Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Прямая белка Доставка клетках млекопитающих, используя сотовый проницаемым Cys

9.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/52814

⸱

25 марта 2015 г.

 , 
1Departments of Chemistry and Cell and Molecular Biology, The Scripps Research Institute, 2Shanghai Institute for Advanced Immunochemical Studies, ShanghaiTech University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Цинк-пальцев доменов по своей природе клеточных проницаемой и способны опосредовать доставку белка в широком диапазоне типов клеток млекопитающих. Здесь подробная шаг за шагом протокол для реализации технологии цинк-пальцем для внутриклеточной доставки белков представлена.

Аннотация

Благодаря своей модульности и способности к перепрограммированию для распознавания широкого спектра последовательностей ДНК, ДНК-связывающие домены Cys2-His 2-His на цинковых пальцах стали полезными инструментами для таргетной геномной инженерии. Как и многие другие ДНК-связывающие белки, цинковые пальцы также обладают врожденной способностью проникать через клеточные мембраны. Недавно мы продемонстрировали, что эта внутренняя клеточная проницаемость может быть использована для внутриклеточной доставки белка. Генетическое слияние мотивов цинковых пальцев приводит к эффективному транспорту белков и ферментов в широкий спектр типов клеток млекопитающих. В отличие от других технологий трансдукции белка, доставка через домены цинковых пальцев не подавляет активность фермента и приводит к высокому уровню доставки цитозольных веществ. Здесь представлен подробный пошаговый протокол реализации технологии цинкового пальца для доставки белка в клетки млекопитающих. Выделены ключевые шаги для достижения высоких уровней внутриклеточной доставки, опосредованной цинковыми пальцами, и обсуждаются стратегии максимизации производительности этой системы.

Введение

Высокоэффективные и универсальные стратегии доставки белка имеют решающее значение для многих фундаментальных исследований и терапевтического применения. Прямые поставки очищенных белков в клетках является одним из самых безопасных и простых способов для достижения этой цели. 1,2 В отличие от стратегий, которые полагаются на экспрессию генов из нуклеиновых кислот, 3-5 поставка белок не представляет никакого риска инсерционного мутагенеза, не зависит от сотовая транскрипции / трансляции техника и позволяет для немедленного эффекта. Тем не менее, отсутствие простых и обобщению методов наделяя активности клеток проникающим на белки обычно смешивает их непосредственное вступление в клетках. Современные методы, способствующие внутриклеточной доставки белка основаны на использовании природного происхождения или 6-8-клеток, направленных проникающих пептидов, 9-12 наддувом трансдукции доменов, 13,14 наночастиц 15 и липосомы, 16 вирусоподобные частицы 17,18 и полимерные микросфер материалы. 19 К сожалению, многие из этих подходов мешает низких сотовых ставок поглощения, 20,21 плохую стабильность, 22 случайного типа клеток специфичности, 23 низкая эндосомные свойств эвакуации 24 и токсичность. 25 Кроме того, многие белок трансдукции технологии уменьшить биологическую активность доставленного белков. 14

Наша лаборатория ранее показали, что цинк-пальцем нуклеазу (ZFn) белки - химерные эндонуклеаз рестрикции, состоящее из блока программируемого Cys 2 -Его 2 цинк-пальцев ДНК-связывающего белка и области расщепления рестриктазой Фоки 26-28 - по сути своей Cell- проницаемой. 29 Это удивительное клеток проникающим деятельность было показано, что внутреннее свойство специально разработанный области цинк-пальцев, ДНК-связывающий платформы, которая возникла в качестве мощного инструмента для целенаправленного геном ENинженерии, 30-32 и считается результатом созвездии шесть положительно заряженных остатков на поверхности белка. В самом деле, несколько ДНК-связывающих белков, в том числе с-июне и N-ДЭК, как было показано, обладают врожденной способностью пересекать клеточные мембраны. 33 Совсем недавно в нашей лаборатории расширен на этих результатах, и показано, что клетки-проникающей активность цинковых палец (ZIF) домены могут быть использованы для внутриклеточной доставки белков. Генетическая слияние либо одно- или двумя пальцами ZIF доменов в специфических белковых грузов привело к поглощению эффективности, превышающие многие традиционные системы доставки пептидных клеток проникающим. 34 В частности, ЗИФ-опосредованной доставки не поставить под угрозу деятельность плавленого ферментативной груза и способствовало высокие уровни цитозольного доставки. В совокупности эти данные показывают потенциал области ZIF для облегчения эффективного и легкое доставку белков, и, возможно, более разнообразные типы макроМолекулы, в клетки.

