Создание и характеристика ИМП и CAUTI в мышиной модели

Инфекции мочевыводящих путей (ИМП) являются одним из самых распространенных бактериальных инфекций и может быть разделен на две категории в зависимости от механизма приобретения, сообщества и нозокомиальных ИМП приобретенной. Внебольничная ИМП часто встречаются в противном случае здоровых женщин и исследований показали, что примерно 50% женщин будут иметь по крайней мере один ИМП в течение своей жизни ^1. Кроме того, рецидивы серьезной проблемой. Женщина, которая имеет начальную острую инфекцию имеет 25-40% шансов родить второй инфекции в течение шести месяцев, несмотря на соответствующее лечение антибиотиками и многие женщины по-прежнему имеют частые рецидивы ² в. Бактерии, которые вызывают эти инфекции также становится все более устойчивых к антибиотикам дальнейшие смешанные протоколы лечения ^3-6. ИМП влияет миллионы людей каждый год обходится примерно 2,5 млрд долларов в области здравоохранения, связанных расходов в США, подчеркивает влияние и распространенность заболевания1,7 .Nosocomial приобрела ИМП, в основном, связано с наличием инородных тел, таких как постоянных катетеров. Катетер-ассоциированные ИМП (CAUTI) остаются наиболее распространенным внутрибольничной приобрела ИМП, что составляет ~ 70-80% таких инфекций ^8. Кроме того, CAUTI связано с увеличением заболеваемости и смертности, и это наиболее частая причина вторичного инфекций кровотока ^9.

УПЭК связано внебольничная ИМП думал быть вызвано введением бактерий в мочевой пузырь из водохранилищ в желудочно-кишечном тракте через механических манипуляций во время полового акта, плохой гигиены или других микробных динамики населения между другом хосте ниши ^10. После того, как в пузыре, УПЭК использовать многочисленные факторы вирулентности, в том числе капсулы, систем сбора железа, токсинов, в плазмиды вирулентности, тРНК, патогенности островов и колонизации факторов, которые, как было показано, играют роль в патогенезе <SUP> 11-14. Важнейшее значение для установления УПЭК колонизации, УПЭК также кодировать различные типы клея шаперонной ассистента путь (CUP) пили, которые распознают рецепторы с стереохимического специфики ^15. Тип 1 пили, с наконечниками адгезина FimH, выражаются УПЭК и связывать mannosylated uroplakins ¹⁶ и α-1, β-3 интегрины ^17, которые выражаются на поверхности просвета обоих человеческих и мышиных пузырей ^18. Эти FimH-опосредованной взаимодействия облегчить бактериальной колонизации и инвазии поверхностных эпителиальных клеток ^19,20. После того, как в клетке, УПЭК может избежать в цитоплазму, где одна бактерия может быстро разделить, чтобы сформировать внутриклеточный бактериальный сообщества (IBC), который при созревании, может содержать ~ 10 ⁴ бактерий ^21. Формирование МДС была продемонстрирована по крайней мере шесть различных линий мышей, С3Н / курица, С3Н / HeJ, C57BL / 6, CBA, FVB / NJ и BALB / C, так и с широким спектром различных UPEШтаммы C и других энтеробактерий ^22-24. Однако временные и пространственные различия формирования IBC может изменяться в зависимости от фона мыши и заражение штаммом UPEC. В C3H / HeN мышей, инфицированных штаммами прототипа УПЭК UTI89 или образование CFT073, МКБ могут быть визуализированы в виде небольших биомасс бактерий в начале 3 HPI (после инфекции ч). Это сообщество продолжает расширяться и достигнет "среднюю" развития приблизительно 6 HPI когда стержнеобразные бактерии занимают большой процент цитоплазматической пространства неизлечимо дифференцированных поверхностные клетки зонтик Эти ранние формы КСГМГ в относительно синхронно с большинством отображаются аналогичные размеры и морфологии. ~ 8 HPI бактерии в изменении IBC от бацилл в кокки морфологию. КСГМГ преходящий характер. Таким образом, МКБ созревания 12-18 HPI результатов в дальнейшее расширение бактериальной популяции, с последующим их филаментации и разгона из клеток Wiго последующее распространение на соседние клетки ^23. Таким образом, ниша МКБ позволяет быстро бактериального роста в среде, защищенной от иммунной реакции и антибиотики ^25. Отличительные этапы UPEC инфекции, которые видны у мышей наблюдались также у людей, таких как КСМ и филаментацию, поддерживая модель мыши ИМП как полезный инструмент, который можно использовать для моделирования ИМП у людей ^22,26-28.

