Методическая статья

Визуализация хондроцитов интеркаляции и направленного распространения через Zebrabow клонального анализа клеточной хряща в эмбриональном Меккеля

DOI:

10.3791/52935

⸱

21 октября 2015 г.

 ,  ,  , 
1Massachusetts General Hospital, Center for Regenerative Medicine, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сотовый организация черепно костей давно предположили, но никогда непосредственно не визуализируется. Мульти-спектральный мечения клеток и в естественных условиях живут изображений позволяет визуализировать динамическое поведение клеток в данио нижней челюсти. Здесь мы подробно протокол для управления Zebrabow трансгенных рыб и непосредственно наблюдать клетки интеркаляции и морфологические изменения хондроцитов в хряще в Меккеля.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Развитие позвоночных черепно структур требует точной координации миграции клеток, пролиферации, адгезии и дифференцировки. Паттерна хряща Меккеля, первый глотки арки производной, включает в себя миграцию черепно нервного гребня (CNC) клеток и прогрессивной разделов, пролиферацию и организацию дифференцированных хондроцитов. Несколько исследований описали миграции с ЧПУ во время нижней челюсти формообразования, но детали, как хондроциты достижения организации в росте и расширении хряща Меккеля, остается неясным. Sox10 ограничено и химически индуцированных Cre рекомбиназа-опосредованной рекомбинации создает перестановки различных флуоресцентных белков (RFP, YFP и CFP), тем самым создавая многоспектральной маркировки клеток-предшественников и их потомства, отражающие различные клоновых популяций. Использование конфокальной время киносъемки, это можно наблюдать хондроциты behaviили во время развития хряща данио Меккеля.

Мультиспектральное мечения клеток позволяет ученым, чтобы продемонстрировать расширение хондроцитов в Меккеля. Во время фазы расширения хряща Меккеля, который предвосхищает челюсть, хондроциты интеркалировать осуществить расширение, как они складывают в организованном одноклеточного слоистой подряд. Отказ этом организованного процесса интеркалирующего посредником расширение клеток обеспечивает сотовой механистическое объяснение гипоплазии нижней челюсти, что мы наблюдаем в нижней челюсти пороков развития.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Черепно развитие требует сложных молекулярных, клеточных и тканевых взаимодействий ездить клеточной пролиферации, миграции и дифференциации 1,2, 3. Это жестко регулируется и сложный процесс, подлежит генетических и экологических возмущений, таких, что черепно-лицевые уродства являются одними из самых распространенных врожденных пороков развития 1-9. В то время как хирургические вмешательства остаются основой лечения черепно-лицевых аномалий, понимания основ развития имеет важное значение для будущих инноваций терапии. Таким образом, изучение морфогенеза и механизмов в конвергенции и расширения и интеграции клеток обеспечивает новые идеи в формировании скелета черепно 1.

Черепно нервного гребня мигрируют и заполнить первую глотки арки, а также форма парные челюстные процессы, которые проходят с образованием хряща Меккеля, который предвосхищает челюсть. Морфогенез ое хряща Меккеля требует хондроцитов организации через направленного распространения, поляризации клеток и дифференцировки 1,10. Тем не менее, запутанность хондроцитов организации в росте и расширении хряща Меккеля, остается неясным. Понимание динамическое поведение клеток является критическим для понимания врожденных пороков развития, влияющие на размер нижней челюсти, например, гипоплазией нижней челюсти фенотипов 11.

Эмбрионы рыбок данио предлагают много развития и генетические преимущества для детального изучения морфогенеза хряща Меккеля. Их генетический уступчивость, прозрачность, экс естественных и быстрое развитие мощные преимущества кредитования это хорошо для наблюдения клеточного движения и организации живой изображений 6. Использование клон трассировки инструменты, такие как: Sox10 KAEDE трансгенной линии, мы и другие очерчены нервного гребня происхождение эмбриональных черепно скелета 1,5. UsiН.Г. Sox10: ERT2-Cre с UBI: Zebrabow-М трансгенной линии, теперь можно исследовать детали сотовых движений во время черепно-лицевого развития. Zebrabow-М, является трансгенной линии разработана с убиквитиновой промоутер вождения выражение различных флуорофоров, каждый в окружении LOX сайтов 8. По умолчанию флюорофор Zebrabow-М Красный, выражая RFP. После индукции экспрессии Cre, то Zebrabow-М построить рекомбинирует и клетки выразить сочетание различных флуорофоров (ППП, СФП и YFP), создающих многоспектральной выражение в зародыше. Все дочерние клетки, которые делят с меченых клеток после рекомбинации затем клонально помечены, так что сотовые населения, которые вытекают из различных сопоставленными предшественников клонально помечены. К этому клонирование клеток маркировки, пролиферации и миграции клеток с клональной разрешением может следовать (фиг.1 и 2).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Massachusetts General Hospital Институциональный уход и использование животных комитет (IACUC) одобрил все процедуры в соответствии с Протоколом номер # 2010N000106. Это в соответствии с Ассоциацией по оценке и аккредитации содержания лабораторных животных Care International (AAALAC) руководящих принципов.

