Методическая статья

Инкапсуляция Термогенный преадипоциты для трансплантации в жировой ткани депо

9.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52806

⸱

2 июня 2015 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Human Sciences, The Ohio State University, 2Department of Minimally Invasive Surgery, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 3NSF Nanoscale Science and Engineering Center for Affordable Nanoengineering of Polymeric Biomedical Devices, The Ohio State University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол инкапсуляции катаболических клеток, которые потребляют липиды для производства тепла во внутрибрюшной жировой ткани и увеличивают рассеивание энергии у мышей с ожирением.

Аннотация

Сотовый инкапсуляции была разработана для улавливания жизнеспособных клеток в полупроницаемых мембран. Насаждаемое инкапсулированные клетки могут обмениваться низкие метаболитов молекулярным весом в тканях обрабатываемой хозяина для достижения долгосрочного выживания. Полупроницаемую мембрану позволяет привиты инкапсулированные клетки, чтобы избежать отторжения иммунной системой. Процедура инкапсуляции была разработана для того, чтобы контролируемое высвобождение биологически активных соединений, таких как инсулин, других гормонов, и цитокинов. Здесь мы опишем метод инкапсуляции для катаболических клеток, которые потребляют липидов для производства тепла и диссипации энергии (термогенез) в внутрибрюшного жировой ткани у мышей с ожирением. Инкапсуляция термогенных катаболических клеток может быть потенциально применимы для предупреждения и лечения ожирения и диабета 2 типа. Другое потенциальное применение катаболических клеток может включать в себя детоксикации от спиртов или других токсичных метаболитов, загрязнителей окружающей среды.

Введение

Увеличение заболеваемости хроническими болезнями 1 стимулировало исследования по трансплантации терапевтических клеточных популяций 2. Сингенные или аллогенных стволовых клеток являются наиболее часто используемые типы клеток для этих приложений 2. Тем не менее, эти процедуры не позволяют контролировать дифференциации и миграции стволовых клеток после имплантации и не рентабельным. Трансплантация генетически модифицированных клеток с выгодных функций предвидит улучшения лечения многих заболеваний. Тем не менее, генетические модификации клеток признаны иммунной системы хозяина, следовательно, эти процедуры требуют иммуносупрессии 3. Инкапсуляция клеток, продуцирующих инсулин был разработан доктором Чанг 4. Методика основана на инкапсуляции клеток в альгинатных капель, которые погружают в раствор хлорида кальция. Альгинатные молекулы состоят из маннуроновой (М) и гулуроновой кислоты (G), и может быть подключен с помощью Ca 2+, После желатинизации, гранулы суспендируют в поли-L-лизин (PLL) раствора. Во время этого этапа ФАПЧ связывается с G и М в молекулах альгината, который устанавливает мембрану капсулы. Пористость оболочки капсулы можно модулировать путем изменения концентрации М и PLL, времени инкубации и температуры. Связывание PLL также зависит от типа и концентрации альгината. Альгинатные матрицы, сшитый Са 2+, неустойчивы в физиологической среде или в общих буферных растворов с высокой концентрацией фосфата и цитрата ионов. Эти буферы могут извлечь Ca 2+ из альгината и жидкое ядро. Сжижение альгината ядра обеспечивает пространство внутри капсулы для сотовых движения и роста. Клетки, инкапсулированные в альгинат полианионного с поликатионный поли-L-лизина (APL) непроницаемы для иммуноглобулинов, но есть приток питательных веществ и отток токсинов. Эти свойства позволяют APL на длительный срок суrvival инкапсулированных клеток после трансплантации в генетически различных хостов. Эллиот и др. Сообщили выживание функционирует инкапсулированные клетки поджелудочной железы свиньи у пациента-человека девять лет после имплантации 5.