В то время как большинство женщин испытывают ИМП в течение своей жизни, исход этих инфекций может варьироваться от острой самоограничения инфекции не рецидива, частым рецидивирующим циститом. Кроме того, исследования показали сильную семейной возникновение ИМП, предполагая, генетический компонент способствует ИМП восприимчивости ^29. Мы обнаружили, что различные УТИ результаты видны в клиниках может быть зеркальным по различающихся результатов экспериментальной УПЭК-инфекции среди инбредных линий мышей ^30. Например, С3Н / курица, ЦБМышей DBA, и С3Н / HeOuJ подвержены, в инфекционном дозозависимо, чтобы длительной, хронический цистит характеризуется стойким, высокие бактерий титр (> 10 ⁴ колониеобразующих единиц (КОЕ) / мл), высокий титр бактерий бремя пузыря в жертву> 4 недели после заражения (WPI), хроническое воспаление, некроз и уротелиальная. Эти мыши также отображать повышенные сывороточные уровни IL-6, G-CSF, КЦ, и IL-5 в течение первых 24 HPI, которые служат в качестве биомаркеров для развития хронического цистита. Это может точно представлять естественный ход ИМП у некоторых женщин, как показали исследования плацебо показали, что большой процент женщин, испытывающих ИМП сохранит высокие уровни бактерий в моче в течение нескольких недель после появления первых симптомов цистита, если не назначено лечение антибиотиками ^{31 , 32.} Кроме того, с помощью С3Н / Курица мышей, мы обнаружили, что история хронического цистита является существенным фактором риска для последующих тяжелых рецидивирующих инфекций. Периодические ИМП наиболее сиgnificant клиническим проявлением ИМП и С3Н / Курица мыши в настоящее время только учился модель повторяет повышенный предрасположенность после предыдущего воздействия. Второй исход ИМП обобщено мышей C57BL / 6, где острой инфекции УПЭК самоограничивает, с разрешением воспаления мочевого пузыря и бактериурию в течение примерно недели. Интересно, что в этой модели, УПЭК легко образуют покоящиеся внутриклеточные резервуары в ткани мочевого пузыря, из которого УПЭК способны выходит из состоянии покоя, чтобы возобновить активное ИМП, потенциально пояснения одного механизма же штамма рецидивирующей ИМП у человека ^{33, 34.}

В дополнение к генетических факторов, влияющих на УИП восприимчивости, введение катетера в мочевой пузырь значительно увеличивает вероятность наличия инфекции, а также расширение спектра бактерий, способных вызвать инфекцию. Было показано, что катетеризация мочевого пузыря человек вызывает гистологические ииммунологические изменения в мочевом пузыре из-за механического напряжения, что приводит к прочной воспалительной реакции, пилинга, отек собственной пластинки и submucusa, мочевых путей и истончение слизистой поражением почек и уротелии ^35,36. Кроме того, катетер обеспечивает поверхность для прикрепления бактерий, тем самым создавая среду, используемую несколькими видами, чтобы вызвать CAUTI. В то время как все еще ​​УПЭК из основных причин, Enterococcus фекальный составляет 15% от этих ³⁷ CAUTI. Е. фекальный становится все более устойчивыми к антибиотикам ванкомицин сопротивления появление, создавая серьезную озабоченность здоровья ^38. Е. фекальный обладают многочисленные факторы вирулентности, включая токсины и адгезинов, необходимых для присоединения к так катетера и эпителия ^38. Во время катетеризации мочевого, хозяин уязвимыми для микробов адгезии, размножения и распространения в ^39,40 мочевыводящих путей. Е. faecaЛис образует биопленку на катетере, как часть механизма сохраняются в мочевом пузыре и распространять почек, которая приводится в мыши CAUTI модели ^41. Недавно было показано, во мочевого катетера, фибриногена (Fg) поступает в мочевой пузырь, как часть воспалительной реакции. Fg накапливается в мочевом пузыре, пальто катетера и имеет важное значение для E. фекальный образование биопленки, функционирует в качестве эшафот вложения. В модели мышей C57BL / 6 мышей CAUTI, мы обнаружили, что Е. формирование биопленки фекальный на катетер, и, таким образом, сохранение в мочевом пузыре, зависит от пилуса EBP, в частности, ее кончик адгезин EbpA. Мы обнаружили, что N-концевой домен EbpA специфически связывается с FG покрытия катетер. Кроме того, было установлено, что Е. фекальный использует Fg в качестве источника инфекции во время метаболита, таким образом, увеличивая образование биопленки ^42.

