Методическая статья

3D-человека легочной ткани Модель функциональных исследований по

DOI:

10.3791/53084

⸱

5 октября 2015 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical and Experimental Medicine, Linköping University, 2Department of Medicine, Karolinska Institute

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Инфекция туберкулеза человека — сложный процесс, который трудно смоделировать in vitro. В этой статье мы описываем новую 3D-модель легочной ткани человека, которая повторяет динамику, происходящую во время инфекции, включая миграцию иммунных клеток и раннее формирование гранулемы в физиологической среде.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Туберкулез (ТБ) по-прежнему имеет серьезную угрозу для здоровья людей во всем мире, и существует необходимость для экономичных, но надежных моделей, чтобы помочь нам понять механизмы заболевания и продвигать открытия новых вариантов лечения. В пробирке клеточных культур монослоев или со-культуры не хватает трехмерной (3D) окружающей среды и ответов ткани. Здесь мы опишем инновационный в пробирке модель человеческого легочной ткани, которая держит обещание, чтобы быть эффективным инструментом для изучения сложных событий, которые происходят во время инфекции с туберкулезом (Mycobacterium туберкулеза М.). Модель 3D ткань состоит из ткане-специфических эпителиальных клеток и фибробластов, которые культивировали в матрице коллагена в верхней части пористой мембраны. Под воздействием воздуха, эпителиальные клетки наслаиваются и выделяют слизь на апикальной стороне. Вводя первичных макрофагов человека заражены М. туберкулез в режиме тканил, мы показали, что иммунные клетки мигрируют в инфицированной ткани-и образуют ранние этапы гранулемы туберкулеза. Эти структуры воспроизводят Отличительной чертой человеческого туберкулеза, гранулемы, которая принципиально отличается или нет, обычно наблюдается в широко используемых экспериментальных животных моделях. Этот метод позволяет органотипической культура визуализации 3D и надежную количественный анализ, который обеспечивает основную информацию о пространственных и временных характеристик клеток-патоген взаимодействий принимающих. Взятые вместе, модель легочной ткани обеспечивает физиологически соответствующую тканях микро-среды для исследований по ТБ. Таким образом, модель легочной ткани имеет потенциальные последствия для обеих основных механистической и прикладных исследований. Важно отметить, что модель позволяет добавлять или манипуляции отдельных типов клеток, которые, таким образом, расширяет его использование для моделирования различных инфекционных заболеваний, которые влияют на легкие.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В людях, ответы на инфекции, воспаление тканей, клеточной найма, ремоделирования ткани и регуляции гомеостаза тканей являются сложными мероприятия с участием различных типов клеток. Следовательно, эти процессы лучше всего изучать в локальной среде ткани. Ранее это было возможно, главным образом, с использованием экспериментальных моделей на животных. Однако широко используемые экспериментальные животные провести много ограничений, поскольку они часто отвечают на патогенов по-разному, чем люди, а также отображать различные течения заболевания 1. У человека в пробирке модель легочной ткани имеет возможности изучать специфические иммунные реакции в легких человека.

Заражение человека туберкулезом (ТБ) в основном заболевание, поражающее легкие. Микобактерии туберкулеза (микобактерии туберкулеза), возбудитель туберкулеза, достигает легких через аэрозольных капель, которые транспортируются к альвеолярной пространства, где бактерии охвачен легких dendriтик клетки и альвеолярные макрофаги как часть врожденной иммунной реакции на инфекцию. 2,3 Фагоцитоз возбудителя приводит к разобщенности ошибка в пределах фагосомы и идеально приводит к нейтрализации и убийства возбудителя по фагоцита. До 50% лиц, подвергшихся М. туберкулез, как полагают, чтобы иметь возможность очистить инфекции через врожденного иммунного ответа 4. Другие результаты инфекции оформление по адаптивной иммунной системы на более позднем этапе, латентной инфекции или в худших случаях хронический активный болезнь 5.

Раньше не было никаких моделей тканей в пробирке для исследования человеческого туберкулеза. Одиночные клеточные культуры человеческих макрофагов, или других клеток периферической крови часто использовались 6,7. Недостатком этого подхода является то, что они не могут отражать динамику различных типов клеток, работающих вместе в легочной ткани воздействия M. туберкулез . Таким образом, существует потребность в модели ин витро, чтобы иметь возможность выполнять функциональные и механистических исследований на ТБ. Ячейка основе в пробирке модель человеческого легочной ткани, описанной здесь первоначально был создан в нашей группе по изучению дендритных клеточных функций 8. Мы адаптировали этот метод для исследования туберкулеза.