1. Реагенты и материалы Подготовка

  1. Подготовка 1 л 50X Е3 эмбриона среды (таблица 1) и подготовить 1 л 1X E3 эмбриона среды (таблица 2).
  2. Подготовка E3 эмбриона среду с N-фенилтиомочевины (ПТУ) путем добавления 30 мг ПТУ 1 л 1X E3. Перемешать O / N, чтобы гарантировать, что ПТУ полного растворения. Хранить при комнатной температуре.
  3. Чтобы приготовить раствор проназы, разбавленной 150 мкл проназы (0,5 мг / мл) с 15 мл 1X E3. Этого количества достаточно для 1 чашки Петри. Используйте немедленно.
  4. Подготовьте раствор метилцеллюлозы.
    1. Подготовка Е3-Tricaine решение путем смешивания 75 мл 0,2% Tricaine 25 мл1х E3. Варить 3 г метилцеллюлозы в 75 мл Е3-Tricaine решения.
    2. Составьте окончательный объем до 100 мл с Е3-Tricaine решения. Окончательное решение метилцеллюлоза вязкой и непрозрачным с желтоватым оттенком. Хранение: РТ в защищенном от света.
  5. Тамоксифен акции и индукции решение
    1. Подготовьте 5 мм тамоксифен маточного раствора путем растворения 4-гидрокситамоксифен в 100% этанола. Магазин складе при температуре -80 ° C.
    2. Подготовка свежий раствор тамоксифена при концентрации желание в 1X E3, чтобы получить индукционный решение. ВНИМАНИЕ! Пожалуйста, обратитесь MSDS перед использованием.
  6. Подготовка 1 л 0,2% Tricaine согласно таблице 3.
  7. Получить конфокальной слайдов. Клей четыре покровного стекла (18 х 18), чтобы сформировать блок затем поместить 2 блока на 24 х 60 см 2 покровного стекла друг от друга, что позволяет монтировать эмбриона в середине.

2. Подготовка эмбрионов

  1. Трансгенные линии.
    Примечание: Zebrabow-М был щедрый подарок от лаборатории Алекса Schier в.
  2. Sox10: ERT2-Cre
    ПРИМЕЧАНИЕ: Создание вектора направленного pDestTol2- Sox10: ERT2-Cre, используя стандартные методы молекулярного клонирования и коммерчески получены рекомбинации технологии клонирования.
    1. Зерноуборочные 5 'запись клон (pENTR5'- sox10p), содержащий 7.2Kb в Sox10 промоутер, шлюз средний клон (PME-ERT2-CRE), и 3' клон входа (pENTR3'-полиА) в реакции с LR назначения линзы вектор pDestTol2- α-кристаллина: YFP.
    2. Очищают конструкцию pDestTol2- Sox10: ERT2-CRE. Со-инъекцию очищенного конструкцию (100 нг / мкл) с Tol2 транспозазы мРНК (50 нг / мкл) в эмбрионы дикого (F0) на стадии одного элемента.
    3. Экран F0 взрослых учредителями для передачи зародышевой линии на основе яркого желтого флуоресценции в эмбрионах F1.
  3. Sox10: ERT2-Cre; Zebrabow-М
    1. Скрещивание с Zebrabow-Mлиния (2.1.1) с Sox10: трансгенной линии ERT2-CRE.
    2. Выберите эмбрионы, обладающие сильной вездесущий выражение RFP и YFP объектива маркер и расти их до взрослых.

3. эмбрионов

  1. Настройте несколько пар Sox10: ERT2-Cre; Zebrabow-M трансгенной данио между 5 вечера и 6 вечера на 1 день.
  2. На следующий день, тянуть делители утром и собирать яйца около полудня.
  3. Перевести их на чашки Петри и добавить 15 мл раствора проназой dechorionate эмбрионов.
  4. Инкубируйте эмбрионов в течение 1 мин до 5 примерно 60% эмбрионов были dechorionated. Остановить реакцию декантации проназой решение и мыть эмбрионов 3-4 раза свежей E3 среды.
  5. Инкубируйте эмбрионов в dechorionated E3 на RT O / N, и пусть они развиваются, чтобы достичь стадии 10 сомитов. Выдержите 50-60 эмбрионов на сцепление, чтобы избежать различных рост развития.