Мышиные модели доказали решающее значение для Understanding а также прогнозирования клинических проявлений ИМП и CAUTI ^41. В этой статье мы покажем, подготовку посевной в цистита УПЭК изолировать UTI89 и трансуретральная прививку С3Н / HeN мышей. Кроме того, мы продемонстрировать протокол для катетера в C57BL / 6 мышей и инокуляции Е. фекальный OG1RF штамм. Оба из этих методов приводит к последовательной и надежной ИМП или CAUTI у мышей. Мы также отображать методы, используемые для наблюдения образование IBC во время острого цистита и сбора мочи для анализа хронического рецидивирующего цистита или. С3Н / HeN мышей были использованы для изучения аспектов патогенеза УПЭК в том числе начального бактериальной инвазии, формирования IBC, филаментации и развития хронического цистита ^23,33,43. Эти параметры вирулентности также были изучены в различных других слоев мыши ^22,33. Для CAUTI, C57BL / 6 модель позволяет иностранным имплантации тела в мочевой пузырь с последующим бактериальной сотрудничестваионизация, которая может поддерживаться в течение 7 дней после заражения ^41. Эти модели были полезны для оценки механизмов бактериальной вирулентности, принимающих ответов на ИМП и механизмы, чтобы ниспровергать ответов хозяев, большая часть которых была впоследствии воспроизводятся или наблюдаемые в клинических популяциях человека.

Заявление по этике: Университет Комитет животных Исследования Вашингтон одобрил все инфекции мыши и процедуры как часть протокола числа 20120216, который был одобрен 01/11/2013, истекает 01/11/2016. В целом уход за животными согласуется с гидом по уходу и использованию лабораторных животных от Руководства Министерства сельского хозяйства США по уходу за животными ресурсами Национального исследовательского совета и. Процедуры эвтаназии в соответствии с руководящими принципами "AVMA для эвтаназии животных 2013 издание."

1. УПЭК ИМП протокол, Прививка иглы Подготовка (рис S1)

1. Снимите крышку 30 G иглы. Автор около 1 дюйм PE10 трубки на вал иглы. УФ стерилизации игл сборки ночь. Катетер иглы могут храниться бесконечно в стерильные чашки Петри.

2. УПЭК бактериального инокулята Получение

1. Подготовка UTI89 прививочный (начало 72 ч до посевногодень ния)
   1. Серия UTI89 на качестве LB (Лурия-Bertani) агаром из замороженного складе. Инкубируют в течение ночи при 37 ° С. Выберите колонию и привить его в 10 мл LB в колбе 125 мл. Инкубируют при 37 ° С в течение 24 ч, статически.
   2. Посев 10 мкл ночной культуры в 10 мл LB в новую колбу 125 мл в течение дополнительных 24 ч при 37 ° С, статически.
   3. Передача 3 мл (будет варьироваться в зависимости от штамма и нужного размера посевной) к стерильным 1,5 мл пробирки и центрифуге при 7000 мкг в течение 3 мин и ресуспендируют осадок в 1x PBS и центрифуги второй раз. Ресуспендируют бактериальных гранул в 1 мл PBS 1x.
2. Измерение оптической плотности бактериальной и отрегулировать концентрацию до нужной плотности инокулята. Стандарт концентрация инокулята, используемого в 10 ⁷ бактерий; Однако, это может варьироваться в зависимости от дизайна исследования.