Методы инкапсуляции могут быть классифицированы в микрокапсуляции (3-800 мкм) и макроинкапсулирование (больше, чем 1000 мкм). Микрокапсулы более долговечны, чем макрокапсулы 6. С момента своего открытия д-ра Чанга и коллегами в 1964 году, микрокапсулы широко используется для инкапсуляции анаболических клеток, продуцирующих инсулин, других гормонов и биологически активных молекул 7. Эти процедуры столкнулась с рядом проблем в принимающей ткани, включая фиброз и иммунного ответа 8. Первоначально побочные эффекты, связанные с качеством биополимеров были решены. Тем не менее, трансплантация клеток анаболических еще инициирует побочные эффекты, такие как фиброз, в результате гормональной overprкий ВВЕДЕНИ Е вне специализированного железы.

В последние десятилетия, ожирение и диабет типа 2 достигло масштабов эпидемии 9. Более 30% взрослых людей во всем мире имеют избыточный вес и ожирение 10. Увеличение внутрибрюшного (IAB) образование жира увеличивает частоту хронического воспаления и способствует сахарный диабет 2 типа, сердечно-сосудистые заболевания, некоторые виды рака и других заболеваемости среди 11-13. Несколько линий доказательств предположил, что патогенез связан с IAB жира может быть предотвращено путем конкретных адипоцитов. Последние исследования показали, что трансплантация подкожных адипоцитов в IAB области может улучшить обмен веществ и уменьшить ожирение и инсулинорезистентность у грызунов в естественных условиях 14. Эффективное снижение ожирения и резистентности к инсулину была связана с термогенный адипоцитов, способных рассеивать энергию в виде тепла 15,16. Термогенный модификация адипоцитов может быть достигнуто путем стабильной трансфекциигенов, участвующих в митохондриального протонного разобщением, таких как разобщение белка 1 (UCP1) или генов, регулирующих экспрессию UCP1 и других термогенных генов 15,16. Наши недавние исследования показали, что дефицит в альдегиддегидрогеназы 1 A1 (aldh1a1) приводит к термогенный ремоделирования IAB жира, что уменьшает ожирение и резистентность к инсулину у этих мышей 17,18. Следует отметить, что инкапсуляция термогенный aldh1a1 недостаточной (aldh1a1 - / -) преадипоциты опосредует же терапевтический эффект в IAB жира у тучных мышей дикого типа, что указывает новые терапевтические возможности для лечения IAB жира 18. В экспериментальных условиях, инкапсулированные клетки позволит исследователям изучать эффекты конкретных клеточных популяций в экономически эффективным образом 19. Здесь мы обсуждаем метод инкапсуляции термогенного катаболического клеточной линии и ее лаборатории и терапевтического применения в мышиной модели ожирения. Протокол описывает три фазы для производства микрокапсул (рис 1): формирование альгината микросфер (рис 1А), формирование поликатионного поли-L-лизина (PLL) мембран на поверхности микросфер (рис 1B), и удаления альгината ядра (рис 1в).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Протокол исследования был одобрен этическими комитетами университета штата Огайо. Эксперименты на животных были одобрены протоколом IACUC. Все процедуры были выполнены в соответствии с биозащитой уровня 2 с ламинарного потока. Мы выполнили все стандартные требования и процедуры безопасности. Методика микрокапсулы для приготовления микрокапсул было выполнено, как описано 17, 18.