Здесь подробная шаг за шагом протокол о том, как реализовать ZIF технологии для доставки белка в клетках млекопитающих представлена. Ранее мы построили набор одно-, двух-, трех-, четырех-, пяти- и шести пальцев ZIF домены, которые не обладают способностью связывать ДНК, в связи с заменой каждого из ДНК-связывающих остатков α-спиральные, но способных доставлять белки в клетках 34 (Рис 1). Производство и трансдукция Изумрудного GFP (EmGFP) в HeLa клеток, используя два пальца ZIF домен описано. Этот протокол является расширяемым почти любого белка, способного растворимого выражения в кишечной палочки и практически любой млекопитающих типа клеток. Ожидаемые результаты предоставляются и стратегии для максимизации производительности этой системы также обсуждается.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Клонирование

  1. Получить аланин-замещенных двумя пальцами ZIF домены, которые были субклонировали в вектор экспрессии системы ПЭТ-28 и доступны по запросу (ПЭТ-2F-ZIF). 34
  2. ПЦР-амплификации EmGFP из плазмиды изумрудно-pBAD с праймерами 5 'XmaI-EmGFP (5'-GGAAATTG CCCGGG ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC-3'; Xma сайт я жирным шрифтом) и 3 'SacI-EmGFP (5'-CGGATCT GAGCTC TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3 " ; Sac сайт я жирным шрифтом).
    1. Использование 5 нг матричной ДНК, 10 мкл 10х буфера полимеразы, 1 единицы (и) полимеразы Taq ДНК, 0,2 мМ каждого дНТФ и 0,2 мкМ каждого праймера в 100 мкл раствора с остальной объем составил дистиллированной / деионизированной воды , Использование условий велосипедные: 95 ° C в течение 5 мин; 30 циклов 95 ° С в течение 30 сек, 55 ° С в течение 30 сек и 72 ° С в течение 1 мин; 72 ° С в течение 10 мин. Очищают продукт ПЦР с помощью гель-extracti, и определить концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра измерения ABS 260 х 50 мкг / мл.
  3. Дайджест ПЭТ-2F-ЗиФ и вставка, кодирующий EmGFP рестриктазами XMA I и Sac I, в рекомендуемой буфере в течение 3 ч при 37 ° С с использованием 10 U фермента на 1 мкг ДНК. Визуализация ДНК электрофорезом в агарозном геле с использованием флуоресцентного красителя интеркалирования, например, бромистым этидием.
  4. Очищают расщепленной ДНК через набора для экстракции геля и определяют концентрацию ДНК с помощью спектрофотометра измерения ABS 260 х 50 мкг / мл.
  5. Перевязывать очищенный EmGFP-кодирующей ДНК в 50-100 нг ПЭТ-2F-ZIF с помощью 1 ед Т4 ДНК-лигазы, по крайней мере, 1 ч при комнатной температуре. Для достижения наилучших результатов, проводить реакцию лигирования с использованием 6: вставка изображений в векторные молярное соотношение 1.
  6. Оттепель 50 мкл любых химически компетентных XL-1 синий кишечной палочки клеток на льду и аккуратно перемешать с 10-20 нг лигированного рЕТ-2F-ЗИФ-EmGFP.
  7. Держите на льду в течение 30 мин. Тепловой удар смесь при 42 ° С в течение 90 сек и восстановления клеток в 2 мл Супер оптимального бульона с катаболитной репрессии (SOC) в течение 1 часа при 37 ° C при встряхивании.
  8. Распространение 100 мкл восстановления культуры на лизогении бульона (LB) агаром с 50 мкг / мл канамицина, и инкубируют O / N при 37 ° С.
  9. На следующий день, инокуляции 6 мл супер бульон (СО) или LB культуры, содержащей 50 мкг / мл канамицина с одной колонии с LB агаром и культуры O / N при 37 ° С.
    Примечание: ПЦР колоний с использованием праймеров 5 'XmaI-EmGFP и 3' SacI-EmGFP может быть использован для идентификации положительных клонов до минипрепаративную.
  10. Очищают ПЭТ-2F-ЗИФ-EmGFP по минипрепаративную и подтвердить плазмиды путем секвенирования ДНК с использованием промотора Т7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ').