3. Бактериальные Прививка

1. Очистите рабочее место с 70% этанола и Cпо площади с впитывающей бумагой (или использовать стерильную капот потока).
2. Нарисуйте до 0,9 мл приготовленного бактериального инокулята в 1 мл (ТБ) шприца (удалить воздушные пузырьки). Приложите подготовленный стерильный прививки иглу с PE10 трубки, на шприц, содержащий посевной, то стерильно обрезать трубы из полиэтилена.
   Примечание: Оставьте 1 мм трубки над кончиком иглы, чтобы избежать прокалывания пузыря.
3. Вырезать 1 дюйм квадратный кусок парафильмом и положить мазок хирургического смазки (примерно размером с монету) на вершине.
4. Обезболить женщин С3Н / Курица мышей, помещая их в стеклянную банку 32 унций, содержащий чай для заварки мяч с ватными шариками, смоченными 3 мл ИФ или испарителя камеры (после не производит протокол), пока без сознания, но еще дышал нормально (1 вдох / сек) ,
   ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые комитеты IACUC не одобряют использование банку или испаритель. Пожалуйста, следуйте указание комитета IACUC вашей организации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если стеклянный сосудс чайной мяч и / или носовой конус изофлураном-soakd ватные шарики используются, животное должно быть тщательно соблюдать, чтобы не обезболивающий передозировки и смерти. Преимущество использования испарителя и анестезии камеру, что обеспечивает контролируемое управление ИФ что позволяет избежать случайных передозировок. ВНИМАНИЕ: Изофлюран является вдыхание обезболивающий. Используйте в хорошо проветриваемом помещении и минимизировать вдыхания.
5. Отключив мышь от JAR / испаритель и поместить его на спину на бумажное полотенце и распространяется ноги.
6. Накройте нос мыши с носовой конус (трубки, подключенного к испаритель, который обеспечивает дозу, isoflurance, который оснащен на некоторых испарителя единиц) или 50 мл коническую трубку с ватным тампоном, содержащей небольшое количество (примерно 1-2 мл ) изофлурана.
7. Аккуратно трепетать мочевого пузыря, чтобы вызвать мочеиспускание и обеспечить аннулированный мочевого пузыря. Протрите периуретральной зона с 100% этанола салфеткой. Приложите прививка иглы шприца /, выберите пункт первый, вхирургическое смазки.
8. Посев каждой мыши с 50 мкл раствора бактерий путем вставки иглы инокуляции трансуретрально, около 12 мм, а нажимая на поршень шприца аккуратно, чтобы обойтись инокулята в мочевой пузырь аккуратно (10 мкл / сек). Удалить прививка иглу из мыши.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Немедленный возврат посевного в отверстие мочеиспускательного канала, когда начинают прививать указывает неправильное или неполное введение иглы.
9. Отключив мышь от носового конуса и вернуть его в клетку. Повторите шаги 3,3-3,8 для каждой мыши. Когда / если переключение инокуляции условия / штаммов, избавиться от шприца и иглы прививки в утвержденной контейнер для острых предметов и начинают снова шаг 3.2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Заражение уропатогенных организмов, как правило, не вызывает тяжелые симптомы боли. Тем не менее, в редких случаях, введение больших доз патогенов может вызвать лихорадку, снижение пищи и воды потребления и аномального поведения.Нимал здоровья должны контролироваться в течение эксперимента. Если симптомы явные болевые уведомление, анальгетик, такой как бупренорфина (0,05-0,1 мг / кг подкожно), могут быть применены. Процедуры должны быть в соответствии с IACUC каждого учреждения.

4. Определение бактериальных обременениях

1. Подготовьте отдельные 5 мл трубки для каждой пары мочевого пузыря и почек, которые будут собраны. Добавить 1 мл 1x PBS / трубки / мыши мочевого пузыря будет собрано. Добавить 0,8 мл 1x PBS / трубки / пара почек мыши, чтобы быть собраны. На каждом трубки, чтобы соответствовать заданной мыши. Подготовка 96-луночный планшет, содержащий 180 мкл 1х PBS в каждую лунку по 1:10 серийных разведений.
2. Очистите рабочую зону с 70% этанола и покрыть площадь с абсорбирующим обложки или бумажным полотенцем.
3. Обезболить мышь с изофлуран (см шаг 3,4) до тех пор, пока мышь перестает дышать в течение примерно 1 мин, а затем поместить его на впитывающей обложки или бумажным полотенцем. Другие методы euthanaSIA также приняты IACUC комитетами, таких как двуокись углерода, и может быть заменен на изофлуран передозировки.
4. Жертвоприношение мышь быстрым смещением шейных позвонков, который состоит из сдерживая шею у основания головы и тянет хвост горизонтально от тела, пока дислокации не происходит.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство IACUC комитеты требуют вторичные средства эвтаназии и шейки дислокации распространенным методом. Тем не менее, другие методы могут быть использованы в случае одобрения комитета IACUC.
5. Поместите мертвую мышь на спине и спрей 70% этанола на животе. Проанализируйте мыши, урожай мочевого пузыря и почек, в том, чтобы минимизировать потенциальное загрязнение от крови следующую вскрытия почек. Поместите органы самостоятельно в подготовленных 5 мл пробирки, содержащие 1x PBS (см шаг 4.1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте различные ножницы для вскрытия внешней и извлечение органов для минимизации загрязнения.
6. Нажмите трубку, чтобы обеспечить органы в тон 1x PBS. Повторите шаг для каждого 4,3-4,5 мыши. Чистые ножницы и щипцы в 70% этанола после каждой мыши.