1. Подготовка материалов

  1. Подготовка 10 мл 2% -ного раствора альгината натрия в автоклаве физиологического солевого раствора (0,9% NaCl в воде). Готовят 0,05% раствор PLL в физиологическом растворе. Подготовьте эти решения накануне и перемешивают в течение ночи. Фильтры решения с 0,22 мкм фильтр перед использованием.
  2. Подготовка 50 мМ цитрата натрия и 100 мМ CaCl 2 в 0,9% растворов NaCl и автоклаве их.
  3. Автоклав все решения, иглы, электроды, и стаканы. Тщательно чистые иглы с проводами, чтобы избежать засорения,
  4. Определить соответствующее количество клеток будет использоваться для капсул (102 микрокапсулы необходимы для каждого см 2 скважины и есть приблизительно 500 клеток на капсулу 18). Используйте 1 мл альгината натрия в два миллиона клеток.
  5. Приготовьте 'роста фибробластов среды ", содержащий 10% сыворотку теленка и 100 ед / мл пенициллина / стрептомицина в высокой концентрацией глюкозы (4,500 мг / л глюкозы) среде Игла, модифицированной Eagle (DMEM).
    1. Приготовьте 'дифференциации среде I', содержащего 10% фетальной бычьей сыворотки, 10 мкг / мл инсулина, 1 мкМ дексаметазон, 0,5 мМ 3-изобутил-1-метил ксантина и 100 ед / мл пенициллина / стрептомицина в среде DMEM.
    2. Приготовьте 'дифференциации Medium II' содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 10 мкг / мл инсулина, и 100 ед / мл пенициллина / стрептомицина в DMEM.
  6. Подготовка буфера для лизиса, содержащего ингибитор протеазы один таблетку в 10 мл Радио-иммунопреципитации буфера (RIПА буфер).

2. альгинат Microbeads Подготовка (1А)

  1. Удалить старые среды от клеточной культуры колбу. Промыть клетки с 10 мл PBS. Доведите клеток в суспензии с 0,25% трипсин-ЭДТА (2 мл на одну сливной T175 колбу).
  2. Граф клеток в суспензии клеток использованием гемоцитометра. Используйте 10 мл аликвоты из клеточной суспензии и клетки рассчитывать в соответствии с инструкциями изготовителя. Центрифуга остальные клетки в среде центрифугированием при 480 х г при комнатной температуре в течение 5 мин.
  3. Приостановка осадок клеток в альгинат натрия, как описано в шаге 1.4. Передача альгинат натрия-клеток решение 5 мл шприца.
  4. Удалить воздушные пузырьки в растворе, добавить 23-иглы и шприца инвертировать, чтобы создать 1 мл карман воздуха.
  5. Поместите небольшой стакан (180 мл), содержащей 144 мл 100 мМ CaCl 2 раствора под иглы носик инкапсулятора. Прикрепите электрод инкапсулятор с наконечником approximленно 2,5 см выше поверхности раствора 100 мМ CaCl 2.
  6. Поместите плотно в шприц, содержащий раствор альгината натрия-клеток в шприцевой насос. Прикрепите резиновую трубку к отверстию шприца. Нажмите на поршень, пока раствор альгината натрия-клеток не входит в середине трубки. Отрегулируйте напряжение до 5,4 кВ. Установите диаметр 12.06 мм на шприцевой насос. Регулировка скорости 3 мл / ч. Запустите насос. Включите инкапсулятора и поддерживать напряжение на 5,4 кВ.
  7. Закрыть окно капотом и избежать ненужного вибрации до конца формирования альгинатных микросфер. Ведь раствор проходит через иглу, укрепить альгината шаровидные микрогранулы в 100 мМ CaCl 2 решения для дополнительных 20 мин до покрытия PLL.

3. Покрытие Microbeads с PLL (1В)

  1. Снимите стакан, содержащий шаровидные микрогранулы альгинат натрия-клеток и передать эти MiCRobEADS в 50 мл центрифужную пробирку. Удалить CaCl 2 раствор из микрогранулами таблетки.
  2. Вымойте шаровидные микрогранулы альгинат-клеток путем добавления 30 мл 0,9% NaCl. Встряхнуть пробирку вручную осторожно. Удалить 0,9% NaCl с 25 мл пипетки после микросферы уже осаждают гравитации. Повторите еще два раза в общей сложности 3 стирок.
  3. Использование 10 мл 0,05% раствора ФАПЧ на каждый 1 мл раствора альгината натрия. Добавьте 0,05% PLL и вихрь в 1000 оборотов в мин в течение 10 мин.
    Примечание: Как правило, 10 мин достаточно для PLL покрытием.
  4. После PLL покрытие формируют, удаления раствора PLL и мыть капсулы 3 раза, как описано в 3.2.