2. Экспрессия и очистка

  1. Оттепель 50 мкл химически компетентным BL21 Е. палочки клетки на льду и аккуратно перемешать с 100 нг ПЭТ-2F-ЗИФ-EmGFP плasmid. Transform, как описано в шагах 1,7-1,8.
  2. На следующий день, инокуляции 10 мл LB среды, содержащей 50 мкг / мл канамицина с одной колонии и расти O / N при 37 ° C при встряхивании.
  3. На следующий день, разбавить 10 мл O / N культуры в 1 л LB среде, содержащей 50 мкг / мл канамицина, 0,2% глюкозы и 100 мкМ ZnCl 2. Выращивают культуру при 37 ° С при встряхивании до оптической плотности при 600 нм (OD 600) 0,8 и индуцируют экспрессию белка с 2 мМ изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG). После 6 ч роста при 37 ° С, урожай клеток путем центрифугирования при 5000 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
    Примечание: условия индукции сильно варьирует и зависит от стабильности белков выражается. не Монитор OD 600 каждые 30 мин до достижения OD 600 0,8 достигается.
  4. Ресуспендируют осадок клеток в 5 мл буфера для лизиса (50 мМ Трис-HCl, 500 мМ NaCl, 100 мкМ ZnCl 2, 1 мМ дитиотреитола (ДТТ), 1 мМ MgCl 2, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ), и 10 мМ имидазола, рН 8,0). Лизировать клетки на льду с помощью ультразвука со следующей установкой: 50% выходной мощности, 4 мин Время процесс с 5 сек на / 10 сек выкл промежутки времени. Избегайте перегрева решение.
  5. Центрифуга клеточного лизата при 25000 х г в течение 30 мин при 4 ° С и передачи супернатант в свежую пробирку. Для достижения наилучших результатов, выполните все следующие шаги при 4 ° С.
  6. Запуск супернатанта через колонку, заполненную предварительно 1 мл, уравновешенную Ni-NTA суспензии. Промыть смолу с 20 мл промывочного буфера (50 мМ Трис-HCl, 500 мМ NaCl, 100 мкМ ZnCl 2, 1 мМ DTT, 1 мМ MgCl 2 и 30 мМ имидазола, рН 8,0).
  7. Элюируют белок с 5 мл буфера для элюции (50 мМ Трис-HCl, 500 мМ NaCl, 100 мкМ ZnCl 2, 1 мМ DTT, 1 мМ MgCl 2, и 300 мМ имидазола, рН 8,0).
  8. Буфер обмена элюированную белок с буфером памяти (50 ммТрис-HCl, 500 мМ NaCl, 100 мкМ ZnCl 2, 1 мМ ДТТ, 1 мМ MgCl 2 и 10% глицерина, рН 8,0) и концентрируют белок, по крайней мере, 40 мкм с использованием спиновой концентратор центрифугированием в соответствии с инструкциями изготовителя.
  9. Определить концентрацию белка в BCA или Бредфорда. Смешайте 2 мкл очищенных белков с 2 мкл 2 × SDS-PAGE красителем, кипятить на 95 ° С в течение 10 мин, а затем решить на 4% -20% Трис-Глицин SDS-PAGE для оценки чистоты белка (Рисунок 2).