5. Бактериальная Восстановление

1. Перемешать Собранную мочевого пузыря и почки в 5 мл пробирки с тканевой гомогенизатор, 15 сек в почках и 30 сек на мочевой пузырь. Промыть гомогенизатор последовательно в 1x PBS, 70% этанола и 1x PBS между образцами.
2. Сделать серийные разведения 1:10 к 10 ^-8 и пластины для каждого разведения КОЕ (колониеобразующих единиц) на чашках с агаром LB. Инкубируйте пластин при 37 ° С в течение ночи и рассчитывать колоний на следующий день.

6. Перечень МКБ

1. Соблюдая правила асептики, удалить мочевой пузырь и поместить его в 1x PBS в 6-луночного планшета с силиконового дна. Плиты могут быть получены с использованием набора силиконовой эластомерной и заливки примерно 1 см силикона в каждую лунку, см инструкции производителя. Разрежьте пополам мочевого пузыря с помощью ножниц.
2. Использование малых металлических штифтов мягко вывихнуть в BLADдер, так что просвет мочевого пузыря вверх. Будьте уверены, чтобы поместить булавки в крайних ребер секций мочевого пузыря, чтобы обеспечить максимальное количество уротелии подвергается.
3. После splaying, аккуратно мыть мочевого пузыря сразу с 1x PBS. Снимите 1x PBS с пипеткой. Fix мочевого пузыря, добавив достаточно 3% параформальдегида, чтобы покрыть всю растопыренными мочевого пузыря. ВНИМАНИЕ: Параформальдегид является канцерогенным. Правильное защитное оборудование, включая перчатки, следует носить в любое время. Утилизация должна следовать институциональных руководящих принципов.
4. Инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа. Удалить параформальдегида решение. Вымойте раз с 1x PBS.
5. Промыть LacZ промывочного раствора (2 мМ MgCl _2, 0,01% дезоксихолатом натрия и 0,02% Nonidet-p40in 1x PBS) три раза в течение 5 мин на промывку.
6. Удалить промывочного раствора и добавить достаточно LacZ пятно (9,5 мл, LacZ промывочного раствора, 0,4 мл 25 мг / мл X-Gal и 0,1 мл 100 мМ K-ферроцианидных / K-кровяной), чтобы покрыть пузыри. Выдержите на 30 ° C overniОТВ защищен от света.
7. Удалить растопыренными пузыри из инкубатора и наблюдать КСГМГ, которые появляются, как синий, как Puncta визуализируются с рассекает сферу, 40-60X увеличения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда мышь может мочиться до размещения трубки под уретры. В этом случае подождите 15-20 мин перед тем, как снова сбора мочи.

7. Моча Коллекция для бактериурии КОЕ Перечень (не применяется для CAUTI)

1. Для сбора мочи до или после инфекции мягко сдерживать мыши, удерживая хвост и размещение его на ровной поверхности (повышенной вершину мыши клетку).
2. Удержание стерильный 1,5 мл трубки под уретры мыши. Аккуратно надавите на спине мыши около хвоста, чтобы оказать давление на мочевой пузырь. Поймать мочи в 1,5 мл трубки.
3. Сделайте серийные разведения 1:10 из 10 ^-7 и пластины каждого разведения на соответствующей LB. Инкубируйте пластин при 37 ° С в течение ночи и рассчитывать колоний на следующий день.