4. Удаление альгината Core (рис 1С)

  1. Добавить 30 мл 50 мМ раствора цитрата натрия. Подождите 5 минут или пока все альгинат натрия растворяют. Вымойте капсулы три раза, как описано в шаге 3.1.1.
  2. Извлеките 0,9% NaCl, добавляют 20 мл культуральной среды в 50 мл пробиркуи передавать все капсулы, содержащие клетки в клеточной культуральной колбе. Ручка инкапсулированные клетки в стандартных условиях культивирования клеток 18.

5. В пробирке приложений для изучения ксенотрансплантатов и клетка-хозяин взаимодействий или кинетики метаболитов Приток / отток между клетками (рис 2)

  1. Хозяева Культура клеток на 24-луночный планшет до сливной для совместных культур. Используйте 'роста фибробластов Medium »для культивирования преадипоциты.
  2. Передача микрокапсулы в 24 пластинчатых клеток, содержащих принимающих сливной ямы. Добавить микрокапсулы для достижения монослоя (102 микрокапсулы / см 2 а).
  3. Вызвать предварительно дифференциацию адипоцитов с дифференциацией среднего I. Каждый 48 ч, изменение средств массовой информации к дифференциации среднего II в течение шести дней. Lyse клетки в RIPA буфера. Используйте 50 мкг белка на состоянии анализировать экспрессию белка с помощью Вестерн-блот.

6. В Vivo заявки на TreatmЛОР ожирения (Рисунок 3)

  1. Смешайте 4% изофлуран с кислородом для индукции анестезии и 2% изофлуран с кислородом для поддержания анестезии. Подтвердите адекватную глубину анестезирующего по ног крайнем случае.
    1. Применить анти-зуд мазь на глазах, чтобы защитить роговицу от высыхания.
  2. Использование инкапсулированные клетки, которые постоянно меченные искусственного белка флуоресценции, такие как зеленой флуоресценции белка (GFP).
  3. Использовать шприц 3 мл и 20 иглы, чтобы придать инкапсулированных клеток.
    1. Инъекционные 0,5 х 10 6 клеток суспендировали в 0,2 мл PBS в каждую IAB депо жира, который находится в внутрибрюшинного области между гонад и почек, как показано на рисунке 3. Используйте этот объем PBS и номер ячейки для мышей со средней массы 40 г. Регулировка количества клеток и объем у мышей, которые имеют различный вес и для определения зависимости от дозы эффектов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

