Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Трансфекции клеток RAW264.7 с люциферазы гена

21.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52807

⸱

18 июня 2015 г.

 ,  ,  , 
1Immunity and Infection Research Centre, Vancouver Costal Health Research Institute, 2Department of Surgery, University of British Columbia, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of British Columbia

В этой статье

Краткое содержание

Трансфекция в клеточную линию макрофагов, RAW264.7, затруднена из-за естественной реакции клетки на чужеродные материалы. Мы описали здесь щадящую, но надежную процедуру трансфекции репортерных генов люциферазы в клетки RAW264.7.

Аннотация

Трансфекция желаемых генетических материалов в клетки является неизбежной процедурой в биомедицинских исследованиях. Несмотря на то, что было описано множество методов, определенные типы клеток устойчивы ко многим из этих методов и обеспечивают низкую эффективность трансфекции1, что потенциально препятствует исследованиям в этих типах клеток. В этом протоколе мы представляем оптимизированную процедуру трансфекции для введения репортерных генов люциферазы в качестве плазмидной ДНК в линию макрофагов RAW264.7. Описаны два различных типа реагентов для трансфекции (на основе липидов и на основе полиаминов), а также приведены важные примечания по всему протоколу, чтобы гарантировать, что клетки RAW264.7 минимально изменяются в результате процедуры трансфекции, а любые полученные экспериментальные данные являются прямыми результатами экспериментальной обработки. Несмотря на то, что эффективность трансфекции может быть не выше по сравнению с другими методами трансфекции, описанная процедура достаточно надежна для обнаружения сигнала люциферазы в RAW264.7 без изменения физиологической реакции клеток на раздражители.

Введение

Трансфекция нуклеиновых кислот в клетках имеет разнообразный применение в научных исследованиях. Примеры включают в себя (1) гены репортер изучить роль различных элементов гена в экспрессии генов, (2) экспрессии белка плазмиды что экспрессия белка интерес, и (3) малых интерферирующих РНК подавляют экспрессию генов. Путем манипулирования уровня экспрессии отдельных генов и измерения перепада эффект таких манипуляций, исследователи могут вывести генные функции в выбранных биологических системах. Не все методы трансфекции обеспечивают те же эффективности трансфекции, и даже тот же метод трансфекции не трансфекции клеток всех типов в равной степени 1. Следовательно, различные методы трансфекции были разработаны такие как фосфат кальция методом, DEAE декстран, катионный липид трансфекции катионным, без липидов полимерной трансфекции, электропорации, и nucleofection 2,3.

Трансфекции в макрофагов ESPEбенно трудно из-за того, что макрофаги профессиональные фагоциты, которые очень чувствительны к посторонних материалов, включая бактерии, полученных (метилированный) ДНК 4. Введение чужеродной ДНК активирует Toll-подобный рецептор 9 (TLR9) путь, ведущий к продукции цитокинов и азотной окиси 5,6. Эти активированные макрофаги могут затем быть менее чувствителен к лечению, что исследователи намерены изучить.

Наша лаборатория постоянно transfects в RAW264.7 линию макрофагов клеток с люциферазных генов-репортеров, и мы разработали протокол, который достаточно прочный, чтобы люциферазы сигнал значительно выше, чем фон, но и достаточно мягкий для макрофагов оставаться на их состоянии покоя. Поведение трансфицированных клеток оценивали с помощью светлячка-репортерного гена люциферазы, несущим промоторную область IκBζ (pGL3- IκBζ). Выражение IκBζ активируется бактериальной компонента клеточной стенки губыopolyssacharide (ЛПС) 7,8, и подавляется в противовоспалительного цитокина, интерлейкин-10 (ИЛ-10) 8. Для учета изменения трансфекции среди скважин, мы сотрудничаем трансфекции управления плазмиды, содержащей ген люциферазы Renilla (например, phRL-TK) для целей нормализации. Протокол, описанный оптимизирован после тестирования различных параметров, включая сроки трансфекции, типа реагентов трансфекции, количества реагентов трансфекции и плазмидной ДНК, а также соотношение реагента для трансфекции плазмидной ДНК. Два трансфекции реагенты, включенные в этот протокол: (1) на основе липидов трансфекции реагента и (2) белок / полиамин на основе реагента для трансфекции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Очистка плазмидной ДНК