Модель человеческого легочной ткани, представленные здесь состоит из ткане-специфических эпителиальных клеток и фибробластов 8. Эти клетки культивируют в матрице коллагена в верхней части пористую мембрану в Transwell вставки и формы структуры, напоминающие нормальную человеческую ткань легких (рисунок 1). При соприкосновении с воздухом клетки начинают вырабатывать слизь в апикальной стороне 8. По имплантации первичных макрофагов человека заражены М. туберкулез модели, мы наблюдали, как иммунные клетки мигрируют в ткани и образуют ранние этапы гранулем туберкулеза 9. Это первый человек модель ткани DESCRibed туберкулеза и представляет многообещающую инструмент для изучения врожденных иммунных ответов на ТБ и других заболеваний легких. На сегодняшний день, мы использовали только моноциты и макрофаги, как иммунные клетки в модели, но уровень сложности может быть увеличена путем включения соответствующих дополнительных типов клеток.

figure-introduction-1
Рисунок 1. Схема очертания модели легочной ткани. (А) Модель состоит из легких конкретных эпителиальных клеток человека, М. туберкулез -infected первичных макрофагов и красный краситель, помеченные моноциты высевают на коллагеновых встроенные фибробластов, полученных на Transwell фильтра. Воздействие на модели ткани на воздухе инициирует производство внеклеточных матричных белков, секрецию слизи и стратификации эпителием. Модель 3D ткани, таким образом, разработаны является полезным инструментом для изучения М. инфекции туберкулеза в окружающую среду, что ССНСэли напоминает человеческую легких. (B) Типичные микроскопических изображений на различных этапах подготовки модели ткани. (С) Полная структура раздела модели легочной ткани. Масштаб -. 100 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: периферической крови человека от здоровых доноров крови анонимных приобретенных в банке крови Linköping University Hospital, Швеция использовали в качестве источника иммунных клеток для этого исследования. Этот протокол предназначен для 24 мм 6-луночных пластин пластины. Прямая адаптация к другим форматам также не рекомендуется, поскольку модели ткани контрактов по вертикали и горизонтали в процессе разработки.

1. Подготовка материалов, средств массовой информации и культуры бактерий / клеточных линиях

  1. Культура бактерий:
    1. Растут микобактерий M. напряжение туберкулез H37Rv несущий плазмиду pFPV2 чтобы конститутивно экспрессируют зеленый флуоресцентный белок (GFP), в Миддлбрука 7H9 среде, содержащей 0,05% Tween-80, 0,5% глицерина, канамицин (20 мкг / мл), и с добавлением Миддлбрука альбумин, декстроза и каталазы обогащения ( Миддлбрук АЦП Обогащение), при 37 ° С с 5% СО 2 в течение 7-10 дней.
      Примечание: все экспериментальные шагс участием живой яростную М. штаммы туберкулеза должны быть выполнены в BSL-3 объекте.
  2. Подготовьте Modified Игла среде (DMEM), полной среды 1x Дульбекко (с добавлением 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 10 мМ HEPES, 0,1 мМ заменимых аминокислот и 10 % инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS)). Подготовьте также антибиотик без DMEM полной среде.
  3. Приготовьте 1х минимальная поддерживающая среда (MEM) полной среды (1 мМ пирувата натрия, 2 мМ L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 10 мМ HEPES, 0,1 мМ заменимых аминокислот и 10% тепло- инактивированной фетальной бычьей сыворотки (ФБС)).
  4. Приготовление фибронектина / коллаген покрытием колбы (всего 10 мл):
    1. Пипетка 8,8 мл стерильной 1x забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), в чистую пробирку. Добавить 1 мл бычьего сывороточного альбумина (1 мг / мл), 100 мкл тип I бычьего коллагена (3 мг / мл) и 100 мкл рекомбинантного хуЧеловек фибронектин (1 мг / мл).
    2. Смешайте раствор, повернув трубку вверх-вниз 5 раз. Колбы покрывают раствором фибронектина / коллагена (1 мл на Т-25 и 2 мл для Т-75 колбу). Оставьте его O / N на 37 ° C. После инкубации удалить раствор и хранить колбы, покрытые при комнатной температуре.
      Примечание: Собранный раствор можно хранить при 4 ° С и повторно три раза. Для хранения более 2 недель может привести к жидкости буреют (образование кристаллов), где на его необходимо выбросить.
  5. Культура фибробластов:
    1. Выращивают и поддерживать MRC-5, (человеческий клеточной линии фибробластов легких, полученную из нормальной легочной ткани 14-недельных самцов плода), в полной среде DMEM в 5% СО 2 при 37 ° С. Используйте фибробласты на 24-26 проходов и не расти, пока 70-80% сливной.
      Примечание: Маркет Репорт-5 клеточная линия при прохождении> 30 теряют морфологию и не рекомендуется для использования в модели ткани.
  6. Культура эпителиальных клеток:
    1. Получить 16HBE14o- (16HBE), иммортализованной бронхиальной эпителиальных клеток человека линии, которая сохраняет дифференцированный морфологию и функцию эпителия человека нормальной дыхательных путей, (это был подарок от д-р Дитер Gruenert, горе Сион онкологический центр, Университет Калифорнии, Сан-Франциско , США 10).. Культура клеток в 16HBE фибронектина / коллагеновых покрытием колбы и поддерживать клетки в полном МЕМ в 5% СО 2 при 37 ° С.
  7. Подготовка 5x DMEM
    1. Подготовка 5x DMEM путем растворения 13,4 г DMEM порошка и 3,7 г бикарбоната натрия в 150 мл стерильной дистиллированной воды. Отрегулируйте рН среды до 7,3, составляют объем до 200 мл и фильтруют его, используя 0,22 мкм мембранный фильтр. Сбор отфильтрованной среды в стерильный контейнер и хранили до использования при комнатной температуре.

