Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Метод измерения активности ферментов Deubiquitinating в клеточных линиях и образцы тканей

9.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52784

⸱

10 мая 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, University of Minnesota, 2Institute for Translational Neuroscience, University of Minnesota, 3Department of Obstetrics, Gynecology, and Women’s Heath, University of Minnesota, 4Masonic Cancer Center, University of Minnesota

В этой статье

Краткое содержание

Текущий протокол детали метод для измерения активности функционально гомологичны deubiquitinating ферментов. Специализированный зонды, ковалентно модифицировать фермент и позволяют для обнаружения. Этот метод имеет потенциал для выявления новых терапевтических мишеней.

Аннотация

Система убиквитин-протеасомный недавно был вовлечен в различных патологий в том числе нейродегенеративных заболеваний и рака. В свете этого, методы для изучения механизма регулирования этой системы имеют важное значение для выяснения клеточных и молекулярных процессов вышеупомянутых заболеваний. Использование гемагглютинина получены убиквитиновых зондов, описанных в этой статье служит ценным инструментом для изучения этой системы. В этом документе подробно описывается метод, который позволяет пользователю выполнять анализы, которые дают прямой визуализации deubiquitinating активность фермента. Deubiquitinating ферменты борьбы с деградацией протеасомной и поделиться функциональную гомологию в их активных сайтов, что позволяет пользователю исследовать деятельность нескольких ферментов в одном анализе. Лизаты получают посредством разрушения нежной механической клеток и инкубировали с активным сайтом направленных зондов. Функциональные ферменты помечены с зондами, а неактивные ферменты остаются несвязанными. По ходуНин этот анализ, пользователь получает информацию как о деятельности и потенциальных выражения нескольких deubiquitinating ферментов в быстрой и легкой манере. Нынешний метод является значительно более эффективным, чем при использовании отдельных антител для предсказанных сто deubiquitinating ферментов в клетке человека.

Введение

Система убиквитин-протеасомный (ИБП) служит одним из основных путей деградации в клетке млекопитающего. Основания, связанные деградации в протеасоме ковалентно помечен полимеров убиквитином (UB) 1. Перед мишенью субстрат поступает в протеасомы для деградации, поли-убиквитин метка должна быть удалена. Класс ферментов, известных как deubiquitinating ферменты (DUBs) несет ответственность за удаление и утилизацию молекул убиквитиновых 2. Было предсказано, из генома человека, что почти в сто DUBs, работающие в клетке 3. При таком большом количестве Dubs контролирующих Ub-клеточные процессы, опосредованные, изучение этих ферментов представляет собой сложную задачу, поскольку методы мРНК не дают информацию о деятельности и вестерн-блоттинга только дает информацию о уровней экспрессии.

Использование гриппа гемагглютинина (HA) помечены, Ub, полученных активных сайтов направлены зонды позволяет ковалентной модафикация функциональных называет и поэтому дает прямой визуализации активности этих ферментов на вестерн-блоттинга 4. Зонды имеют С-концевой тиоловую реактивную группу, которая служит в качестве субстрата для самоубийства активного сайта цистеина остатком 5. С помощью этих зондов, можно изучать деятельность и потенциал экспрессию многих называет по обе патологических и физиологических состояниях клетки.

Изменения DUB активности были вовлечены в диапазоне патологических состояний, таких как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, анемии и различных видов рака 6-10. Эта методика представляет собой мощный инструмент для изучения болезни. В настоящей работе мы показываем, применение этой методики в HeLa и M17 клеток, которые были лизированных с помощью стеклянных бусин. Кроме того, мы выделяем, как использовать этот метод в мышиных образцах ткани спинного мозга. Информация, полученная из этого метода могут быть использованы в качестве отправной точки для определениятерапевтические цели, а также устанавливающие модели для изучения различных заболеваний. Истинный полезность этого метода состоит в его способности обеспечивать информацию о нескольких называет в одном анализе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Лизис Подготовка буфера

