Альгинат инкапсуляции плюрипотентных стволовых клеток, используя коаксиальный Насадка

Краткое содержание

Мы разработали метод инкапсуляции плюрипотентных стволовых клеток (PS-клеток) в альгинатные гидрогелевые капсулы с помощью коаксиальной насадки. Это предотвращает чрезмерную агрегацию клеток и ограничивает напряжение сдвига, испытываемое клетками в суспензионной культуре. Методика применима для массового производства PS-клеток, а также для исследований ниши стволовых клеток.

Аннотация

Плюрипотентные стволовые клетки (PS-клетки) находятся в центре интенсивных исследований из-за их роли в регенеративной медицине и скрининге лекарств. Тем не менее, для использования PS-клеток в этих приложениях потребуется разработка системы массового культивирования. Суспензионное культивирование является одним из перспективных методов культивирования для массового производства PS-клеток, хотя некоторые проблемы, такие как контроль агрегации и ограничение напряжения сдвига от питательной среды, до сих пор не решены. Для решения этих задач был разработан метод инкапсуляции альгината кальция (Alg-Ca) с помощью коаксиального сопла. Этот метод позволяет легко контролировать размер капсул за счет совместного потока газа N₂. Контролируемый диаметр капсулы должен быть больше 500 мкм, так как слишком высокая скорость потока газа_N2 приводит к разрушению капель и, следовательно, капсул неоднородного размера. Более того, низкая концентрация Alg-Na и CaCl₂ приводит к образованию несферических капсул. Несмотря на то, что капсула Alg-Ca без покрытия из Alg-PLL легко растворяется, позволяя собирать клетки, они также потенциально могут вытекать из капсул, не имеющих покрытия Alg-PLL. Действительно, альгинатное покрытие PLL может предотвратить утечку клеток, но его также трудно сломать. Эта технология может быть использована для исследования ниши стволовых клеток, а также для массового производства PS-клеток, поскольку инкапсуляция может изменить микроокружение, окружающее клетки, включая внеклеточный матрикс и концентрацию секретируемых факторов.

Введение

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPS-клетки) в настоящее время являются источником интенсивных исследований из-за их роли в регенеративной медицине. Однако для регенерации тканей требуется огромное количество клеток. Например, примерно один миллиард клеток поджелудочной железы требуется^{для пациента с} диабетом 1 типа. Тем не менее, традиционная культура в чашке способна получить только 1 × 10⁵ клеток/^см2, таким образом, требуется 1^м2 площади культивирования для получения достаточного количества клеток поджелудочной железы, полученных из стволовых клеток, для лечения пациента с диабетом 1 типа. Таким образом, для регенеративной медицины требуется разработка системы для массового культивирования плюрипотентных стволовых клеток, таких как микроноситель² и суспензионная культура. Суспензионная культура представляет собой многообещающий метод массового культивирования, но контроль агрегации клеток является сложной задачей в культурах прямой суспензии iPS-клеток человека³. Действительно, взвешенные клетки подвергаются напряжению сдвига, что вызывает повреждение клеток³ или дифференцировку⁴.

Исследования в области инкапсуляции на основе гидрогеля были проведены для решения проблем, связанных с культурой суспензий. В гидрогелевых капсулах клетки защищены от потока среды. В предыдущих отчетах было задокументировано использование различных типов гидрогелей, включая агарозу⁵, ПЭГ⁶ и альгинат (Alg), для клеточной инкапсуляции. Гидрогель Alg-Ca является одним из самых полезных гидрогелей для инкапсуляции клеток, поскольку гидрогель Alg-Ca образуется сразу после капли раствора альгината в раствор CaCl₂, а также легко усваивается ферментами или хелатирующими реагентами.

Здесь мы установили стабильный процесс инкапсуляции альгината для iPS-клеток с использованием коаксиального сопла. Используя газовый поток_N2 для формирования капель, можно инкапсулировать клетки в однородные капсулы без необходимости использования других реагентов, таких как масло. В этом методе скорость потока_N2 и концентрация как CaCl2,_{так и} альгината являются основными рабочими условиями, влияющими на размер, форму и однородность капсул. В этом отчете показана оптимизация этих условий эксплуатации с помощью высокоскоростной камеры и микроскопа.