3. Белки хранения

  1. Алиготе концентрированный белок, флэш-замораживание в жидком азоте и хранят при -80 ° С. Для слитых белков EmGFP, охватывают трубу с алюминиевой фольгой, чтобы защитить белок от света.
  2. Избегайте повторного замораживания и оттаивания раствора белка. Примечание: ЗИФ-слитые белки являются стабильными при этих условиях, по крайней мере 1 месяц. Пожаловаться или> 4 месяц хранения может привестидля осаждения белка или фотообесцвечивание EmGFP.

4. Белки трансдукции

  1. Поддержание HeLa клеток в среде Игла в модификации Игла (DMEM), содержащей 10% (об / об) фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% антибиотиков противогрибковое при 37 ° C в полностью влажной атмосфере с 5% CO 2.
    Примечание: Клетки пассировать более чем в 30 раз не рекомендуется для белка трансдукции.
  2. Предварительное покрытие 24-луночный планшет с 500 мкл 50 мкг / мл поли-лизина от 30 до 60 мин при 25 ° С. Семенной клеток на 24-луночный планшет при плотности 2 × 10 5 клеток на лунку. В 24 ч после посева, или только клетки между 80% -90% сливной, извлекайте носитель из каждой лунки и промыть 500 мкл подогретого бессывороточной DMEM (SFM).
  3. В каждую лунку добавьте 250 мкл SFM, содержащего 2 мкМ ЗИФ-EmGFP белка и 100 мкМ ZnCl 2. Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение 1 часа. Примечание: ZIF доменов проникать в клетки прimarily через макропиноцитозом, 34, который является механизмом энергии зависит. Таким образом, клетки должны быть инкубировали при 37 ° С в течение эффективного интернализации белка.
  4. Удалить носитель из клеток и мыть три раза 500 мкл кальцием и магнием, свободных забуференный фосфатом физиологический раствор Дульбекко (DPBS) с добавкой 0,5 мг / мл гепарина. Примечание: Гепарин необходимо удалить поверхностно-св занный белок, который может осложнить вниз по течению анализов.
  5. (Необязательно) Повторные обработки до трех раз за повышенной доставки.
  6. Изолировать обработанных клеток сразу же после того, как гепарин мыть расщеплением 0,05% трипсин-ЭДТА при 37 ° С в течение 2 мин. Повторное приостановить отдельные клетки в 0,5 мл DPBS с добавлением 1% FBS.
  7. Измерьте интенсивность флуоресценции каждого образца с помощью проточной цитометрии 35, используя флуоресцеинизотиоцианат (FITC) канала (рисунок 3). Отрегулируйте вперед рассеяния (FSC) и боковое рассеивание (SSC), чтобы поместить населениепроценты по шкале, гарантируя, что популяции с различными свойствами решаются друг от друга.
  8. Сбор 10000 живые события для каждого образца и анализировать данные с помощью проточной цитометрии анализа данных программного обеспечения. 36 Нормализация флуоресценции HeLa клеток, обработанных ЗИФ-EmGFP с этими клетками, обработанными только SFM.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Двумя пальцами ЗИФ-EmGFP слитые белки могут быть выражены в E. палочка с> 95% гомогенности и высокой урожайности (> 25 мг / мл) (Рисунок 2). В общем, одно- и двумя пальцами слитые белки ZIF могут быть получены в количествах, почти идентичных тем, которые дикого типа немодифицированного белка. Тем не менее, в некоторых случаях, пяти- и шести пальцев белки ЗиФ слияния не могут быть произведены в доходности достаточно высоких для последующих применений.