  1. Извлечение ДНК плазмиды с использованием набора maxiprep в соответствии с протоколом производителя. Ресуспендируют плазмидной ДНК в 500 мкл ТЕ-буфера.
  2. Выполните фенол: хлороформ: изоамиловый спиртовой экстракции и изопропанол осадков для удаления остаточных загрязняющих веществ бактериальных. Наличие LPS препятствует трансфекции 9.
    1. Добавить 500 мкл фенол: хлороформ: изоамиловый спирт (25: 24: 1, рН 8) с плазмидной ДНК и энергично встряхивают в течение 15 сек. Фенол вызывает ожоги кожи и обезболивающее, так ожоги не всегда чувствовал, пока не серьезный ущерб. Выполните фенол: извлечение изоамиловый в вытяжном шкафу и соблюдайте осторожность: хлороформ.
  3. Выдержите смесь в течение 5 мин при комнатной температуре. Центрифуга при 13000 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Передача 350 мкл верхней водной фазы в новую 1,5 мл пробирку.
  4. Добавить 350 мкл ТЕ-буфера в пробирку, которая содержит нижнюю органическую фазу, Встряхивать в течение 15 сек. Центрифуга при 13000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Передача 350 мкл верхней водной фазы в той же 1,5 мл пробирку.
  5. Добавить 70 мкл 3 М ацетата натрия (рН 5,2) и хорошо перемешать. Добавить 700 мкл 100% изопропанола. Все хорошо перемешать и инкубировать 10 мин при комнатной температуре. Центрифуга при 13000 мкг в течение 10 MiNaT 4 ° C. Удалить супернатант.
  6. Добавить 500 мкл 75% этанола в гранулах. Образцы перемешивают, чтобы смешивать и центрифуге при 5000 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Удалить супернатант. ДНК в осадке.
  7. Открыть крышку пробирки и просушить на воздухе осадок при КТ в течение 5 - 10 мин. Осадок должен стать прозрачным. Добавить 500 мкл ТЕ-буфера для ресуспендирования осадка ДНК. Нагревают при 50 - 60 ° С в течение 10 мин, чтобы растворить осадок ДНК.
  8. Измеряют поглощение при 260 нм (А260) и 280 нм (А280) с помощью спектрометра. Рассчитать концентрацию ДНК путем умножения значения A260 от 50 нг / мкл. Оценить качество ДНК calculatinг отношение А260 / А280. ДНК с высоким качеством должен дать соотношение A260 / A280 1,8 - 2,0.

2. культивирования клеток и посев

  1. Культура RAW264.7 клетки в DMEM с добавлением 9% фетальной телячьей сыворотки (DMEM / 9% FCS) в 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе. Во время каждого прохода, открепления клеток от пластины непрерывным отбором с использованием пипетки Пастера. Прохождение клетки каждые 2 дня, и семя 1,5 - 2 миллионов клеток на 10 см для культуры ткани, обработанной блюдо как акции. Оттепель новый запас клеток каждые 5 - 6 недель.
  2. В день трансфекции, семена 200000 клеток на лунку в 24-луночного планшета в объеме 500 мкл DMEM / 9% FCS. Инкубируйте клетки в течение 4 ч в 37 ° C инкубаторе.
  3. Трансфекции клетки либо с липидной основе реагента (шаг 3.1) или белок / полиамин на основе реагента (шаг 3.2).