8. CAUTI Модель Протокол, катетер игла Подготовка к CAUTI модели (рис S2)

1. Снимите крышку 30 G иглы. Вырезать 7 мм кусок трубы PE10 и 5 мм кусок силиконовой трубки, такие как RenaSIL. Нить в иглу с PE10 трубки до трубки не коснется базы иглы.
2. Затем кормить 5 мм кусок на PE10, содержащих иглы. УФ стерилизации игл сборки ночь.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При загрузке силиконовые трубки, оставить примерно 1 мм трубки, проходящей мимо кончика иглы.

9. Е. фекальный OG1RF бактериального инокулята Получение

1. Подготовка посевного материала OG1RF начиная 48 ч до дня прививки. Серия OG1RF на BHI в (мозг сердца настой) пластины из замороженного складе.
2. Выбор колонию и привить его на 10 мл BHI и расти статически в течение 18 часов при 37 ° С. Центрифуга культуры и мыть гранул (3 раза) в объеме 1 мл стерильной PBS 1x.
3. Ресуспендируют бактериальных гранул в 1x PBS. Измерение оптической плотности бактериальной и регулировать концентрацию до требуемого размера инокулята. Стандарт концентрация инокулята, используемого 10 ^7; Однако, это может варьироваться в зависимости от дизайна исследования

10. Катетер Имплантация

1. Очистите рабочее место с 70% этанола и покрыть площадь с абсорбирующим крышкой (или использовать стерильную капот потока).
2. Прикрепите катетер иглу в пустую 1 мл (ТБ) шприца. Вырезать 1 дюйм квадратный кусок парафильмом и положить мазок хирургического смазки (примерно размером с монету) на вершине.
   Примечание: Две разные иглы для осаждения катетера и для инокулята в свернутом случайного прививки из-за механических манипуляций, необходимых для имплантации катетера. Это также позволяет для удобства приготовления меньше иглы инокуляции.
3. Обезболить C57BL / 6 мышей, помещая их в стеклянную банку 32 унций, содержащий чай-infuser мяч с ватными шариками, смоченными в 3 мл ИФ или испарителя камеры (после не производит протокол) до бессознательного, но все еще дышит нормально (1 дыхания / сек).
4. Затем положить мышь на спине на бумажное полотенце и распространяется ноги. Накройте нос мыши с носового конуса или 50 мл коническую трубку с ватными шариками, содержащих небольшое количество (примерно 1-2 мл) изофлурана.
   ВНИМАНИЕ: Изофлюран является вдыхание обезболивающий. Используйте в хорошо проветриваемом помещении и минимизировать вдыхания исследователем.
5. Аккуратно трепетать мочевого пузыря, чтобы вызвать мочеиспускание и обеспечить аннулированный мочевого пузыря. Протрите периуретральной область с 100% этанола салфеткой.
6. Лечить периуретральной зона с 10% повидон-йода с использованием хлопка-аппликатора. Приложите прививка иглы шприца /, выберите пункт первый, в хирургической смазки.
   Примечание: повидин-йод используется для имплантации катетера, который является более сильным, чем асептического раствора спирта. Катетер имплантация требуетсяболее механических манипуляций, чтобы вставить катетер и, таким образом, больший потенциал для загрязнения.
7. Вставьте катетер в отверстие уретры. После того как в, С помощью пинцета, чтобы подтолкнуть (7 мм) PE10 длинную сторону мочевого пузыря, следовательно, толкая (5 мм) силикон небольшой катетер и осаждение его в мочевом пузыре. Снимите иглу, с 7 мм трубки еще привязаны, немедленно.

11. Бактериальный Прививка

1. Следуйте бактериальной протокол прививки в разделе 3, используя подготовленную прививочный из раздела 9. Снять мышь от носового конуса и вернуть его в клетку

12. В каждый момент времени жертвоприношения

1. Подготовьте 5 мл пробирки для мочевого пузыря и почек (Для органы следовать шаг 4.1) и 1.5 мл Eppendorf трубки для катетеров. Добавить 1 мл 1x PBS в 1,5 мл Eppendorf трубки для образцов катетер
2. Выполните шаги 4,3 до 4,5. Проанализируйте мыши, уборка мочевого пузыря, почек и катетер, плаCing тканей независимо в 5 мл пробирки, содержащие 1X PBS и катетер в 1,5 мл Eppendorf (этап 12.1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте различные ножницы для вскрытия внешней и извлечении органов и извлечения катетера, чтобы минимизировать загрязнение
3. Затем выполните шаг 4.6.