Протокол

1. Подготовка материалов

1. Подготовьте 10 мм HEPES буфера. Доводят рН до 7,0 при комнатной температуре и добавляют NaCl до 0,9%.
2. Готовят 5% раствора альгината и раствора 10 мМ ЭДТА, смешивая HEPES-буферный солевой раствор, приготовленный в 1,1. Доводят рН до 7,0 при комнатной температуре.
3. Автоклав реагенты (1.1, 1.2) в течение 20 мин при 121 ° С.
4. Подготовьте желатин покрытием 60 мм блюда, покрытые 1,2 - 2,0 × 10 ⁶ мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) клеток, которые рассматриваются как фидерных клеток путем инкубации в течение DMEM, содержащей 10% ES-высококвалифицированных FBS и 10 мкг / мл митомицина С в течение 90 - 120 мин.
5. Поддерживать мыши индуцированной плюрипотентных стволовых (плюрипотентных) клеток на блюдо с питающими клетками в присутствии 5 мл DMEM высокий уровень глюкозы, содержащей 20% ES-квалифицированным FBS, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола, несущественные аминокислоты, и антибиотиков ( 100 ед / мл пенициллина G натрия, 100 мкг / мл стрептомицина сульфата и 250 нг / мл amphoteriCIN Б).
6. Семя 4 х 10 ⁵ клеток плюрипотентных на желатин покрытием 60 мм блюдо и инкубировать их при 37 ° С и 5% CO _2. Изменить культуральной среде каждый день во время инкубации. Через 3 - 4 дней культивирования клеток Trypsinize в течение 1 мин с 500 мкл 0,05% трипсина, содержащий 0,02% ЭДТА при 37 ° С и 5% СО _2. После этого отделить клетки нажав культуре блюдо десять раза.
7. Добавить 2,5 мл DMEM с 10% ES-квалифицированный ФБС и антибиотики (следующие плюрипотентных клеток мыши диссоциации в отдельных клеток с помощью пипетки с 1000 мкл микропипетки три раза) центрифуги клеточной суспензии при 160 × г в течение 3 мин и удалить супернатант, и подсчет клеток , После подсчета клеток, повторное заполнение собранных клеток на желатин покрытием блюдо и инкубировать в течение 30 мин, чтобы изолировать клетки плюрипотентных из MEF клеток. После подсчета клеток (обычно 1 - 3 × 10 ⁶ клеток / блюдо могут быть собраны) повторное заполнение 4 × 10 ⁵ плюрипотентных клеток отблюдо.

2. Сотовый инкапсуляции в альгината гидрогеля капсул

1. Сбор клеток по той же методике, описанной в 1.5 и 1.6. После центрифугирования при 160 × г в течение 3 мин, промыть осадок клеток IPS с HEPES-буферным раствором трижды. После повторного суспендирования клеток в HEPES-буферным раствором, фильтр клеточной суспензии через 40 мкм ячейки фильтра, чтобы удалить крупные агрегаты, которые в противном случае могут засорить сопло.
2. Смешайте 2 мл клеточной суспензии в течение HEPES-буферным раствором и 3 мл 5% -ного раствора Na-Alg. Наконец 5 мл суспензии клеток в пределах 3% -ным раствором Alg-Na получают. Плотность клеток желательно более 10 ⁶ клеток / мл.
3. После сбора клеток суспензии в 5 мл шприц, установить коаксиальный сопло (рис 1а, б) на шприц и установите их на шприцевой насос. Испустите N ₂ поток газа (ниже, чем 1 л / мин) через внешнюю иглу коаксиального сопла иизгнать клеточной суспензии через внутреннее сопло.
4. Сбор капель в 250 мл 0,5% -ного раствора CaCl ₂ и ждать 10 - 20 мин для образования геля при перемешивании при 60-90 оборотов в минуту.