    6. 4. Лечение

    1. Проверьте этап развития эмбрионов "под микроскопом светового поля, чтобы они находятся на стадии 10 сомитов.
    2. Использование флуоресцентного микроскопа с красным флуоресцентным белком (RFP) фильтра, изолировать ярко-красные эмбрионов.
    3. Переходим к индукции CRE-рекомбинации добавлением 10 мкМ гидрокситамоксифен решения Петри и инкубации изолированных зародышей на 28,5 ° С в течение 3 ч.
    4. Слейте тамоксифен решение и мыть эмбрионов несколько раз с E3.
      ВНИМАНИЕ! отказаться от тамоксифена решение в специальном контейнере биологических отходов.
    5. Инкубируйте эмбрионов на 28,5 ° CO / N.
    6. Когда эмбрионы примерно 28-29 сомитов стадии (около 24 ч после оплодотворения), инкубировать эмбрионов на 28,5 ° С в Е3 ПТУ раствора будущем.
      Примечание: ПТУ здесь использованы для ингибирования образования меланофорах в развивающихся эмбрионов. Это лечение необходимоизбежать искажения сигнала флуоресценции по авто-флуоресцентный меланофорах.
    7. Инкубируйте эмбрионов на 28,5 ° C

    5. Выбор эмбрионов

    1. Для визуализации полностью разработанные черепно-лицевых структур, выбора эмбрионов на 4 дня после оплодотворения для интенсивности красного сигнала и Cre выражения маркера положительности (желтый в сетчатке).
    2. Обезболить эмбрионов с Е3 / 0,015% Tricaine решения. Анестезия подтверждается, когда нет активных движений или плавник активности не наблюдается, когда мягко подталкивая эмбрион.

    6. Монтаж эмбриона в метилцеллюлоза

    1. Передача выбранного эмбрионов для визуализации в чашку Петри, содержащую каплю метилцеллюлозы и осторожно бальзамируют эмбрион с метилцеллюлозы.
    2. На чистой конфокальной слайда, поместите каплю свежего метилцеллюлозы и смонтировать эмбриона в капле с помощью microloader чаевые. Позиция эмбриона дорсально принимая осторожность, чтобы не коснутьсяэмбрион непосредственно.
    3. Накройте установленный эмбриона с 25 х 25 покровного и отрегулировать положение эмбриона в случае необходимости, манипулируя покровное.
    4. Эмбрион готов к изображению.

    7. Анализ с помощью флуоресцентной микроскопии

    1. Используйте 20x сухой объектив цели (числовая апертура 0,75; обскуры размер 2,0 мкм) для фокусировки эмбриона.
    2. Нажмите кнопку L100 на микроскоп и выбора каналов в программном обеспечении.
    3. Выберите кнопку конфокальной установки и нажмите "Auto" и выберите следующие каналы перед закрытием окна: CH1: CFP, CH2: GFP, CH3: RFP или mCherry
    4. Включите СН2 и СН3, прежде чем нажать кнопку "Удалить" блокировку. Нажмите 'Play', чтобы начать сканирование.
    5. Сосредоточьтесь на структуре интерес, который лучше всего сделать, начиная с ½ кадра / сек и высокого напряжения (ВН) 150, а затем изменить настройки соответственно до желаемое качество изображения не переменного токаhieved. ППП будет ярче, чем другие цвета, поэтому регулировать HV. Изменение позиции Z, чтобы найти как YFP и RFP-положительных клеток.
    6. После установки с настройками, снимок вашего эмбриона. Сохранить свою фотографию в формате программного обеспечения конфокальной изображений и TIFF формат для обработки изображений в каждой разделенной канала.
    7. Далее, для визуализации CFP, выключите СН2 и СН3 и включите Ch1. Re-настройки параметров, как в шаге 5, не изменяя зону фокусировки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: СФП может быть очень трудно обнаружить из-за фонового сигнала в канале синего, что можно обойти путем корректировки размера обскуры. Больший размер обскуры позволяет лучше обнаружения флуоресценции путем уменьшения отношение сигнал / фон. Тем не менее, крупные обскуры снизит конфокальной эффект, ущерба для качества изображения. Таким образом, тщательной корректировки настроек, необходимых для достижения желаемого качества изображения и интенсивности.
    8. Захват изображения и сохранять их в формате как (конфокальной программное обеспечение и TМФЛ) для обработки изображений. Изображения могут быть обработаны с помощью стандартного программного обеспечения для обработки изображений, чтобы объединить слои и улучшить цветовые настройки, как описано Пан и его коллеги 8.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Визуализация Традиционная хряща целыми монтаж альциановым голубым пятен была неоценима в наблюдении развивающийся хрящ Меккеля и обычно используется для визуализации окончательного клеточной организации 12 (Рис. 1А) Для дальнейшего анализа развивающиеся хондроциты сверхурочно, родословная трассировки с помощью Sox10: KAEDE трансгенных линий позволило нам изучить миграцию клеток, сближение и расширение в живых эмбрионов 2,12 (рис 1B). Тем не мене...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Альциановый синий и photoconvertible трансгенные линии, как описано выше дополняет друг с другом, чтобы определить сложный процесс хряща и развития костей. Тем не менее, в прямом эфире клеточной миграции и организация в течение органогенеза давно предположили, и косвенно продемонстрировал, но никогда не визуализируется. Zebrabow-М трансгенных линии в сочетании с хряща конкретных Cre позволяет одновременно живой соблюдение всех этих различных событий, участвующих в образовании костной и хрящевой. Этот метод позволяет изу...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят Alex Schier за любезно обмена трансгенной линии Zebrabow-M, Джеффри Бернс для вектора pDEST и Рене Этье-Daigle за отличную ухода рыбы объекта и линий.