Непосредс...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь шаг за шагом протокол для доставки белка с помощью мобильного проницаемым цинка палец (ZIF) домены представлена. Домен ЗиФ не снизить активность плавленого ферментативной груза 34; позволяет для производства и очистки белков урожайности почти идентичны тем, которые наблюдаются при немодифицированного белка; и может транспортировать белки и ферменты в широком диапазоне типов клеток с эффективностью, которые превышают традиционные пептид или белок системы домена трансдукции клеток-проникающей. Вместе, эти...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным институтом здоровья (DP1CA174426 Карлоса Ф. Barbas) и ShanghaiTech университета, Шанхай, Китай (до JL). Молекулярные графика были получены с использованием PyMOL.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
XmaINew England BiolabsR0180L
SacINew England BiolabsR0156L
Expand High Fidelity PCR systemRoche11759078001
dNTPsNew England BiolabsN0446S
4%-20% Tris-Glycine Mini протеиновые гели, 1,5 мм, 10 лунокLife TechnologiesEC6028BOX
2x Laemmli SampleBufferBioRad 161-0737
T4 DNA LigaseLife Technologies15224-017
BL21 (DE3) Компетентный E. coliNew England BiolabsC2527I
IPTGThermo ScientificR0391
Хлорид цинкаSigma-Aldrich208086-5G
Канамицина сульфатFisher ScientificBP906-5
ГлюкозаSigma-AldrichG8270-100G
Tris BaseFisher ScientificBP152-25
Sodium ChlorideSigma-AldrichS9888-25G
DTTFisher ScientificPR-V3151 
PMSFThermo Scientific36978
Ni-NTA Агарозная смолаQIAGEN30210
ГлицеринSigma-AldrichG5516-500ML
ИмидазолSigma-AldrichI5513-25G
Amicon Ultra-15 Центробежные фильтрующие блокиEMO MilliporeUFC900324
DMEMLife Technologies11966-025
Фетальная бычья сывороткаLife Technologies10437-028
Антибиотик-антимикотик Life Technologies15240-062
24-луночная пластина с плоским дномSigma-AldrichCLS3527-100EA
Поли-лизинSigma-AldrichP7280
DPBS, без кальция, без магнияLife Technologies21600010
гепаран сульфатSigma-AldrichH4777
TrypsinLife Technologies
Элементы HeLaATCCCCL-2
Nano Drop ND-1000 спектрофотометр Thermo Fisher QIAGEN
28104
Набор для экстракции геля QIAquickQIAGEN28704
25300054Набор для очистки ПЦР QIAquick от

