Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Реализация Patch зажим и жить флуоресцентной микроскопии для мониторинга функциональных свойств Свежевыделенные ДОК эпителия

9.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53035

⸱

1 сентября 2015 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Medical College of Wisconsin, 2Department of Integrative Biology & Pharmacology, University of Texas Health Science Center at Houston

В этой статье

Краткое содержание

Ионные каналы, выраженные в почечных канальцев эпителия играют важную роль в патологии поликистоза почек. Здесь мы опишем экспериментальные протоколы, используемые для выполнения анализа и внутриклеточный уровень кальция измерения патч-зажим в эпителии кистозной свежевыделенными от грызунов почек.

Аннотация

Киста инициирование и расширение во поликистоза почек представляет собой сложный процесс характеризуется нарушениями пролиферации клеток, трубчатой ​​просвета накопление жидкости и формирования внеклеточного матрикса. Активность ионных каналов и внутриклеточной сигнализации кальция являются ключевыми физиологические параметры, которые определяют функции эпителия канальцев. Мы разработали метод, подходящий для реального времени наблюдения деятельности ионных каналов с техникой патч-зажим и регистрации внутриклеточного Са 2+ уровня в эпителиальных монослоев свежевыделенных от кист почек. PCK крысы, генетическая модель аутосомно-рецессивный поликистоз почек (ARPKD), были использованы для экс здесь естественных анализа ионных каналов и потока кальция. Описанный здесь подробно, шаг за шагом процедуры предназначены для изоляции кистозные монослоев и нерасширенном канальцев из PCK или нормальных Спрэг Dawley (SD) крыс, и контролировать деятельность одного канала и внутриклеточные Са 2+ динамику.Этот метод не требует ферментативной обработки и позволяет анализировать в родном установки свежевыделенными эпителия монослоя. Кроме того, этот метод является очень чувствительным к изменениям внутриклеточных кальциевых и генерирует изображений с высоким разрешением для точных измерений. Наконец, изолированный кистозной эпителий может быть дополнительно использован для окрашивания с антителами или красители, подготовка первичных культурах и очистки для различных биохимических анализов.

Введение

Ионные каналы играют важную роль во многих физиологических функций, в том числе рост и дифференцировку клеток. Аутосомно доминантные и рецессивные поликистоз заболевания почек (ADPKD и АРПКБП, соответственно) генетические нарушения, характеризующиеся развитием почечной заполненных жидкостью кисты трубчатого эпителиальных клеток происхождения. ADPKD вызвано мутациями PKD1 или PKD2 генов, кодирующих polycystins 1 и 2, мембранные белки, участвующие в регуляции клеточной пролиферации и дифференцировки. PKD2 сам по себе или в виде комплекса с PKD1 также функционировать в качестве Ca 2+ -permeable катионов канала 1. Мутации гена, кодирующего PKHD1 fibrocystin (рецептор, как белка ресничек ассоциированных участие в тубулогенеза и / или поддержания полярности эпителия) являются генетическая стимулом ARPKD 2. Рост кисты является сложным явлением, сопровождается распространением нарушенной 3,4, ангиогенез 5 дедифференцировки и потери полярныхность трубчатых клеток 6-8.

Неисправный реабсорбции и секреции в дополненной кистозной эпителия способствуют накоплению жидкости в просвет кисты и расширения 9,10. Нарушение потока зависит [Са 2+] сигнализации я был также связан с cystogenesis во ДОК 11-15.

Здесь мы опишем метод, подходящий для измерения патч-зажим одной активности канала и внутриклеточных Са 2+ уровня в кистозных эпителиальных монослоев, выделенных из PCK крыс. Этот метод был успешно применен нами для характеристики деятельности эпителиальных Na + канала (ENaC) 10 и [Са 2+] я -зависимые процессов, вызванных Ca 2+ -permeable TRPV4 и пуринергической сигнального каскада 13.