2. Подготовка Коллаген-встроенных фибробластов

  1. Оттепель замороженных аликвот FBS и L-глутамина в С на водяной бане 37 °.После оттаивания сохранить образцы на льду. Поместите бикарбоната натрия (71,2 мг / мл) и гентамицин (50 мг / мл) при 4 ° С. Предварительного охлаждения 50 мл центрифужные пробирки и 10 мл стерильные пипеток до 4 ° С.
    Примечание: Все материалы, используемые (кроме 5-кратным DMEM) охлаждены на льду до использования, и все шаги выполняются на льду. Тип I бычьего коллагена (1,1 мг / мл) должны храниться холодной, так как это предотвращает затвердевание коллагена.
  2. Подготовка фибробластов:
    1. Теплый Трипсин в ° C водяной бане при 37 и инкубировать с достаточное количество легочных фибробластов (MRC-5) клеток в течение 10 мин при 5% СО 2 при 37 ° С. Нейтрализовать трипсина путем добавления DMEM, 1x завершена. Аспирируйте клеточной суспензии и центрифуге при 300 х г в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант и ресуспендирования клеток в 2,3 х 10 5 клеток / мл в DMEM полных. Поместите клетки на льду до готовности к использованию.
  3. Подготовка премикса:
    1. Добавьте следующее в трубе с надписью "премикс"; 395мкл 5x DMEM, 40 мкл L-Глютамин, 120 мкл NaHCO3 (71,2 мг / мл), 440 мкл ФБС, 5 мкл гентамицин (50 мг / мл), общий объем 1000 мкл, а затем встряхните перед хорошо перемешать и поставить на льда.
      Примечание: Объемы приведены для вставки культуры один 24 мм 6-а. Рассчитать конкретные суммы, требуемые для общего количества вставок, но добавить один дополнительный, чтобы быть уверенным, достаточно премикс готов.
  4. Подготовка бесклеточной коллагена смесь:
    1. Для каждой культуры добавляют 1 мл бесклеточной коллагена смеси. Добавьте следующее в 50 мл коническую трубку на льду в указанном порядке; 686 мкл 1,1 мг / мл коллагена, 250 мкл премикс и 64 мкл 1х полное DMEM до общего объема 1000 мкл в. Смешайте раствор хорошо не обеспечивая пузырьков воздуха. Работа быстро и добавить коллагена на стенке трубки, чтобы избежать воздушных пузырей.
    2. Добавить 1 мл бесклеточной слой смеси вставки размещены в плите 6 скважины. Не добавляйте носитель к колодцу за пределами вставки. Вcubate в течение 30 мин в 37 ° С инкубатор. Убедитесь, что бесклеточная смесь покрывает всю вставку без каких-либо воздушных пузырьков.
  5. Подготовьте клеточный коллаген смесь:
    1. Смешайте компоненты клеточной слоя в 50 мл коническую пробирку держали на льду в следующем порядке; 2 мл Коллаген, 615 мкл предварительного смешивания, 58 мкл 1x полной DMEM и 327 мкл суспензии клеток легких фибробластов (MRC-5), чтобы составить общий объем до 3000 мкл. Каждая культура требует 3 мл клеточной коллагена смеси.
      Важным шагом: Убедитесь, что смешивать коллагена и премикс тщательно перед добавлением клеточной суспензии. Это нейтрализует рН коллагена, чтобы избежать токсического воздействия на фибробластов.
    2. Добавить сотовой слой (3 мл) в верхней части слоя бесклеточной коллагена и инкубируют в течение 2 ч в 37 ° C инкубаторе. Работа быстро и добавить коллагена на стенке трубки, чтобы избежать воздушных пузырей.
    3. После полимеризации, добавить 2 мл DMEM полные ТОн дно 6-луночный планшет (при вставке) и инкубируют в течение 24 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если полимеризации не происходит, отбросить пластинчатые вкладыши, содержащие фибробластов коллагеновой матрицы и пуско-снова. Наиболее вероятной причиной ошибки в дополнение или неправильной объема одного из перечисленных выше реагентов.