Ссылки

  1. Berg, A., Dowdy, S. F. Protein transduction domain delivery of therapeutic macromolecules. Curr. Opin. Biotechnol. 22, 888-893 (2011).
  2. Lindsay, M. A. Peptide-mediated cell delivery: application in protein target validation. Curr. Opin. Pharmacol. 2, 587-594 (2002).
  3. Luo, D., Saltzman, W. M. Synthetic DNA delivery systems. Nat. Biotechnol. 18, 33-37 (2000).
  4. Guo, X., Huang, L. Recent advances in nonviral vectors for gene delivery. Acc. Chem. Res. 45, 971-979 (2012).
  5. Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 4, 346-358 (2003).
  6. Frankel, A. D., Pabo, C. O. Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell. 55, 1189-1193 (1988).
  7. Elliott, G., O'Hare, P. Intercellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein. Cell. 88, 223-233 (1997).
  8. Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. J. Biol. Chem. 269, 10444-10450 (1994).
  9. Smith, B. A., et al. Minimally cationic cell-permeable miniature proteins via alpha-helical arginine display. J. Am. Chem. Soc. 130, 2948-2949 (2008).
  10. Daniels, D. S., Schepartz, A. Intrinsically cell-permeable miniature proteins based on a minimal cationic PPII motif. J. Am. Chem. Soc. 129, 14578-14579 (2007).
  11. Karagiannis, E. D., et al. Rational design of a biomimetic cell penetrating peptide library. ACS Nan. 7, 8616-8626 (2013).
  12. Gao, S., Simon, M. J., Hue, C. D., Morrison, B., 3r,, Banta, S. An unusual cell penetrating peptide identified using a plasmid display-based functional selection platform. ACS Chem. Biol. 6, 484-491 (2011).
  13. Fuchs, S. M., Raines, R. T. Arginine grafting to endow cell permeability. ACS Chem. Biol. 2, 167-170 (2007).
  14. Cronican, J. J., et al. Potent delivery of functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo using a supercharged protein. ACS Chem. Biol. 5, 747-752 (2010).
  15. Panyam, J., Labhasetwar, V. Biodegradable nanoparticles for drug and gene delivery to cells and tissue. Adv. Drug Deliv. Rev. 55, 329-347 (2003).
  16. Zelphati, O., et al. Intracellular delivery of proteins with a new lipid-mediated delivery system. J. Biol. Chem. 276, 35103-35110 (2001).
  17. Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. Protein delivery using engineered virus-like particles. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 16998-17003 (2011).
  18. Voelkel, C., et al. Protein transduction from retroviral Gag precursors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7805-7810 (2010).
  19. Sinha, V. R., Trehan, A. Biodegradable microspheres for protein delivery. J. Control Release. 90, 261-280 (2003).
  20. Liu, J., Gaj, T., Patterson, J. T., Sirk, S. J., Barbas, C. F. 3rd Cell-penetrating peptide-mediated delivery of TALEN proteins via bioconjugation for genome engineering. PLoS One. 9, e85755(2014).
  21. Ramakrishna, S., et al. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. Genome Res. 24, 1020-1027 (2014).
  22. Fuchs, S. M., Raines, R. T. Polyarginine as a multifunctional fusion tag. Protein Sci. 14, 1538-1544 (2005).
  23. Mai, J. C., Shen, H., Watkins, S. C., Cheng, T., Robbins, P. D. Efficiency of protein transduction is cell type-dependent and is enhanced by dextran sulfate. J. Biol. Chem. 277, 30208-30218 (2002).
  24. Al-Taei, S., et al. Intracellular traffic and fate of protein transduction domains HIV-1 TAT peptide and octaarginine. Implications for their utilization as drug delivery vectors. Bioconjug. Chem. 17, 90-100 (2006).
  25. Jones, S. W., et al. Characterisation of cell-penetrating peptide-mediated peptide delivery. Br. J. Pharmacol. 145, 1093-1102 (2005).
  26. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat. Rev. Genet. 11, 636-646 (2010).
  27. Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. Genetics. 188, 773-782 (2011).
  28. Guo, J., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd, 3rd, Directed evolution of an enhanced and highly efficient FokI cleavage domain for zinc finger nucleases. J. Mol. Biol. 400, 96-107 (2010).
  29. Gaj, T., Guo, J., Kato, Y., Sirk, S. J., Barbas, C. F. 3rd Targeted gene knockout by direct delivery of zinc-finger nuclease proteins. Nat. Methods. 9, 805-807 (2012).
  30. Gersbach, C. A., Gaj, T., Barbas, C. F. 3rd, 3rd, Synthetic zinc finger proteins: the advent of targeted gene regulation and genome modification technologies. Acc. Chem. Res. 47, 2309-2318 (2014).
  31. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).
  32. Perez-Pinera, P., Ousterout, D. G., Gersbach, C. A. Advances in targeted genome editing. Curr. Opin. Chem. Biol. 16, 268-277 (2012).
  33. Cronican, J. J., et al. A class of human proteins that deliver functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo. Chem. Biol. 18, 833-838 (2011).
  34. Gaj, T., Liu, J., Anderson, K. E., Sirk, S. J., Barbas, C. F., 3rd, Protein delivery using Cys2-His2 zinc-finger domains. ACS Chem. Biol. 9, 1662-1667 (2014).
  35. Radcliff, G., Jaroszeski, M. J. Basics of flow cytometry. Methods Mol. Biol. 91, 1-24 (1998).
  36. Mercer, A. C., Gaj, T., Sirk, S. J., Lamb, B. M., Barbas, C. F. 3rd Regulation of endogenous human gene expression by ligand-inducible TALE transcription factors. ACS Synth. Biol. 3, 723-730 (2014).
  37. Segal, D. J., Crotty, J. W., Bhakta, M. S., Barbas, C. F. 3rd, Horton, N. C. Structure of Aart, a designed six-finger zinc finger peptide, bound to DNA. J. Mol. Biol. 363, 405-421 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Прямая белка Доставка клетках млекопитающих, используя сотовый проницаемым Cys
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.