В этих исследованиях мы использовали ФКК крыс, модель ARPKD вызванной спонтанной мутации в гене PKHD1. Штамм был ФКК originallу получены из Sprague-Dawley (SD) крыс SD 16, таким образом, крыс, используемых в качестве соответствующего контроля для сравнения со штаммом ФКК. В результате, оба SD крыс сегменты нефрон и нерасширенном сбора каналы, выделенные из тех же крыс ФКК может служить двум разным группам сравнения для экспериментов по кистозного эпителия.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Экспериментальные методики, описанные ниже, были одобрены Комитетом по уходу и использованию Институциональная животного в Медицинском колледже штата Висконсин и Техасского университета Научного центра здоровья в Хьюстоне и были в соответствии с Национальными Институтами руководстве здравоохранения для ухода и использования лабораторных животных. На рисунке 1 показано основные этапы выделения ткани и процедуры обработки. Вкратце, почки от PCK или SD крыс используются для ручной изоляции эпителиальных монослоев собирательных трубочках либо из здоровых не набрал канальцев или кисты. Здесь мы изучали почки от 4-16 недель старые PCK крыс 10,13.

1. Выделение кист почек и подключение Трубочки (УНТ) / собирательных трубочек (CD) Сегменты

  1. Обезболить экспериментального животного с изофлуран (5% индукции, от 1,5 до 2,5%) технического обслуживания / медицинского назначения O 2 или другого утвержденного метода. Животные должны быть под постоянным контролем, чтобы обеспечить адекватную леНовичок анестезии. Стабильный дыхания скорость реакции и ног щепотку используются для подтверждения надлежащего анестезии.
  2. Выполнение лапаротомии и промыть почки фосфатным буферным раствором (PBS) через брюшную аорту 17.
    1. Подготовка катетера полиэтиленовых труб (PE50) и подключить его к шприцевой насос, заполненный PBS. Разрежьте кожу и брюшной стенки вдоль белой линии, а затем сделать поперечный разрез брюшной через живот из стороны в сторону и переложить органы брюшной полости с ватными тампонами, чтобы получить доступ к нисходящей аорты с разветвлением брыжейки и целиакией артерии. Смочите внутренние органы теплой физиологического раствора в ходе дальнейших процедур, чтобы предотвратить их сухость.
    2. Положите одну лигатуру (# 1) вокруг брыжейки и целиакией артерии и другой лигатуры (# 2) вокруг аорты под диафрагмой (не связать). Аккуратно отделить. abdominalis затуплением рассечения соединительных тканей вокруг него с тонкими щипцами и разместить два лигатуры ~ 3мм ниже левой почечной артерии (# 3) и над бифуркацией подвздошных артерий (# 4).
    3. Tie лигатуры # 4 и прикрепить зажим сосуда вокруг аорты между левой почечной артерии и лигатуры # 3. Сделайте надрез между зажимом и лигатуры # 4 катетеризировать аорты, использовать лигатуры # 3 твердо зафиксировать катетер.
    4. Отпустите зажим и убедитесь, что импульс крови видна в катетер, чтобы обеспечить правильную установку. Начните перфузии в размере 6 мл / мин, галстук лигатуры # 1 и # 2, и сократить левой почечной вены. Продолжайте промывать в течение 1-2 мин, пока органы не полностью побледнел.
    5. Вырезать почечных кровеносных сосудов, мочеиспускательного канала и окружающей соединительной и жировой тканей с ножницами, чтобы собрать почки. Затем сделать короткий разрыв в капсуле почек и очистить почки decapsulate их. Поместите почки в ледяную PBS. Эвтаназия подтверждается торакотомии.
  3. Подготовьте 5 х 5 мм покрытие стеклянных осколков, покрытые поли-L-лизин. Вырезать крышку GLAсс с алмазным карандашом и место примерно в 20 мкл 0,01% стерильного отфильтрованного поли-L-лизина раствора на каждой стеклянной чипа. Подготовьте физиологический раствор и две пары часовщика щипцов для вскрытия.
  4. Разрежьте почки с бритвой вдоль фронтальной плоскости ломтиками толщиной ~ 1-2 мм. Разместите один из срезов под стереомикроскопа. Выделение тканей должно быть сделано в ледяной физиологический раствор.
  5. Найдите кисты под стереомикроскопом как круглые формы полостей (2А); их стенки часто содержат важную сеть распространились кровеносных сосудов. Использование тонкой наконечником щипцы рассекать внутреннюю эпителиального слоя кисты как можно тоньше, чтобы получить однослойную область. Приложить ее к микросхеме стекло, покрытое поли-L-лизин. Важная поверхность поли-L-лизин позволяет исследователю твердо позиционировать внутренний слой кисты на стекле. Expose кисты с апикальной стороной вверх, чтобы обеспечить доступ для пипеток (рис 2b).
  6. Используйте PCK или SD-крыс ребенкаНей центральные ломтики, содержащие сосочек для изоляции без расширенных УНТ / CCDsegments 18-21.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Папиллярные ткани более долговечны, чем коры и, удерживая папиллярных трубчатые полосы с пинцетом и примчался радиальной оси срез могут быть расщеплены на тонкие секторов. Отдельные трубочки видны и могут быть вытащил быть размещены на крышку стеклянных осколков.
  7. Определить сегменты УНТ / CCD бифуркации, более высокую прозрачность, чем проксимальных канальцах и больших заметно видимых ячеек (рис 2С). Поместите крышку стекла чип с прикрепленными канальцев под микроскоп оснащен микроманипуляторами, пригодных для вождения микропипетки. Использование острых Микропипетки сплит-открытые канальцы и приложите их края к стеклу, чтобы сделать апикальной поверхности доступны (рис 2D).

2. одноканальный патч-зажим электрофизиологии

  1. Заполните патч-зажим камеру с раствором ванной и передать стеклянную крышку чипс изолированными тканей к камере. Убедитесь, что патч-зажим микропипетки есть сопротивление 7-10 МОм для надежных на ячейке измерений (клеток-прилагается).
  2. Для измерений клеточных прилагается, установить коэффициент усиления усилителя в 20 раз и нижних частот токов при 300 Гц с фильтром восемь-полюсный Бесселя. Для мониторинга ENaC каналы, использовать раствор ванна, мм: 150 NaCl, CaCl 2 1, 2 MgCl 2, 10 HEPES (рН 7,4); Пипетка: 140 LiCl, 2 MgCl 2 и 10 HEPES (рН 7,4).
  3. Провести эксперимент обычный патч-зажим в режиме клеточной прилагается 10. Выберите ячейку в эпителиальных монослоя и подойти к пипетки на апикальной мембране. Сформируйте высокого сопротивления, уплотнение между пипеткой и клеточной мембраны, применяя нежное всасывание. После того, как высокая устойчивость gigaOhm печать формируется протокол GAP-бесплатная холдинговой потенциала следует начинать мониторинга активности канала интересов.
  4. Магазин разрыв свободные одноканальные текущие данные из гигаОм уплотнения для последующего анализа. Проанализируйте события канала, используя пакет программного обеспечения, как правило, поставляемый с патч-зажим установок 18. Рассчитать активность канала, как НПО, где N обозначает количество активных каналов в пластыре и Р о средний открыт вероятность каналов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте отдельные кисты или канальцы в патч-зажим экспериментов не более чем на 30 мин.

3. Логометрический эпифлуоресцентной Измерения внутриклеточной концентрации кальция в клетках эпителия

  1. Использование 5 мМ Fura-2АМ растворяли в ДМСО. Алиготе раствор в отдельных 500 мкл конических труб (примерно 10 мкл). Защищать от света и хранить в морозильной камере при температуре -20 ° С на срок до шести месяцев.
  2. Выдержите изолированные кисты и сплит-открытая канальцы на 30-40 мин в PSS (в мм: 145 NaCl, 4,5 KCl, MgCl 2 2, 2 CaCl 2 и 10 HEPES при рН 7,35), содержащие 5 мкм Фура-2 AM красителя и 0,05% Pluronic кислоты, чтобы помочь рассеять ацетоксиметиловые эфиры. Для этого, место ткани в 3,5 см блюдо, содержащее загрузки коктейль, защищенном от света и инкубировать на медленном шейкере при комнатной температуре.
  3. Изменить Фура-2 AM, содержащий носитель для очистки PSS после инкубации и поместите ткань под микроскопом, чтобы дополнительно выполнять визуализацию эпифлуоресцентной.
  4. Включите ПЗС-камеры и стабильной источника света (система монохроматор), снабженный фильтром колеса (каждая позиция фильтр может быть связан со своим собственным уровнем затухания, выбранной каждый раз, когда фильтр называется).
  5. Найти ткани в светлом поле. Переключитесь на обнаружение сигнала флуоресценции и регулировать интенсивность источника света с использованием фильтры нейтральной плотности и мощности лампы, чтобы избежать насыщения сигнала.
  6. Монитор Фура-2 AM флуоресценции в образце ткани с логометрической возбуждения в 340/380 нм с частотой 0,125 Гц или выше. Используйте 40 × / NA 1.3 или аналогичный объектив для правильного resoluния изображения.
  7. Для обработки изображений и расчетов импортировать последовательность изображений. Убедитесь, чтобы разделить каналы и использовать режим HyperStack в оттенках серого. Выберите несколько регионов, представляющих интерес (один кисты клетки или выбранные области кистозной ткани) и вычислить значения интенсивности для каждого канала (340 и 380 нм) в предпочтительном программного обеспечения для анализа данных; вычитать значения интенсивности фона от каждой точки данных.
  8. Для каждого момента времени рассчитать отношение интенсивностей Фура-2 AM 340 до 380 каналов. Участок разброс / линии точка времени изменения Са 2+ переходного для каждого региона и расчета средние значения / SE.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Потенциал участия ENaC в cystogenesis была продемонстрирована в нескольких исследованиях, что наблюдаемые нарушен эпидермальный фактор роста (EGF) сигнализации в ДОК прогрессии 22-25 и аномальной реабсорбции натрия в АРПКБП мышиные модели и тканевых культур 26-28. Например, Veizis др. Показали, что амилорид-чувствительных Na +, поглощение уменьшается в CD клеток из не-ортологичных БПК мышиной модели ARPKD 29. Мы недавно показали, что нарушение натрия и воды реабсорбци...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы описали здесь приложения обычным способом патч-зажим и изображений эпифлуоресцентной кальция кистозным эпителиальных монослоев, полученных из мышиного генетической модели АРПКБП. Протокол состоит из трех этапов, из которых наибольшее внимание должно быть уделено изоляции кист (шаг 1.5 раздела протоколы) и электрофизиологических исследований. Эти ключевые процедуры требуют интенсивную подготовку и терпения, и читатель не должен быть разочарован одновременно.

Прежде всего, наибольшее вниман...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Глена Slocum (Медицинский колледж штата Висконсин) и Колин А. Lavin (Nikon Instruments Inc) за отличную техническую помощь с микроскопии экспериментов. Это исследование было поддержано Национальными Институтами Здоровья предоставляет R01 HL108880 (как), R01 DK095029 (в ОПГ) и К99 HL116603 (для ТСП), Национальный фонд почек IG1724 (для ТСП), Американской кардиологической ассоциации 13GRNT16220002 (в ОПГ) и Бен Дж Липпс исследовательский грант от американского общества нефрологии (к DVI).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Фура-2 AMLife TechnologiesF-14185
Fluo-8AAT Bioquest21091
Поли-L-лизинSigma-AldrichP4707
Плуроновая кислотаSigma-AldrichF-68 решение
ШейкерBoekel Scientific260350
Источник светаSutter Instrument CoLambda XLсо встроенным приводом затвора/колеса фильтра
Фильтры нейтральной плотностиNikonND4, ND8
ОбъективNikonSFluo 40/1,3 DIC WD 0,22   
масляный фотоаппаратAndor TechnologiesZyla sCMOS
Nikon  микроскоп (инвертированный)NikonNikon Eclipse TE2000-S
Защитное стеклоThermo Scientific6661B52
Алмазный карандашFisher Scientific22268912
Программное обеспечение для получения изображенийNikonNikon NIS-Elements 
Программное обеспечение для анализа изображенийImageJhttp://imagej.nih.gov/ND Utility плагин позволяет импортировать изображения в родном формате Nikon Instruments .nd2
Записывающая/перфузионная камераWarner InstrumentsRC-26
Patch Clamp усилительМолекулярные устройстваMultiClamp 700B
Системасбора данныхМолекулярные приборыDigidata 1440AAxon Digidata®
Система фильтра нижних частотWarner InstrumentsLPF-88-полюсный
капилляры из боросиликатного стеклаБесселя World Precision Instruments1B150F-4
Пуллер микропипетокSutter Instrument CoP-97Пуллер микропипеток типа Flaming/Brown тип
MicroforgeNarishigeMF-830
Японский моторизованный микроманипуляторSutter Instrument CoMP-225
Инвертированный микроскопNikonEclipse Ti
Микровибрационный изоляционный столTMCоснащен клеткой Фарадея
Многоканальная клапанная перфузионная системаAutoMake ScientificValve Bank II
Записывающая/перфузионная камераWarner InstrumentsRC-26
Программное обеспечениеМолекулярные приборыpClamp 10 . 2
Регулируемый температурный хирургический стол Сердечникдля грызунов
Бинокулярный стереомикроскопNikonSMZ745
Шприц насосная перфузионная системаHarvard Аппарат
полиэтиленовая трубкаSigma-AldrichPE50
Изофторновая анестезияhttp://www.vetequip.com/911103
Другие основные реактивыСигма-Олдрич
MCW