  1. Растворите сахарозы в деионизованной (DI) воды, чтобы сделать маточный раствор 2 M. Фильтр 2 М раствора сахарозы при помощи вакуума, приводимый 0,22 мкм поливинилиденфторида (ПВДФ) фильтр.
  2. Растворите дитиотреитола (DTT) в деионизированной воде, чтобы сделать мМ маточного раствора и хранить 500 в анаэробных условиях. Растворить хлорид магния (MgCl 2) в деионизированной воде, чтобы сделать 100 мМ маточного раствора. Растворите аденозинтрифосфата (АТФ) динатриевой гидрат в DI воде, чтобы сделать 50 мМ маточного раствора.
  3. Составляют решение Трис при рН 7,4 путем растворения гидрохлорида Trizma в деионизированной воде и доведением рН, используя гидроксид натрия (NaOH).
  4. Смешайте части маточных растворов в деионизированной воде, чтобы сделать лизирующего буфера с концентрацией сахарозы 250 мм, концентрации DTT 1 мМ концентрации 5 мМ MgCl 2, концентрации АТФ и 1 мМ концентрации Трис 50 мМ , Например, смешать 535,3 мкл Трис, 500 мкл MgCl 2, 1,25 мл сахарозы, 20 мкл DTT, 200 мкл АТФ и 7,4947 мл деионизированной воды, чтобы сделать 10 мл буфера для лизиса. Это может быть использовано в течение приблизительно 20 экспериментов.

2. культивирования клеток для эксперимента

  1. Сделать носитель информации, на аликвоты 30 мл DMEM + 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), в 50 мл коническую пробирку.
  2. Перевести замороженные M17 или HeLa клетки от хранения в жидком азоте в небольшой стакан с теплой водой.
  3. Передача клеток в 50 мл коническую трубку. Во-первых, добавить некоторые средства массовой информации, чтобы флакон клеток. Затем перенесите Ресуспендированный клетки в течение 5 сек таяния.
  4. Центрифуга клеточной суспензии при 450 х г в течение 5 мин, чтобы получить клеточный осадок. Добавьте 20 мл среды в колбе Т75.
  5. Выньте носители из клеток с использованием всасывания. Добавьте 5 мл свежей среды к осадку клеток и ресуспендируют.
  6. Передача 5 мл клеточной суспензии в 20 мл среды в колбе Т75 и инкубируют при 37 ° С. Ч.Ange СМИ каждые 3 дня.

3. Сотовый урожая

  1. Удалить СМИ с помощью всасывания, стараясь не прикасаться к клеток.
  2. Промыть клетки 5 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS). Удалить PBS с помощью всасывания.
  3. Добавьте 3 мл трипсина-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) с T75 колбу и инкубировать при 37 ° С в течение 3 мин.
  4. Добавить 6 мл свежей среды в колбу и ресуспендирования клеток.
  5. Перевести суспензии в 15 мл коническую трубку и центрифуги при 290 × г в течение 5 минут.
  6. Удалить супернатант и добавить 5 мл PBS. Аккуратно нажмите на нижнюю часть трубы, чтобы разбить шарик. Центрифуга при 290 мкг в течение 5 мин.
  7. Повторите шаг 3,6 три раза.
  8. Удалить PBS и клетки вновь суспендируют в 1 мл свежей PBS. Трансфер в пробирку Эппендорф (1,5 мл). Спин при 290 мкг в течение 5 мин.

4. лизиса клеток

  1. Измерьте Ориентировочный объем осадка с помощью пипетки апD взвесить стеклянные бусины в массы: объемном соотношении 1: 1. Добавить удвоенного объема осадка в буфере для лизиса.
    Примечание: Добавить буфер перед добавлением стеклянных шариков.
  2. Лизиса клеток в пробирку Эппендорфа на максимальной перемешивании в течение 30 мин при 4 ° С на вортексе в холодной комнате.
  3. Центрифуга кратко на 200 мкг в течение 30 сек, чтобы урегулировать бисером. Собирают супернатант.
  4. Добавить такой же объем, как стеклянные бусы, прежде чем к надосадочной жидкости.
  5. Вихревой раз при максимальной перемешивании в течение 30 мин при 4 ° С.
  6. Центрифуга кратко на 200 мкг в течение 30 сек, чтобы урегулировать стеклянные бусы. Собирают супернатант.
  7. Центрифуга при 5030 мкг в течение 5 мин, чтобы удалить ядра, мембран и неразрушенных клеток. Собирают супернатант, который клеточный лизат.