3. Трансфекция

  1. На основе липидов трансфекции:
    1. Разминка трансфекции ReageNт до комнатной температуры в темноте. Разминка бессывороточной среды DMEM и / 9% ФТС до 37 ° C.
    2. Добавить 0,5 мкг плазмидной ДНК в 50 мкл бессывороточной среды в 1,5 мл пробирку. Добавьте 2 мкл реагента для трансфекции с кончика пипетки ниже поверхности жидкости. Вихрь в течение 6 сек.
    3. Оставьте смесь реагентов / ДНК в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин.
    4. Во время 30-минутной инкубации, извлеките носитель из колодца и добавить 250 мкл свежей DMEM / 9% FCS в каждую лунку.
    5. Через 30 мин добавляют 250 мкл DMEM / 9% FCS к смеси реагент / ДНК. Все хорошо перемешать с помощью пипетки вверх и вниз.
    6. Добавить 300 мкл разбавленной смеси в каждую лунку. Выдержите в течение 2 - 4 часов в 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе.
    7. Удалить трансфекции решение и добавить 500 мкл DMEM / 9% FCS. Инкубировать в течение 24 - 48 ч в 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе до стимуляции клеток.
  2. Белок / полиамин на основе трансфекции:
    1. Разминка бессывороточнаясредний и DMEM / 9% FCS до 37 ° С.
    2. Добавить 0,75 мкл реагента для трансфекции 18,75 мкл бессывороточной среды. Кратко Vortex перемешать. Инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин. Добавить 0,5 мкл 1 мкг / мкл ДНК в разбавленном трансфицированных реагента. Инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин.
    3. В 10-минутной инкубации, удалить носитель из каждой лунки 24-луночного планшета и добавить 250 мкл свежей DMEM / 9% FCS в каждую лунку.
    4. Через 10 мин добавляют 250 мкл DMEM / 9% FCS в смеси реагентов / ДНК.
    5. Добавить 270 мкл разбавленной смеси в скважине. Выдержите в 37 ° С и 5% СО 2 инкубатора для 2 - 4 ч.
    6. Удалить трансфекции решение и добавить 500 мкл DMEM / 9% FCS. Выдержите в течение 24 - 48 часов в 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе.

4. Стимулирование и сотовый анализа люциферазы

  1. Замените СМИ в хорошо 250 мкл свежей DMEM / 9% FCS.
  2. Добавить 50 мкл LPS LPS или IL +-10 В требуемых концентрациях до колодца. Возвращение пластины в 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе. Стимулируют для 2 - 6 ч.
  3. Удалить стимуляции решение стремлением, промыть холодной ледяной PBS и добавьте 200 мкл 1x Пассивный лизирующего буфера. Rock при комнатной температуре в течение 30 мин. Собрать и передачи лизат в 1,5 мл пробирки и удалить клеточного дебриса путем центрифугирования при 20000 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
  4. Передача 40 мкл очищенного лизата (надосадочной) в белом, прозрачным дном 96-луночного планшета для определения люциферазы сигналов в соответствии с протоколом производителя.
  5. Читайте люциферазы сигнал с люминометре по всей видимом спектре света.

5. Анализ данных

  1. Рассчитывают соотношение светлячка: Renilla путем деления отдельные значения люциферазы светлячка значениями Renilla люциферазы из каждой лунки.
  2. Рассчитайте изменение раза путем деления светлячка: Renilla соотношение лечить хорошочто необработанной скважины.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Рисунок 1 сравнивает эффективность трансфекции двух реагентов трансфекции в RAW264.7. На основе липидов реагент обычно дает около 25%, а скорость трансфекции белка / полиамин на основе трансфекции в результате около 5% эффективности (фиг.1А). Разница в эффективности трансфекции наблюдалось также в люциферазы сигналов в RAW264.7 клеток, трансфицированных pGL3-IκBζ промотора репортера (Фиг.1В). Добавление ЛПС в этих трансфицированных клеток увеличивается люциферазы светля...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Протокол, описанный здесь, не только сосредоточиться на эффективности трансфекции, но стремится найти баланс между эффективностью и сохранения физиологических состояний клеток. В частности, наша процедура удается свести к минимуму токсичность трансфекции реагента и максимизации люциферазы сигнал.

