Этот протокол ко-иммунопреципитации позволяет изучить взаимодействие между нуклеопротеином вируса гриппа А и противовирусным белком Mx1 в клетках человека. В протоколе подчеркивается важность N-этилмалеимида для успешной совместной иммунопреципитации нуклеопротеина Mx1 и вируса гриппа А.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Co-иммунопреципитации белка мыши MX1 с вирусом гриппа А нуклеопротеидную
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Изучение взаимодействия между белками является ключом к пониманию их функций (функций). Очень мощный метод, который часто используется для изучения взаимодействий белков с другими макромолекулами в сложном образце, называется ко-иммунопреципитацией. Описанный протокол ко-иммунопреципитации позволяет продемонстрировать и в дальнейшем исследовать взаимодействие между противовирусным белком устойчивости к миксовирусу 1 (Mx1) и одной из его вирусных мишеней – нуклеопротеином (НЧ) вируса гриппа А. Протокол начинается с трансфицированных клеток млекопитающих, но в качестве исходного материала также можно использовать клетки, инфицированные вирусом гриппа А. После лизиса клетки вирусный NP-белок оттягивается специфическим антителом, а полученные иммунные комплексы осаждаются гранулами белка G. Успешное вытягивание НЧ и ко-иммунопреципитация противовирусного белка Mx1 впоследствии выявляются с помощью вестерн-блоттинга. Предпосылкой для успешной совместной иммунопреципитации Mx1 с НЧ является наличие N-этилмалеимида (NEM) в буфере для лизиса клеток. NEM алкилатирует свободные тиоловые группы. Предположительно, эта реакция стабилизирует слабое и/или транзиторное взаимодействие NP-Mx1 путем сохранения специфической конформации Mx1, его вирусной мишени или неизвестного третьего компонента. Важным ограничением экспериментов с коиммунопреципитацией является непреднамеренное вытягивание загрязняющих белков вниз, вызванное неспецифическим связыванием белков с белками белка G или антителами. Поэтому очень важно включить контрольные настройки, чтобы исключить ложноположительные результаты. Описанный протокол ко-иммунопреципитации может быть использован для изучения взаимодействия белков Mx различных видов позвоночных с вирусными белками, любой парой белков или белка с другими макромолекулами. Благотворная роль NEM в стабилизации слабых и/или переходных взаимодействий должна быть проверена для каждой пары взаимодействий в отдельности.
Введение
Myxovirus сопротивление (Mx) белки являются важной частью врожденной иммунной защиты против вирусных патогенов. Эти белки являются крупные динамин, как GTPases, индуцированные типа I и типа III интерфероны. Соответствующие гены Mx присутствуют почти во всех позвоночных, в одной или нескольких копий и их генные продукты ингибируют широкий спектр вирусов, включая Orthomyxoviridae (например., Вируса гриппа), Rhabdoviridae (например., Вируса везикулярного стоматита), буньявирусов (например. Ла вирус Кросс) и Retroviridae (например, вирус иммунодефицита человека-1) 1-4. Неясно, как эти белки признать такой широкий спектр виру....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Примечание: Следующий протокол трансфекции и со-иммунопреципитации создается на 9 см Петри формате блюдо. Другие форматы также возможны после масштабирования протокол.
1. Посев в почках человеческого эмбриона (НЕК) 293Т
- Семени клетки HEK293T один день до трансфекции в 1,2 × 10 6 клеток на 9 см чашки Петри в 12 мл среды Дульбекко, модифицированной Игла (DMEM) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 0,4 мМ Na-пируват, 0,1 мМ заменимых аминокислот, 100 ед / мл пенициллина и 0,1 мг / мл стрептомицина.
- Растут ячеек 16 ч при 37 ° С и 5% СО 2.
- Осмотрите морфологию и ж....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
N-этилмалеимид является органическое соединение, которое может быть использовано для необратимо изменить свободных тиоловых групп, например, для ингибирования цистеинпротеаз (рис 1).
Белок противовирусный Mx1 ингибирует вирус гриппа А репликацию, взаимодействуя с нуклеопротеина. Оптимизирован протокол о сотрудничестве иммунопреципитацию описано здесь позволяет изучать это взаимодействие NP-MX1. HEK293T клетки трансфицировали векторами экспрессии для противовирусного.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Изучение взаимодействия между противовирусных белков и их вирусных целей очень важно, чтобы понять детали противовирусного механизма этих белков. Это может дать новые знания о том, вирусы и их хозяева совместно эволюционировали и быть основой для разработки новых противовирусных стратегий. Оптимизирован протокол о сотрудничестве иммунопреципитацию описано здесь позволяет изучать взаимодействие между белком мыши MX1 и его вирусной цели, гриппа НП белка. Наиболее важным аспектом этого протокола является добавление NEM в б.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Благодарности
Эта работа была поддержана FWO Фландрии, проект ИОФ IOF10 / Startt / 027 и Гентский университет Специальный научно-исследовательский Грант BOF12 / ГОА / 014.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| DMEM с высоким содержанием глюкозы | Gibco | 52100-047 | |
| N-этилмалеимид | Sigma | E-3876 | Токсичный |
| Igepal CA-630 | Sigma | I-30212 | также известный как NP40 |
| Коктейль ингибиторов протеазы | Roche | 11 873 580 001 | |
| анти-NP моноклональное антитело | NIH Биозащита и новые инфекции Репозиторий | исследовательских ресурсовNR-4282 | асцит смесь клонов A1 и A3 |
| анти-RNP поликлональная сыворотка | NIH биозащита и новые инфекции Research Resources Repository | NR-3133 | направлен против A/Scotland/840/74 (H3N2) |
| Protein G Sepharose 4FF | GE Healthcare | 17-0618-01 | |
| Hyperfilm ECL 18 x 24 см | GE Healthcare | 28-9068-36 | |
| ECL вестерн-блоттинг субстрат | Pierce | No 32106 |
Ссылки
- Verhelst, J., Hulpiau, P., Saelens, X. Mx proteins: antiviral gatekeepers that restrain the uninvited. Microbiol Mol Biol Rev. 77 (4), 551-566 (2013).
- Goujon, C., et al. Human MX2 is an interferon-induced post-entry inhibitor of HIV-1 infection. Nature.....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
