 261-272 (2011).
  7. Poon, W. W., et al. β-Amyloid (Aβ) oligomers impair brain-derived neurotrophic factor retrograde trafficking by down-regulating ubiquitin C-terminal hydrolase UCH-L1. J Biol Chem. 288 (23), 16937-16948 (2013).
  8. Nijman, S. M., et al. The deubiquitinating enzyme USP1 regulates the Fanconi anemia pathway. Mol Cell. 17 (3), 331-339 (2005).
  9. Stevenson, L. F., Sparks, A., Allende-Vega, N., Xirodimas, D. P., Lane, D. P., Saville, M. K. The deubiquitinating enzyme USP2a regulates the p53 pathway by targeting Mdm2. EMBO J. 26 (4), 976-986 (2007).
  10. Coughlin, K., et al. Small-molecule RA-9 inhibits proteasome-associated DUBs and ovarian cancer in vitro and in vivo via exacerbating unfolded protein responses. Clin Cancer Res. 20 (12), 3174-3186 (2014).
  11. Colla, E., et al. Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of α-Synucleinopathy In. Vivo. J Neurosci. 32 (10), 3306-3320 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи