Ионные каналы, выраженные в почечных канальцев эпителия играют важную роль в патологии поликистоза почек. Здесь мы опишем экспериментальные протоколы, используемые для выполнения анализа и внутриклеточный уровень кальция измерения патч-зажим в эпителии кистозной свежевыделенными от грызунов почек.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Реализация Patch зажим и жить флуоресцентной микроскопии для мониторинга функциональных свойств Свежевыделенные ДОК эпителия
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Киста инициирование и расширение во поликистоза почек представляет собой сложный процесс характеризуется нарушениями пролиферации клеток, трубчатой просвета накопление жидкости и формирования внеклеточного матрикса. Активность ионных каналов и внутриклеточной сигнализации кальция являются ключевыми физиологические параметры, которые определяют функции эпителия канальцев. Мы разработали метод, подходящий для реального времени наблюдения деятельности ионных каналов с техникой патч-зажим и регистрации внутриклеточного Са 2+ уровня в эпителиальных монослоев свежевыделенных от кист почек. PCK крысы, генетическая модель аутосомно-рецессивный поликистоз почек (ARPKD), были использованы для экс здесь естественных анализа ионных каналов и потока кальция. Описанный здесь подробно, шаг за шагом процедуры предназначены для изоляции кистозные монослоев и нерасширенном канальцев из PCK или нормальных Спрэг Dawley (SD) крыс, и контролировать деятельность одного канала и внутриклеточные Са 2+ динамику.Этот метод не требует ферментативной обработки и позволяет анализировать в родном установки свежевыделенными эпителия монослоя. Кроме того, этот метод является очень чувствительным к изменениям внутриклеточных кальциевых и генерирует изображений с высоким разрешением для точных измерений. Наконец, изолированный кистозной эпителий может быть дополнительно использован для окрашивания с антителами или красители, подготовка первичных культурах и очистки для различных биохимических анализов.
Введение
Ионные каналы играют важную роль во многих физиологических функций, в том числе рост и дифференцировку клеток. Аутосомно доминантные и рецессивные поликистоз заболевания почек (ADPKD и АРПКБП, соответственно) генетические нарушения, характеризующиеся развитием почечной заполненных жидкостью кисты трубчатого эпителиальных клеток происхождения. ADPKD вызвано мутациями PKD1 или PKD2 генов, кодирующих polycystins 1 и 2, мембранные белки, участвующие в регуляции клеточной пролиферации и дифференцировки. PKD2 сам по себе или в виде комплекса с PKD1 также функционировать в качестве Ca 2+ -permeable катионов канала 1. Мутации гена, кодирующего PKHD1 fib....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Экспериментальные методики, описанные ниже, были одобрены Комитетом по уходу и использованию Институциональная животного в Медицинском колледже штата Висконсин и Техасского университета Научного центра здоровья в Хьюстоне и были в соответствии с Национальными Институтами руководстве здравоохранения для ухода и использования лабораторных животных. На рисунке 1 показано основные этапы выделения ткани и процедуры обработки. Вкратце, почки от PCK или SD крыс используются для ручной изоляции эпителиальных монослоев собирательных трубочках либо из здоровых не набрал канальцев или кисты. Здесь мы изучали почки от 4-16 недель старые PCK крыс 10,13.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Потенциал участия ENaC в cystogenesis была продемонстрирована в нескольких исследованиях, что наблюдаемые нарушен эпидермальный фактор роста (EGF) сигнализации в ДОК прогрессии 22-25 и аномальной реабсорбции натрия в АРПКБП мышиные модели и тканевых культур 26-28. Например, Veizis др. Показали, что амилорид-чувствительных Na +, поглощение уменьшается в CD клеток из не-ортологичных БПК мышиной модели ARPKD 29. Мы недавно показали, что нарушение натрия и воды реабсорбци.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мы описали здесь приложения обычным способом патч-зажим и изображений эпифлуоресцентной кальция кистозным эпителиальных монослоев, полученных из мышиного генетической модели АРПКБП. Протокол состоит из трех этапов, из которых наибольшее внимание должно быть уделено изоляции кист (шаг 1.5 раздела протоколы) и электрофизиологических исследований. Эти ключевые процедуры требуют интенсивную подготовку и терпения, и читатель не должен быть разочарован одновременно.
Прежде всего, наибольшее вниман.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить Глена Slocum (Медицинский колледж штата Висконсин) и Колин А. Lavin (Nikon Instruments Inc) за отличную техническую помощь с микроскопии экспериментов. Это исследование было поддержано Национальными Институтами Здоровья предоставляет R01 HL108880 (как), R01 DK095029 (в ОПГ) и К99 HL116603 (для ТСП), Национальный фонд почек IG1724 (для ТСП), Американской кардиологической ассоциации 13GRNT16220002 (в ОПГ) и Бен Дж Липпс исследовательский грант от американского общества нефрологии (к DVI).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Фура-2 AM | Life Technologies | F-14185 | |
| Fluo-8 | AAT Bioquest | 21091 | |
| Поли-L-лизин | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Плуроновая кислота | Sigma-Aldrich | F-68 | решение |
| Шейкер | Boekel Scientific | 260350 | |
| Источник света | Sutter Instrument Co | Lambda XL | со встроенным приводом затвора/колеса фильтра |
| Фильтры нейтральной плотности | Nikon | ND4, ND8 | |
| Объектив | Nikon | SFluo | 40/1,3 DIC WD 0,22 |
| масляный фотоаппарат | Andor Technologies | Zyla sCMOS | |
| Nikon микроскоп (инвертированный) | Nikon | Nikon Eclipse TE2000-S | |
| Защитное стекло | Thermo Scientific | 6661B52 | |
| Алмазный карандаш | Fisher Scientific | 22268912 | |
| Программное обеспечение для получения изображений | Nikon | Nikon NIS-Elements | |
| Программное обеспечение для анализа изображений | ImageJ | http://imagej.nih.gov/ | ND Utility плагин позволяет импортировать изображения в родном формате Nikon Instruments .nd2 |
| Записывающая/перфузионная камера | Warner Instruments | RC-26 | |
| Patch Clamp усилитель | Молекулярные устройства | MultiClamp 700B | |
| Система | сбора данныхМолекулярные приборы | Digidata 1440A | Axon Digidata® |
| Система фильтра нижних частот | Warner Instruments | LPF-8 | 8-полюсный |
| капилляры из боросиликатного стекла | Бесселя World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
| Пуллер микропипеток | Sutter Instrument Co | P-97 | Пуллер микропипеток типа Flaming/Brown тип |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Японский моторизованный микроманипулятор | Sutter Instrument Co | MP-225 | |
| Инвертированный микроскоп | Nikon | Eclipse Ti | |
| Микровибрационный изоляционный стол | TMC | оснащен клеткой Фарадея | |
| Многоканальная клапанная перфузионная система | AutoMake Scientific | Valve Bank II | |
| Записывающая/перфузионная камера | Warner Instruments | RC-26 | |
| Программное обеспечение | Молекулярные приборы | pClamp 10 . 2 | |
| Регулируемый температурный хирургический стол | Сердечник | для грызунов | |
| Бинокулярный стереомикроскоп | Nikon | SMZ745 | |
| Шприц насосная перфузионная система | Harvard Аппарат | ||
| полиэтиленовая трубка | Sigma-Aldrich | PE50 | |
| Изофторновая анестезия | http://www.vetequip.com/911103 | ||
| Другие основные реактивы | Сигма-Олдрич |
Ссылки
- Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. Autosomal dominant polycystic kidney disease. Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).
- Zhang, M. Z., et al. PKHD1 protein encoded by the gene for autosomal recess....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