5. Ткань Гомогенизация

  1. Сделайте массы: объем 1: 9 решения мыши ткани спинного мозга к буфера для лизиса.
    Примечание: Этот метод применим к различным отличаютсяОбразцы тканей ЛОР.
  2. Однородный ткани с помощью настройки уровня 2 на гомогенизаторе в течение 30 сек, чтобы гарантировать, что нет никаких куски остальные.
  3. Спин вниз на 5030 мкг в течение 3 мин, чтобы удалить ядра, мембран и неразрушенных клеток.
  4. Собирают супернатант, который лизат.

6. Пример Дериватизация

  1. Выполнение бицинхониновой кислоты (BCA) в анализе 96-луночного планшета для определения концентрации белка в ткани лизата с использованием колориметрического 96-луночный планшет-ридера, как указано в протоколе набора для анализа белка Pierce BCA.
  2. Доведите аликвоту, соответствующую 20 мкг общего белка в 50 мкл с помощью деионизированной (ДИ) воды.
  3. Добавьте 2 мкл 1,35 мкМ HA-UB-винилсульфона (VS) к раствору и инкубируют в течение 1 ч при 37 ° С. Это приводит 20 мкг лизата до 50 нМ зонда в конечной реакционной смеси. Это в значительной молярном избытке, чтобы обеспечить мечение функциональных называет.
  4. Яncubate образца в буфере образца Лэммли в течение 5 минут при 95 ° С. Для 52 мкл реакционной объем использования 26 мкл 2x буфера для образца, 13 мкл буфера для образца 4-кратным или 8,87 мкл 6x буфера для образца.
  5. Прохладный на льду перед загрузкой геля.

7. Вестерн-блот

  1. Загрузка 12-луночного 4-20% Трис-глицина гель с 40 мкл приготовленной пробы
  2. Запустите гель при 95 V до ионов фронт не достигнет дна.
  3. Провести ночь передачу геля на поливинилидендифторидную (ПВДФ) мембраны.
  4. Инкубируйте мембраны в амидной черного красителя и сканировать membane, чтобы получить изображение, показывающее количество белка в каждой полосе.
  5. Destain мембраны и инкубируют в 5% молоке в PBS в течение 1 ч, чтобы блокировать.
  6. Инкубируйте мембраны в основной анти-HA антитела в концентрации 1: 10000 в 5% молоке в PBS либо течение ночи при 4 ° С или в течение 4 ч при комнатной температуре.
  7. Выполните 3 моет еили 5 мин каждый в PBS с 0,1% твина-20 моющего средства.
  8. Инкубируйте мембраны в мышиной пероксидазы хрена в концентрации 1: 10000 в 5% молока в PBS в течение по крайней мере 2 ч.
  9. Выполнение 3 промывок в течение 5 мин каждый в PBS с 0,1% твина-20 моющего средства.
  10. Выполните 1 мытье в течение 5 мин в PBS.
  11. Инкубируйте мембраны в хемилюминесцентного реагента обнаружения в течение 10 мин и обнаруживать с использованием хемилюминесцентного детектора. Используйте автоматическую экспозицию на детекторе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Искусственный M17 и HeLa клетки собирают, используя метод подробно в (Cell извлечении 3.) протокол и мыши ткани спинного мозга был получен. Осадок клеток / ткани спинного мозга, помещают в пробирку с буфером для лизиса, описанной в разделе Подготовка реагентов. Сотовые гранулы лизируют с использованием стеклянных бусин (рис 1а) и мыши образцы ткани спинного мозга гомогенизировали с помощью гомогенизатора (рис 1B). После лизиса или гомогенизации, образец затем центрифугируют при 5030 мкг...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Так убиквитинирования является фундаментальным клеточная активность, понимание механизмов регулирования может быть ключом к раскопкам процессы болезни и патологии. Использование ГК помечены Ub-активные производные сайт направлено зонды, описанные здесь, обеспечивает легкий, но очень применимый метод для изучения Ub-опосредованной деградации белка. Этот метод быстрее и дешевле, чем изучение каждого из DUBs индивидуально.