13. Бактериальный Восстановление

1. Для органов, выполните шаги 5.1 и 5.2. Для бактериального восстановления от катетеров, вихря на максимальной скорости в течение 30 сек, разрушать ультразвуком образцов катетер в течение 5 мин с помощью ультразвукового ванну, а затем вихрь на максимальной скорости в течение дополнительных 30 секунд.
2. Сделайте серийные разведения 1:10 из 10 ^-8 и пластины каждого разведения для перечисления КОЕ на BHI пластин. Инкубируйте пластин при 37 ° С в течение ночи и рассчитывать колониям на следующий день.

Внутрипузырное модели неосложненных и катетера, связанной ИМП обеспечивают гибкие платформы для выяснения молекулярных механизмов патогенеза бактериальной, влияние этих заболеваний на ткани хозяина, а также разработки и испытания новых подходов в управлении этих общих и дорогостоящих инфекции. В зависимости от штамма мыши и возбудителя, внутрипузырное прививка может быть использован для изучения хозяин-патоген взаимодействий выяснить факторы, необходимые для инициирования или модулирования острый (рис 1 и 3), хронические или рецидивирующие (рисунок 2) цистит. Данные, представленные на рисунке 1, представитель острой стадии (24) HPI колонизации мочевых путей по прототипом УПЭК цистита изолировать UTI89 44. После инокуляции инфекции могут развиваться в течение 24 ч после чего мышей забивали и мочевого пузыря и почечной ткани гомогенизировали. Гомогенаты тканей серийно dilutЭд и покрытие для перечисления колонизации бактерий. Хронический УПЭК колонизации и воспаления мочевого пузыря могут быть установлены и поддерживаться в некоторых линий мышей (особенно С3Н / HeN) в инфекционной дозы и уропатогенов зависимым образом. Хронический цистит определяется как стойких высоким титром бактериурию (> 10 4 КОЕ / мл), воспаление мочевого пузыря и высокий титр бактерий бремя пузыря (> 10 4 КОЕ / мочевого пузыря) в жертву 33. Данные, представленные на рисунке 2 представлены типичные КОЕ происходящие через 4 недели после инокуляции С3Н / HeN мышей с 2 х 10 7 КОЕ на UTI89. В этих экспериментальных условиях, 20-50% инфицированных мышей развивается хронический цистит, а остальные 50-80% мышей устранить инфекцию. Эта двойственность результатов зависит от хозяин-патоген контрольно-пропускном пункте, который решил в первые 24 HPI. Активация (или нет) из контрольно-пропускных пунктов приводит к наблюдаемому бимодального распределения бактериальных титров, который начинает проявляться вмочи в 3 точек на дюйм (дней после заражения) и в мочевом пузыре в жертву 28 точек на дюйм (Рисунок 2) 33. Мыши с историей хронического цистита значительно предрасположены к рецидивирующим хроническим циститом на вызов после первичного инфицирования очищается с антибактериальной терапии 33. Точно так же, история ИМП известных факторов риска для рецидивирующей ИМП у человека. Таким образом, это единственный известный модель используется для изучения патогенеза рецидивирующих ИМП. При моделировании экспериментально ИМП в альтернативных слоев мыши, важно, чтобы определить, является ли штамм мыши восприимчивы к ИМП, рецидивирующей ИМП или CAUTI, учитывая, что некоторые штаммы являются более или менее устойчивыми к разработке этих синдромов 33.

Дополнительное измерение острого цистита МКБ перечисление. Формирование МДС ограничивается неизлечимо дифференцированных поверхностные клетки зонтик. МКБ является количественная мера информативным бактериальной нагрузки во время острой кистыИТИС и высокий уровень КСГМГ коррелирует с риском развития хронического цистита 21. Формирование МДС происходит только в острых стадиях заболевания. не После отшелушивания поверхностных клеток зонтик, КСГМГ не наблюдается. В ИМП модели С3Н / курица, КСГМГ могут быть измерены через 6 часов после прививки ~ 1 х 10 7 КОЕ UTI89 в мочевой пузырь трансуретрально. Баллоны с растопыренными металлическими штырями силиконовых пластин и окрашивали для экспрессии LacZ. LacZ, β-галактозидазы, это обычно выражается бактериальный фермент, который расщепляет связь между β галактозы и других сахаров. Этот фермент может быть использован для обнаружения бактерий путем подачи X-Gal, а β-галактозид аналог, который производит синий цвет при расщеплении. После окрашивания, баллоны отображаемого при вскрытии микроскоп с КСГМГ появляться как punctae синих / фиолетовых точек на уротелии и КСМ могут быть перечислены путем подсчета точек (рис 3а). В то время как число IБЦ образованные на животное меняется в C3H / Курица фоне в среднем ~ 50 КСМ видели в мочевом пузыре (рис 3B). Увеличение КСГМГ в зависимости от дозы. Количество КСГМГ, которые формируют колеблется между УПЭК и штаммов фона мыши. Например, у мышей C57BL / 6, инокулята ~ 1 х 10 7 UTI89 приводит к образованию нескольких сотен КСМ в мочевом пузыре.