ФИНАНСИРОВАНИЕ:

Мы благодарны за щедрую финансовую поддержку от NIDCR RO3DE024490 и Shriners больницы для детей (ECL) и пост-докторантов учебных стипендий от Shriners больницы для детей (LR и Ю. К.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
PronaseRoche Life Sciences10165921001Prepare 500 μ l складские аликвоты по 50 мг/мл
МетилцеллюлозаSigma-AldrichM0262
PTU (N-Phenylthiourea)Sigma-AldrichP7619
ТрикейнSigma-AldrichE10521
4-HydoxyTamoxifenSigma-AldrichT176
24 x 60 покровные стеклаFisher Scientific12-548-5P
18 x 18 покровные стеклаFisher Scientific12-540A
25 x 25 покровные накладкиFisher Scientific12-540C
pENTR5'-TOPO TA Cloning KitLife technologies K591-20
PENTR/D-TOPO Набор для клонирования Life TechnologiesK2400-20
pENTR3'-pATol2Kit302
pDESTПодарок от лаборатории Джеффри Бернса
Светлопольный микроскоп 
Флуоресцентный микроскоп 
Программное обеспечение
конфокального микроскопа
для обработки изображений

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dougherty, M., et al. Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis. Development. 140, 76-81 (2013).
  2. Dougherty, M., et al. Embryonic fate map of first pharyngeal arch structures in the sox10: kaede zebrafish transgenic model. The Journal of craniofacial surgery. 23, 1333-1337 (2012).
  3. Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development. Development. 133, 1069-1077 (2006).
  4. Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences. Nature reviews Genetics. 12, 167-178 (2011).
  5. Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. Visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50525(2013).
  6. McCollum, C. W., Ducharme, N. A., Bondesson, M., Gustafsson, J. A. Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth defects research. Part C, Embryo today : reviews. 93, 67-114 (2011).
  7. Mossey, P. Dental education and CPD: are you being served. British dental journal. Suppl, 3-4 (2002).
  8. Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
  9. Vieira, A. R. Journal of dental research. 87, 119-125 (2008).
  10. Le Pabic, P., Ng, C., Schilling, T. F. Fat-Dachsous Signaling Coordinates Cartilage Differentiation and Polarity during Craniofacial Development. PLoS genetics. 10, e1004726(2014).
  11. Ricks, J. E., Ryder, V. M., Bridgewater, L. C., Schaalje, B., Seegmiller, R. E. Altered mandibular development precedes the time of palate closure in mice homozygous for disproportionate micromelia: an oral clefting model supporting the Pierre-Robin sequence. Teratology. 65, 116-120 (2002).
  12. Javidan, Y., Schilling, T. F. Development of cartilage and bone. Methods in cell biology. 76, 415-436 (2004).
  13. McCarthy, N., et al. Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD. Development. 140, 3254-3265 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Zebrabow Clonal AnalysisConfocal Time LapseSOX10 ERT2 CreTamoxifen InductionCranial Neural CrestMultispectral LabelingZebrafish Embryos

Похожие статьи