1 показано, что каждый шаг производства микрогранул можно контролировать под микроскопом. 2А показано, как совместное культивирование адипоцитов с монослоем инкапсулированных клеток. 2В является типичным примером количественного исследования с использованием адипоцитов / микрокапсул со-культуры, что были описаны в разделе 5. лизатов адипоциты были проанализированы с использованием Вестерн-блот. Капсула не анализировались в этом эксперименте. Первичный ATGL и β-актина ан...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Различные методы были использованы для инкапсуляции клеток, в том числе сушки, экструзии, и эмульсии 19. В этом методе, альгината шарики подвергают экструзии через иглу, затем покрывают ФАПЧ и альгинат сердечника будет растворено, чтобы завершить инкапсуляции. Хотя этот метод был использован в течение многих лет, образование шариков с желаемым размером сферической формы и по-прежнему сложным. Размер капсул в значительной степени зависит от вязкости раствора альгината натрия, диаметр экструдера, а расстояние м...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Конфликт интересов не декларируется.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Дженнифер Петрозино и Дэвид DiSilvestro для редакционного помощи. Это исследование было поддержано Award Количество 20020728 от американского Совета яйцо и премии Количество 10040042 от Ново Нордиск Pharmaceuticals, а также Инновационного центра пищевых продуктов, Бюро по международным делам, Центр перспективных исследований Foods функциональной и предпринимательству при ОГУ, а также Национальный научный фонд предоставить ЕЕС-0914790 (LJL). Проект описывается поддержали Award Количество R21OD017244 (OZ) и UL1RR025755 (OSUCCC) из Национального центра по исследованию ресурсов, финансируется Управлением Директор Национальных Институтов Здоровья (OD) при поддержке НИЗ для медицинских исследований и NCI P30CA16058. Содержание исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения Национального центра исследовательских ресурсов или Национального института здравоохранения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Устройство для инкапсуляции (VAR V1)NiscoLIN-0042Нет
KD научный шприцевой насосKD Scientific780100YНет
Olympus микроскоп Olympus OpticalIX70-S8F2Нет
Альгинат натрияSigmaMKBP8122VНет
Поли-L-лизина гидробромид (PLL)Sigma020M5006VНет
Хлорид кальцияSigmaSLBJ2662VНет
Цитрат натрия трехосновной дигидратSigma030M0200Нет
Хлорид натрияSigmaSLBD2595VNone
Mini-PROTEAN TGX GelsBio-Rad456-1093None
Первичное антитело ATGL (из кролика)Cell Signaling2138SNone
Вторичное антитело (против кролика)LI-COR926-68071None
Буфер для анализа радиоиммунопреципитации (RIPA)Boston BioProductsD25Y6ZNone
Фосфат буферизованный физиологический раствор (PBS)SigmaRNBD2893None
TrypsinGibco25200-056None
Cortizone 10 Мазь против зудаCortizone 10C4029138None
Модифицированный Eagle Medium (DMEM) Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco11965-092None
Сыворотка для новорожденных телят (CS)SigmaN4762None
Фетальная бычья сыворотка (FBS)SigmaF4135Нет
3-изобутил-1-метилксантин (IBMX)SigmaI0516Нет
ДексаметазонSigmaD4902Нет
Инсулин (бычий)SigmaI5879Нет
Коктейль ингибиторов протеазыRoche4693159001Нет