Один важный шаг в протоколе это здоровье клеток. Заросли культуры не подходят для трансфекции как их изменения физиологии и непрерывного культивирования клеток RAW264.7 в течение длительного периода...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было профинансировано грантом Канадского института исследований в области здравоохранения (CIHR). STC является обладателем премии за докторские исследования от CIHR и Фонда Майкла Смита. EYS является стипендиатом CIHR. В рамках учебной программы CIHR по трансплантации также предоставлялись стипендии для выпускников STC, EYS и SS.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
PureLink HiPure Plasmid Maxiprep KitLife TechnologiesK210007Любой набор maxiprep будет работать
Фенол:хлороформ:изоамиловый спиртLife Technologies15593-049Класс молекулярной биологии. Фенол токсичен, поэтому по возможности работайте в вытяжном шкафу. Используйте нижний прозрачный органический слой, если в емкости образуется два слоя жидкости.
DMEMThermo ScientificSH30243.01Тепло в 37 градусов; C водяной баней перед использованием.
Фетальная бычья сывороткаThermo ScientificSH30396.03Инактивирована при 56 °deg; C водяной баней в течение 45 минут перед использованием.
Opti-MEMLife Technologies31985-070Перед использованием нагреть как минимум до комнатной температуры.
XtremeGene HP DBA трансфекционный реагентRoche6366236001Перед применением нагрейте до комнатной температуры.
GeneJuiceEMD Millipore70967Перед использованием подогреть до комнатной температуры.
5x Пассивный буфер для лизисаPromegaE194130 мл входит в состав Dual Luciferase Reporter Assay
SystemPromegaE1910

Ссылки

  1. Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnol. 10 (1), 9-18 (2010).
  2. Thompson, C. D., Frazier-Jessen, M. R., Rawat, R., Nordan, R. P., Brown, R. T. Evaluation of methods for transient transfection of a murine macrophage cell line RAW 264.7. Biotechniques. 27 (4), 824-835 (1999).
  3. Kim, T., Eberwine, J. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
  4. Stacey, K. J., Sweet, M. J., Hume, D. A. Macrophages ingest and are activated by bacterial DNA. Journal of immunology. 157 (5), 2116-2122 (1996).
  5. Jiang, W., Reich, I. C., Pisetsky, D. S. Mechanisms of activation of the RAW264.7 macrophage cell line by transfected mammalian DNA. Cell Immunol. 229 (1), 31-42 (2004).
  6. Jiang, W., Pisetsky, D. S. The induction of HMGB1 release from RAW 264.7 cells by transfected DNA. Mol Immunol. 45 (7), 2038-2046 (2008).
  7. Hargreaves, D. C., Horng, T., Medzhitov, R. Control of inducible gene expression by signal-dependent transcriptional elongation. Cell. 138 (1), 129-147 (2009).
  8. Cheung, S. T., So, E. Y., Chang, D., Ming-Lum, A., Mui, A. L. Interleukin-10 inhibits lipopolysaccharide induced miR-155 precursor stability and maturation. PLoS One. 8 (8), e71336(2013).
  9. Weber, M., Moller, K., Welzeck, M., Schorr, J. Short technical reports. Effects of lipopolysaccharide on transfection efficiency in eukaryotic cells. Biotechniques. 19 (6), 930-940 (1995).
  10. Berghaus, L. J., et al. Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 33 (5), 443-456 (2000).
  11. Fiszer-Kierzkowska, A., et al. Liposome-based DNA carriers may induce cellular stress response and change gene expression pattern in transfected cells. BMC Mol Biol. 12 (1), 27-36 (2011).
  12. Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells. Biotechniques. 47 (7), 617-626 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Процедура трансфекцииреагент на основе липидовреагент на основе полиаминовлюцифераза светлячкалюцифераза Renillaлизис клетоклюминометрический анализпроточная цитометрия
Трансфекции клеток RAW264.7 с люциферазы гена
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.