3. Непрерывная культура фибробластов коллагена Matrix

  1. Осторожно поднимите вставку с помощью чистой щипцов и аспирации питательных сред из нижней части скважины. Добавить 2 мл DMEM полной до дна скважины с последующим 2 мл DMEM полной во вставке. Избегать введения пузырьков воздуха под вставкой, так как это позволит предотвратить диффузию питательных веществ между внешней и внутренней камерами. Удалить пузырьки воздуха с наконечником микропипетки.
  2. Изменение питательных сред (внутри и ниже вставки) каждый второй день, а культуру в течение примерно 5-7 дней. Будьте осторожны при удалении носителя из вставки. Чтобы избежать КонтаКТ с фибробластов коллагена матрицы, слегка наклоните вставку с помощью чистой щипцов и аспирации СМИ от вставки стен.
    ВАЖНЫЙ ШАГ: фибробласты в коллагеновой матрице должны получить удлиненную фенотип, и переделывать коллаген, который затем контракты. В 5-7 дней, матрица заключил контракт, чтобы сформировать платформу (10-14 мм в диаметре) в центре пластины. Контрактный матрица готова к использованию в следующей стадии. Чтобы получить равномерное сжатие матрицы очень важно, что фибробласты хорошо смешивают с коллагеном перед посевом (этап 2.6.1).

4. Посев иммунных клеток (Infected / Неинфицированные моноцитов-макрофагов смесь)

Примечание: Следующие шаги включают экспериментальные вирулентных микобактерий, и поэтому должны быть выполнены в BSL-3 объекта.

  1. Приготовление первичных моноцитов и макрофагов:
    1. Изолировать моноцитов периферической крови от доноров крови с помощью establiпролить протокол. Изолировать моноциты в тот же день, как создание модели тканей и культуры и дифференцировать их в макрофаги в течение примерно 7 дней до заражения М. туберкулез.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет гарантировать, как макрофаги и контракт фибробластов коллагена матрица доступны через 7 дней. Также изолировать свежие моноциты, которые будут добавлены вместе с зараженными макрофагов.
  2. Подготовка М. туберкулез -infected макрофаги
    1. Заготавливают культивированные бактерии, помыть с 1x PBS, содержащий 0,05% Твин-80, ресуспендируют в антибиотиков без полного DMEM, проходят через усеченного стерильной иглой 27 G для разгона бактериальных сгустки и измерения оптической плотности.
      Примечание: Предварительно определить М. туберкулез колониеобразующих единицы эквиваленты оптической плотности в лаборатории. Это даст оценку числа бактерий, которые будут использоваться для инфекции.
    2. Выдержите макрофаги в течение 4 часов с М. туберкулез в множественности заражения (МВД) 10). После заражения, промойте 3 раза с 1x PBS, чтобы удалить внеклеточных бактерий. Использование неинфицированных макрофагов культивировали таким же образом, но без М. туберкулез, в качестве контроля.
    3. Отделить макрофаги из культуральной пластины с помощью обработки 2 мМ ЭДТА в течение 10 мин при 37 ° С и ресуспендировали клетки в без антибиотика полной среде DMEM.
  3. Маркировка моноцитов
    Примечание: Выделение и маркировка моноцитов может быть выполнена в BSL-2 скамьи, а затем принимать во BSL-3 установки для дальнейшей обработки.
    1. Пятно свежеприготовленные моноциты (2 х 10 7 клеток) с конечной концентрации 2 мкМ PKH26 красного красителя в течение 5 мин, в соответствии с инструкциями изготовителя. Промыть 3 раза и клетки вновь суспендируют с без антибиотика полной среде DMEM при плотности 1 х 10 7 клеток / мл.
  4. Добавление иммунных клеток, чтобы фибробластов-коллагеновый матрикс
    1. осле 5-7 дней культуры фибробластов-коллагеновый матрикс, аспирата из среды культуры внешних и внутренних камер и добавить 1,5 мл свежей без антибиотика DMEM полной к наружной камере.
    2. Подготовьте меченого моноцитарно-макрофагальной (неинфицированных / зараженной) смеси с соотношением Mo: MQ (5: 1) в 50 мкл DMEM завершена. Для 50000 макрофагов, принять 250000 меченых моноцитов.
    3. Добавить 50 мкл МО: MQ смеси до фибробластов-коллагенового матрикса и инкубируют в течение 1 ч в 5% СО 2 при 37 ° С. После инкубации, осторожно добавляют 2 мл культуральной среды во вставку и инкубировать в течение дополнительных 24 ч в 5% СО 2 при 37 ° С.
      Примечание: В клетки добавлены свободно прикреплена, добавление сред должно быть медленным, осторожно добавив на стенках вставки.