Ссылки

  1. Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. Autosomal dominant polycystic kidney disease. Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).
  2. Zhang, M. Z., et al. PKHD1 protein encoded by the gene for autosomal recessive polycystic kidney disease associates with basal bodies and primary cilia in renal epithelial cells. Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 101 (8), 2311-2316 (2004).
  3. Chang, M. Y., et al. Haploinsufficiency of Pkd2 is associated with increased tubular cell proliferation and interstitial fibrosis in two murine Pkd2 models. Nephrol. Dial. Transpl. 21 (8), 2078-2084 (2006).
  4. Park, F., Sweeney, W. E., Jia, G., Roman, R. J., Avner, E. D. 20-HETE mediates proliferation of renal epithelial cells in polycystic kidney disease. J. Am. Soc. Nephrol. 19 (10), 1929-1939 (2008).
  5. Huang, J., Woolf, A., Long, D. Angiogenesis and autosomal dominant polycystic kidney disease. Ped. Nephrol. 28 (9), 1749-1755 (2013).
  6. Wilson, P. D. Apico-basal polarity in polycystic kidney disease epithelia. Bioch Biophys Acta. 1812 (10), 1239-1248 (2011).
  7. Wilson, P. D. Epithelial cell polarity and disease. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 272 (4 Pt 2), F434-F442 (1997).
  8. Wilson, P. D., et al. Reversed polarity of Na(+) -K(+) -ATPase: mislocation to apical plasma membranes in polycystic kidney disease epithelia. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 260 (3 pt 2), F420-F430 (1991).
  9. Murcia, N. S., Sweeney, W. E., Avner, E. D. New insights into the molecular pathophysiology of polycystic kidney disease. Kidn. Intern. 55 (4), 1187-1197 (1999).
  10. Pavlov, T. S., Levchenko, V., Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Staruschenko, A. Impaired epithelial Na+ channel activity contributes to cystogenesis and development of autosomal recessive polycystic kidney disease in PCK rats. Ped. Res. 77 (1), 64-69 (2014).
  11. Siroky, B. J., et al. Loss of primary cilia results in deregulated and unabated apical calcium entry in ARPKD collecting duct cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 290 (6), F1320-F1328 (2006).
  12. Hovater, M. B., et al. Loss of apical monocilia on collecting duct principal cells impairs ATP secretion across the apical cell surface and ATP-dependent and flow-induced calcium signals. Purin. Signal. 4 (2), 155-170 (2008).
  13. Zaika, O., et al. TRPV4 Dysfunction Promotes Renal Cystogenesis in Autosomal Recessive Polycystic Kidney Disease. J. Am. Soc. Nephrol. 24 (4), 604-616 (2013).
  14. Rohatgi, R., et al. Mechanoregulation of intracellular Ca2+ in human autosomal recessive polycystic kidney disease cyst-lining renal epithelial cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294 (4), F890-F899 (2008).
  15. Xu, C., et al. Attenuated, flow-induced ATP release contributes to absence of flow-sensitive, purinergic Cai2+ signaling in human ADPKD cyst epithelial cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 296 (6), F1464-F1476 (2009).
  16. Katsuyama, M., Masuyama, T., Komura, I., Hibino, T., Takahashi, H. Characterization of a novel polycystic kidney rat model with accompanying polycystic liver. Exp. Animals. 49 (1), 51-55 (2000).
  17. Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-channel analysis of TRPC channels in the podocytes of freshly isolated glomeruli. Methods Mol. Biol. 998, 355-369 (2013).
  18. Pavlov, T. S., et al. Deficiency of renal cortical EGF increases ENaC activity and contributes to salt-sensitive hypertension. J. Am. Soc. Nephrol. 24, 1053-1062 (2013).
  19. Mironova, E., Bugay, V., Pochynyuk, O., Staruschenko, A., Stockand, J. Recording ion channels in isolated, split-opened tubules. Methods Mol. Biol. 998, 341-353 (2013).
  20. Pavlov, T. S., et al. Endothelin-1 inhibits the epithelial Na+ channel through betaPix/14-3-3/Nedd4-2. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (5), 833-843 (2010).
  21. Sun, P., et al. High Potassium Intake Enhances the Inhibitory Effect of 11,12-EET on ENaC. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (10), 1667-1677 (2010).
  22. Zheleznova, N. N., Wilson, P. D., Staruschenko, A. Epidermal growth factor-mediated proliferation and sodium transport in normal and PKD epithelial cells. Biochim. Biophys. Acta. 1812 (10), 1301-1313 (2011).
  23. Sweeney, W. E., von Vigier, R. O., Frost, P., Avner, E. D. Src inhibition ameliorates polycystic kidney disease. J. Am. Soc. Nephrol. 19 (7), 1331-1341 (2008).
  24. Sweeney, W. E., Avner, E. D. Functional activity of epidermal growth factor receptors in autosomal recessive polycystic kidney disease. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 275 (3 Pt 2), F387-F394 (1998).