3. Лечение альгината капсул (по желанию)

1. Инкубируйте Alg-CA капсулы в 0,05% (вес / объем) поли-L-лизин (PLL) раствор в течение 5 мин при 37 ° С и 5% СО _2.
2. После промывки капсулы с HEPES-буферным раствором, инкубируют их в среде DMEM, содержащей 10% FBS с целью нейтрализации электрического заряда на их поверхности. Используйте их как капсул, покрытых (рис 1в).
3. Инкубируйте капсулы в HEPES-буферным раствором, содержащим 10 мМ ЭДТА в течение 5 мин. В обработанной ЭДТА капсул используются как полые капсулы (рис 1c).

4. Культура и сбора клеток в альгината капсул

1. Инкубируйте инкапсулированные клетки при 75 оборотах в минуту при встряхивании при 37 ° С и 5% CO ₂на 10 дней.
2. Сбор и инкубировать капсулы в 10 мМ ЭДТА при 37 ° С и 5% СО ₂ в течение 10 мин. Собирают клетки из альгинатных капсул без обработки ФАПЧ центрифугированием при 1000 х г в течение 3 мин.
3. Если альгината капсулы обрабатывают с PLL, сломать мембрану Alg-PLL с помощью пипетки вверх и вниз около десяти раз с иглой со шприцем и центрифуги это при 1000 - 5000 × г в течение 5 мин. Диаметр иглы должен быть ниже, чем размер капсулы и 25 г игл (260 мкм) использовали в этом эксперименте (600 мкм)
4. После центрифугирования собирают осадок клеток строго с разбитыми мембран Alg-PLL, если вы хотите, чтобы собрать образцы мРНК из клеток. Остальные Alg-PLL мембраны, возможно, предотвратить очистку мРНК.

Результаты

В протоколе 2.5 исключен альгинат решение образует сферическую форму сразу после изгнания (рис 2A - H). Если суспензию исключили со скоростью потока N ₂ ниже, чем 1 л / мин, размер капель равномерна (рис 2I). Тем не менее, если поток Н ₂ выше 1 л / мин, капли ломается (рис 2G, белый стрелками) и размер капель будет гетерогенную (рис 2J). Учитывая это, трудно приготовить капли меньшего размера, чем 500 мкм с использованием этого мет...

Обсуждение

Инкапсуляция культура может быть по сравнению с прямыми суспензионных культур. Суспензионной культуре является более простой способ получения больших количеств плюрипотентных стволовых клеток, чем способов инкапсулирования. Тем не менее, управление агрегацию клеток в суспензионной культуре по-прежнему сложным. В методе инкапсуляции, клеточной агрегации ограничен в капсулы и может, следовательно, быть хорошо контролируется. Предыдущая публикация показала, что инкапсулированные клетки образуются агрегаты одинакового...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Фибробласты эмбриона мыши	Cell Biolabs	SNL 76/7
Мышиная индуцированная плюрипотентная стволовая клетка	RIKEN Bio resorce centre	iPS-MEF-Ng-20D-17
DMEM high-glucose	GIBCO	11995
ES квалифицирован  FBS	GIBCO	16141079
антибактериальные антибиотики	GIBCO	15240
заменимые аминокислоты	GIBCO	11140
2-меркаптоэтанол	GIBCO	21985-023
ESGRO фактор ингибирования лейкемии	Merck миллипор	ESG1107
трипсин/ЭДТА	GIBCO	25300
Игла 26 G/16 G	Hoshiseido
10 мл Шприц	TERUMO	SS-10ESZ
Sodium  Хлорид	Wako	191-01665
HEPES	SIGMA	H4034
Альгинат натрия	Wako	194-09955
Хлорид кальция	Wako	039-00475
Поли-L-лизин (MW = 15,000 - 30,000)	SIGMA	P7890
EDTA	DOJINDO	345-01865
Насос Sylinge	AS ONE
Микроскоп	Olympus	IX71
Микроскоп	Leica	DM IRB
Hispeed camera	nac image technology	Memrecam HX-3