В этом методе, лизис клеток достигается с помощью механических средств -...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить лабораторию Ли из Университета Миннесоты за предоставление образцов мыши ткани спинного мозга, которые были использованы. Эта работа была поддержана Департаментом оборонной программы рака яичников исследований (ОГОС) OC093424 к МБ, научно-исследовательским и сообщества Рак фонда Рэнди бритвы к МБ и Миннесота яичников Рак Альянс (MOCA) в МБ. Доноры не было никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
PowerGen 125 (гомогенизатор)Fischer Scientific14-261-02P
Вакуумные фильтры 0,22 &; mBPV2210
Стеклянные бусины, промытые кислотой и т.д.; 106 и микро; m (~140 сито США)Sigma-aldrichG4649-10G
СахарозаFischerScientific S6-212
DL-дитиотреитолSigma-AldrichD0632
Хлорид магнияSigma-AldrichM8266
Аденозин 5'-трифосфат динатриевой соли гидратSigma-AldrichA26209
Тризма гидрохлоридSigma-AldrichT3253
Модифицированный Eagle Dulbecco's MediumLife Technologies11965-092
Фосфат буферизированный физиологический растворLife Technologies10010-023
Колба для культуры тканей 75 см<суп>2 с фильтрующим стаканчиком 250 мл 120/ксCellstarT-3001-2
0,05% Трипсин-ЭДТА (1x)Life Technologies25300-054
HI FBSLife Technologies16140-071
Моноклональное антитело против HA, полученное у мышейSigma-AldrichH9658
Убиквитин винилсульфон (HA-tag)Enzo Life SciencesBML-UW0155-0025
Laemmli's SDS-Sample Buffer (4x, восстанавливающий)Boston BioProductsBP-110R
Pierce BCA Protein Набор для пробирныханализов Thermo Scientific23225

Ссылки

  1. Ovaa, H., Kessler, B. M., Rolén, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).
  2. Wilkinson, K. D. Ubiquitination and deubiquitination: Targeting of proteins for degradation by the proteasome. Semin Cell Dev Biol. 11 (3), 141-148 (2000).
  3. Ziad, M. E., Wilkinson, K. D. Regulation of proteolysis by human deubiquitinating enzymes. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 114-128 (2014).
  4. Rolén, U., et al. Activity Profiling of Deubiquitinating Enzymes in Cervical Carcinoma Biopsies and Cell Lines. Mol Carcinog. 45 (4), 260-269 (2006).
  5. Borodovsky, A., et al. Chemistry-Based Functional Proteomics Reveals Novel Members of the Deubiquitinating Enzyme Family. Chem Biol. 9 (10), 1149-1159 (2002).
  6. Andersson, F. L., et al. The effect of Parkinson’s-disease-associated mutations on the deubiquitinating enzyme UCH-L1. J Mol Biol. 407 (2), 261-272 (2011).
  7. Poon, W. W., et al. β-Amyloid (Aβ) oligomers impair brain-derived neurotrophic factor retrograde trafficking by down-regulating ubiquitin C-terminal hydrolase UCH-L1. J Biol Chem. 288 (23), 16937-16948 (2013).
  8. Nijman, S. M., et al. The deubiquitinating enzyme USP1 regulates the Fanconi anemia pathway. Mol Cell. 17 (3), 331-339 (2005).
  9. Stevenson, L. F., Sparks, A., Allende-Vega, N., Xirodimas, D. P., Lane, D. P., Saville, M. K. The deubiquitinating enzyme USP2a regulates the p53 pathway by targeting Mdm2. EMBO J. 26 (4), 976-986 (2007).
  10. Coughlin, K., et al. Small-molecule RA-9 inhibits proteasome-associated DUBs and ovarian cancer in vitro and in vivo via exacerbating unfolded protein responses. Clin Cancer Res. 20 (12), 3174-3186 (2014).
  11. Colla, E., et al. Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of α-Synucleinopathy In. Vivo. J Neurosci. 32 (10), 3306-3320 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Метод измерения активности ферментов Deubiquitinating в клеточных линиях и образцы тканей
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.