5. Посев легких эпителиальных клеток (16HBE)

Примечание: Следующие шаги должны быть выполнены в BSL-3 объекта.

  1. Семя легких электроннойpithelial клетки (16HBE) в верхней части МО: MQ-фибробластов коллагена слоя. Для этого, во-первых отделить 16HBE клетки от колбы путем обработки трипсином (как в 2.2.1.) И ресуспендируют в 4 х 10 6 клеток / мл в антибиотиков без DMEM.
  2. Аспирируйте культуральной среды внутри и за пределами вставки. Затем добавить 1,5 мл без антибиотика DMEM полной в забое скважины за пределами вставки.
  3. Добавить 50 мкл 16HBE сверху иммунных клеток фибробластов матрицы коллагена. Оставьте на 2 мин в капюшоне и инкубировать в течение 1 часа в 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2. После инкубации добавляют мягко 2 мл без антибиотика DMEM полной пределах вкладыша и культуры при 37 ° С в течение 3 дней. Стадию культура способствует пролиферации эпителиальных клеток в модели ткани.
    Примечание: В клетки добавлены свободно прикреплена, добавление сред должно быть медленным и нежным, сдвинув через стенки вкладыша.

6. Воздух-экспозиция 3D легкихМодель

Примечание: После 5-й день после того инфицированных макрофагов, модели ткани воздуха подвергаются и следующие шаги должны быть выполнены в BSL-3 объекта.

  1. Аспирируйте культуральной среды внутри и за пределами вставки.
    Примечание: На этом этапе супернатанты могут быть собраны для обнаружения секретируемых факторов. Центрифуга, стерильно фильтровать и хранить супернатанты при -70 ° С.
  2. Добавить 1,8 мл антибиотика свободной DMEM полные в наружной камере и инкубируют в 5% СО 2 при 37 ° C инкубаторе в течение 2 дней. Не добавлять культуральной среды в вставки.
    Примечание: с воздушным снятие модели ткани способствует образованию слоистой эпителия и секреции слизи, который обеспечивает прочность к ткани и физиологического сходства с человеческой легочной ткани.

7. Сбор и Монтаж 3D легочной ткани Модель


Примечание: Следующие шаги должны быть выполнены в BSL-3 объекта.