Ссылки

  1. Vogeli, C., et al. Multiple chronic conditions: prevalence, health consequences, and implications for quality, care management, and costs. Journal of general internal medicine. 22, Suppl 3. 391-395 (2007).
  2. Vija, L., et al. Mesenchymal stem cells: Stem cell therapy perspectives for type 1 diabetes. Diabetes & metabolism. 35, 85-93 (2009).
  3. Acarregui, A., Orive, G., Pedraz, J. L., Hernandez, R. M. Therapeutic applications of encapsulated cells. Methods in molecular biology. 1051, 349-364 (2013).
  4. Chang, T. M. Semipermeable Microcapsules. Science. 146, 524-525 (1964).
  5. Elliott, R. B., et al. Live encapsulated porcine islets from a type 1 diabetic patient 9.5 yr after xenotransplantation. Xenotransplantation. 14, 157-161 (2007).
  6. Lim, F., Sun, A. M. Microencapsulated islets as bioartificial endocrine pancreas. Science. 210, 908-910 (1980).
  7. Vos, P., Spasojevic, M., Faas, M. M. Treatment of diabetes with encapsulated islets. Advances in experimental medicine and biology. 670, 38-53 (2010).
  8. Cotton, C. K. Engineering challenges in cell-encapsulation technology. Trends in biotechnology. 14, 158-162 (1996).
  9. Yach, D., Stuckler, D., Brownell, K. D. Epidemiologic and economic consequences of the global epidemics of obesity and diabetes. Nature medicine. 12, 62-66 (2006).
  10. Ng, M., et al. Global, regional, and national prevalence of overweight and obesity in children and adults during 1980-2013: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013. Lancet. 384, 766-781 (2014).
  11. Kissebah, A. H., et al. Relation of body fat distribution to metabolic complications of obesity. The Journal of clinical endocrinology and metabolism. 54, 254-260 (1982).
  12. Bray, G. A., et al. Relation of central adiposity and body mass index to the development of diabetes in the Diabetes Prevention Program. The American journal of clinical nutrition. 87, 1212-1218 (2008).
  13. Klein, J., et al. What are subcutaneous adipocytes really good for. Experimental dermatology. 16, 45-70 (2007).
  14. Tran, T. T., Yamamoto, Y., Gesta, S., Kahn, C. R. Beneficial effects of subcutaneous fat transplantation on metabolism. Cell metabolism. 7, 410-420 (2008).
  15. Seale, P., Kajimura, S., Spiegelman, B. M. Transcriptional control of brown adipocyte development and physiological function--of mice and men. Genes & development. 23, 788-797 (2009).
  16. Kozak, L. P. Genetic variation in brown fat activity and body weight regulation in mice: lessons for human studies. Biochimica et biophysica acta. 1842, 370-376 (2014).
  17. Zhang, X., He, H., Yen, C., Ho, W., Lee, L. J. A biodegradable, immunoprotective, dual nanoporous capsule for cell-based therapies. Biomaterials. 29, 4253-4259 (2008).
  18. Yang, F., et al. The prolonged survival of fibroblasts with forced lipid catabolism in visceral fat following encapsulation in alginate-poly-L-lysine. Biomaterials. 33, 5638-5649 (2012).
  19. Chang, T. M. Artificial cells with emphasis on bioencapsulation in biotechnology. Biotechnology annual review. 1, 267-295 (1995).
  20. Chang, T. M. Hybrid artificial cells: microencapsulation of living cells. ASAIO journal. 38, 128-130 (1992).
  21. Koo, J., Chang, T. M. Secretion of erythropoietin from microencapsulated rat kidney cells: preliminary results. The International journal of artificial organs. 16, 557-560 (1993).
  22. Weidenauer, U., Bodmer, D., Kissel, T. Microencapsulation of hydrophilic drug substances using biodegradable polyesters. Part I: evaluation of different techniques for the encapsulation of pamidronate di-sodium salt. Journal of microencapsulation. 20, 509-524 (2003).
  23. Smidsrod, O., Skjak-Braek, G. Alginate as immobilization matrix for cells. Trends in biotechnology. 8, 71-78 (1990).
  24. Lewinska, D., Rosinski, S., Werynski, A. Influence of process conditions during impulsed electrostatic droplet formation on size distribution of hydrogel beads. Artificial cells, blood substitutes, and immobilization biotechnology. 32, 41-53 (2004).
  25. Chan, E. S., Lee, B. B., Ravindra, P., Poncelet, D. Prediction models for shape and size of ca-alginate macrobeads produced through extrusion-dripping method. Journal of colloid and interface science. 338, 62-72 (2009).
  26. Bhujbal, S. V., Paredes-Juarez, G. A., Niclou, S. P., de Vos, P. Factors influencing the mechanical stability of alginate beads applicable for immunoisolation of mammalian cells. Journal of the behavior of biomedical materials. 37, 196-208 (2014).
  27. Gushchina, L. V., Yasmeen, R., Ziouzenkova, O. Moderate vitamin A supplementation in obese mice regulates tissue factor and cytokine production in a sex-specific manner. Archives of biochemistry and biophysics. 539, 239-247 (2013).
  28. Ziouzenkova, O., et al. Retinaldehyde represses adipogenesis and diet-induced obesity. Nature. 13, 695-702 (2007).
  29. Yasmeen, R., Jeyakumar, S. M., Reichert, B., Yang, F., Ziouzenkova, O. The contribution of vitamin A to autocrine regulation of fat depots. Biochimica et biophysica acta. 1821, 190-197 (2012).
  30. Liu, W., et al. miR-133a regulates adipocyte browning in vivo. PLoS genetics. 9, e1003626(2013).
  31. Rao, R. R., et al. Meteorin-like is a hormone that regulates immune-adipose interactions to increase beige fat thermogenesis. Cell. 157, 1279-1291 (2014).
  32. Kir, S., et al. Tumour-derived PTH-related protein triggers adipose tissue browning and cancer cachexia. Nature. 513, 100-104 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Lin vivo

Похожие статьи