  25. Orellana, S. A., Sweeney, W. E., Neff, C. D., Avner, E. D. Epidermal growth factor receptor expression is abnormal in murine polycystic kidney. Kidn. Intern. 47 (2), 490-499 (1995).
  26. Rohatgi, R., et al. Cyst fluid composition in human autosomal recessive polycystic kidney disease. Ped. Nephrol. 20 (4), 552-553 (2005).
  27. Rohatgi, R., Greenberg, A., Burrow, C. R., Wilson, P. D., Satlin, L. M. Na transport in autosomal recessive polycystic kidney disease (ARPKD) cyst lining epithelial cells. J. Am. Soc. Nephrol. 14 (4), 827-836 (2003).
  28. Olteanu, D., et al. Heightened epithelial Na+ channel-mediated Na+ absorption in a murine polycystic kidney disease model epithelium lacking apical monocilia. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 290 (4), C952-C963 (2006).
  29. Veizis, I. E., Cotton, C. U. Abnormal EGF-dependent regulation of sodium absorption in ARPKD collecting duct cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288 (3), F474-F482 (2005).
  30. Wilson, P. D. Polycystic kidney disease. NEJM. 350 (2), 151-164 (2004).
  31. Hillman, K. A., et al. P2X(7) receptors are expressed during mouse nephrogenesis and in collecting duct cysts of the cpk/cpk mouse. Exp. Nephrol. 10 (1), 34-42 (2002).
  32. Turner, C. M., Ramesh, B., Srai, S. K., Burnstock, G., Unwin, R. J. Altered ATP-sensitive P2 receptor subtype expression in the Han:SPRD cy/+ rat, a model of autosomal dominant polycystic kidney disease. Cells Tissues Organs. 178 (3), 168-179 (2004).
  33. Hillman, K. A., et al. The P2X7 ATP receptor modulates renal cyst development in vitro. Biochem. Biophys. Res. Commun. 322 (2), 434-439 (2004).
  34. Wilson, P. D., Hovater, J. S., Casey, C. C., Fortenberry, J. A., Schwiebert, E. M. ATP release mechanisms in primary cultures of epithelia derived from the cysts of polycystic kidneys. J. Am. Soc. Nephrol. 10 (2), 218-229 (1999).
  35. Schwiebert, E. M., et al. Autocrine extracellular purinergic signaling in epithelial cells derived from polycystic kidneys. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282 (4), F763-F775 (1152).
  36. Stockand, J. D., et al. Purinergic inhibition of ENaC produces aldosterone escape. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (11), 1903-1911 (2010).
  37. Pochynyuk, O., et al. Paracrine Regulation of the Epithelial Na+ Channel in the Mammalian Collecting Duct by Purinergic P2Y2 Receptor Tone. J. Biol. Chem. 283 (52), 36599-36607 (2008).
  38. Zaika, O., Mamenko, M., Boukelmoune, N., Pochynyuk, O. IGF-1 and insulin exert opposite actions on ClC-K2 activity in the cortical collecting ducts. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 308 (1), F39-F48 (2015).
  39. Lalo, U., Pankratov, Y., Kirchhoff, F., North, R. A., Verkhratsky, A. NMDA receptors mediate neuron-to-glia signaling in mouse cortical astrocytes. J. Neurosci. 26 (10), 2673-2683 (2006).
  40. Lalo, U., Andrew, J., Palygin, O., Pankratov, Y. Ca2+-dependent modulation of GABAA and NMDA receptors by extracellular ATP: implication for function of tripartite synapse. Biochem. Soc. Trans. 37 (Pt 6), 1407-1411 (2009).
  41. Li, D., et al. Inhibition of MAPK stimulates the Ca2+ -dependent big-conductance K channels in cortical collecting duct). Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 103 (51), 19569-19574 (2006).
  42. Bugaj, V., Mironova, E., Kohan, D. E., Stockand, J. D. Collecting duct-specific endothelin B receptor knockout increases ENaC activity. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 302 (1), C188-C194 (2012).
  43. Pavlov, T. S., et al. Regulation of ENaC in mice lacking renal insulin receptors in the collecting duct. FASEB J. 27 (7), 2723-2732 (2013).
  44. Gleason, C. E., et al. mTORC2 regulates renal tubule sodium uptake by promoting ENaC activity. J. Clin. Invest. 125 (1), 117-128 (2015).
  45. Frindt, G., Palmer, L. G. Acute effects of aldosterone on the epithelial Na channel in rat kidney. Am. J. Physiol. Renal Physiol. , (2015).
  46. Ilatovskaya, D. V., et al. Angiotensin II has acute effects on TRPC6 channels in podocytes of freshly isolated glomeruli. Kidn. Int. 86 (3), 506-514 (2014).
  47. Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. Pharmacological characterization of the P2 receptors profile in the podocytes of the freshly isolated rat glomeruli. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 305 (10), C1050-C1059 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Реализация Patch зажим и жить флуоресцентной микроскопии для мониторинга функциональных свойств Свежевыделенные ДОК эпителия
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.