За несложный внебольничная ИМП моделируется выше, пустоши помощи в связи ИМП представляют собой значительную нагрузку на систему здравоохранения. ИМП составляют примерно 40% всех медицинских учреждений, связанных инфекций и до 95% всех медицинской помощи, связанные ИМП являются катетер связан 45. Здесь мы показываем, имплантации мочевого пузыря модель мыши CAUTI, представляющий мощную систему для экспериментального анализа этого сложного клинической проблемы. Данные, представленные на рисунке 4 являются репрезентативными 24 часов инфекции с моделью E. фекальный с обучать OG1RF. Когда 1 х 10 7 КОЕ OG1RF которые внутрипузырно прививку в неимплантированного пузыря, инфекция начинает ясно 24 HPI (рис 4а) и 3 точек на дюйм инфекция решена 41. И наоборот, инокуляция OG1RF в имплантированных результатов мочевого пузыря в колонизации как катетер в мочевой пузырь и при 10 раз выше уровней колонизации мочевого пузыря на 24 HPI, чем наблюдаемые в неимплантированного пузырей (фиг.4А и 4В). Кроме того, эта инфекция не поддерживается на> 10 6 КОЕ в мочевом пузыре до потери катетера примерно 7 дюйм 41. Все из описанных экспериментальных моделей поддаются высокой степенью гибкости экспериментальной, в том числе, но не только для различных подходов к макроскопической и микроскопической визуализации зараженных тканей и поверхностей, измененных размеров посевные и времени заболеваний, конкурентных инфекций, и принимающих иммунологические анализы ,

Рисунок 2:. 28 день колонизация мочевыводящих путей с Девушкой, с 7-8-недельного возраста С3Н / HeN мышей трансуретрально засевают ~ 2 х 10 7 КОЕ UTI89. Моча была собирать в указанные дни после заражения (точек на дюйм) и покрытием для КОЕ перечисления. Представитель 28 день мочевого пузыря и почек титры также отображаются, N = 8. мочи КОЕ нижний предел обнаружения (1000 КОЕ / мл), обозначается пунктирной линией. Пунктирные линии представиTS ткани нижний предел обнаружения, 20 КОЕ / ткани.

Рисунок 3:. МКБ перечисление с Девушкой, с 7-8-недельного возраста С3Н / HeN мышей трансуретрально засевают ~ 1 х 10 7 КОЕ UTI89. Баллоны были собраны 6 ИНН и растопыренными для окрашивания IBC. () Изображение растопыренными мочевого пузыря после окрашивания LacZ. КСГМГ представлены в виде синих точек. На вставке изображения увеличения цифрового секции изображения в черный ящик. (Б) Типичные цифры КСГМГ, образующихся в С3Н / HeN мышей 6 HPI, N = 10.

Рисунок 4: Е. фекальный катетер-ассоциированной ИМП. мыши C57BL / 6 инокулируют с или без катетеров с ~ 1 х 10 7 КОЕ (А) Э. фекальный колонизации мочевого пузыря в присутствии или в отсутствии катетера. (Б) Е. фекальный катетер колонизации. Критерий Манна-Уитни был использован для экспериментов мышей, р <0,05 считали статистически значимыми. ** Р <0,005.

Рисунок S1:. ИМП подготовка прививка иглы Схема отображает прививки подготовительные шаги иглы в том числе материалы, необходимые (1), нарезание резьбы катетера на иглы (2) и обрезки труб, прежде чем прививки (3).

Рисунок S2:. CAUTI подготовка прививка иглы Схема отображает прививка иглы подготовка материалов, необходимых (1), резьба прививки катетера (2) и имплантация катетера нана иглу (3).

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.