  1. На 7 день после имплантации инфицированных макрофагов, модели ткани готовы для сбора урожая. Удалить культуру средств массовой информации полностью от модели ткани. Исправление модели ткани 4% параформальдегидом в течение 30 мин в темноте при комнатной температуре. Этот шаг убивает бактерии и фиксирует ткани / морфологии клеток для дальнейшей обработки.
  2. Используя скальпель, отделить мембрану от вставки скважины. Передача мембрану, содержащую ткани на лунку, содержащую 1x PBS.
  3. Отрежьте стороны модели ткани с помощью чистой скальпель. Затем нарезать модель ткани в 4 примерно равные квадратные кусочки. Перевести кусок ткани на более SuperFrost стекло. Хранить куски ткани в 1x PBS при 4 ° С.
  4. Высушите ткани в течение 5 мин и смонтировать с помощью продлить Gold antifade с DAPI и покровное. Оставить слайды без нарушения не в темноте при комнатной температуре до полного высыхания.
    Примечание: Толщина ткани могут различаться между центром и периферией, вызывая небольшое Tiltiнг покровное. Чтобы избежать этого, распорка (например парафином) могут быть размещены на углу покровным стеклом.
  5. Применить лак для ногтей по краям покровного стекла и дайте ему высохнуть. Погружают слайдов в 70% этанола, чтобы сделать их безопасными, чтобы принести из BSL-3 объекте.

8. Визуализация, приобретение и количественный анализ 3D

  1. Визуализируйте ткани слайды, используя микроскоп конфокальной системы с лазеры на 488 нм для возбуждения GFP (зеленый канал), 420 нм для DAPI (синий) и 555 нм для PKH26 меченных моноцитов (красный), соответственно.
  2. Приобретение 3D изображения с разрешением 512х512 с Z-стеки покрытия, как минимум, 20 мкм толщиной и имеющие 1 - 1,5 мкм расстояние между стеками. Приобретать 5-10 различные поля, охватывающие весь кусок ткани.
    Примечание: Используйте конфигурацию, например, Никвист оптимальных настроек оптическим разрешением (длина волны, мощности лазера / воздействия, размер пикселя и масштабирования). Избегайте ООНдер или перенасыщение пикселей.
  3. Анализ конфокальной изображения с помощью программного обеспечения 3D обработки изображений. Для 3D количественного клеточных кластеров, то рекомендуются следующие шаги для оптимального анализа.
  4. Откройте программное обеспечение для обработки изображений 3D и загрузить изображение. Измерьте размеры объектов, которые будут проанализированы в изображении, например, размер ядра, индивидуальный моноцитов и одиночных бактерий. Эти наблюдения могут быть использованы для определения или фильтрации объектов.
  5. Используя инструмент настройки дисплея, оптимизировать объем рендеринга путем корректировки каждого канала для контраста изображения, яркость и смешать непрозрачность. Этот шаг является сведение к минимуму помехи шума в объеме рендеринга.
    Примечание: гамма-коррекция может привести к манипулированию изображений и, следовательно, его следует избегать.
  6. Создать поверхностей от выбора красного канала (моноциты) и установить порог (автоматический или ручной выбор). При необходимости, используйте фильтры, чтобы ограничить выбор красных моноцитов или исключить бackground. Точно так же, создания поверхностей для зеленого (М. туберкулеза) и голубой (ядер) каналов, как описано выше.
  7. Экспорт данных в файлы MS-Excel. Можно экспортировать конкретный параметр или все данные. Параметры, которые имеют отношение к анализу клеток кластеризации объем, интенсивность, количество объектов, количество вокселей и сферичности.
  8. Сохранение и экспорт изображений в подходящем формате изображения предпочтительно TIFF.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анимации также можно сделать с помощью меню анимации и сохранить как медиа-файла.
  9. Сохранить настройки анализа каждого канала, используя опцию добавления параметров и могут быть получены позднее с помощью функции Восстановление. Одновременно анализировать несколько файлов, используя инструмент пакетной обработки.
    Примечание: Все изображения для параллельного должны быть приобретены, обработаны и проанализированы таким же образом. Например A 8-битное изображение (256 целое число) не должно быть по сравнению с 12-битное изображение (4096) целого.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3D-модель легочной ткани человеческого туберкулеза могут быть эффективно использованы для изучения хозяин-патоген взаимодействия в М. туберкулезная инфекция. Основные этапы этого способа, представительные микроскопические изображения различных этапов и общей микроскопической структуры раздела тканей описаны на рисунке 1. Модель имеет несколько компонентов человеческой легочной ткани, в том числе легочных фибробластов, бронхиальных эпителиальных клеток и первичных моноцитов / макрофагов встроен в среде 3D ткани. Кроме того, включение компонентов человеческого легочной ткани, модель напоминает физиологических условиях, а именно расслоение эпителия и секрецию слизи.

Примером использования модели легких тканей в области мониторинга инфекции ТБ представлена ​​на рисунке 2. Для визуализации М. туберкулез -immune миграцию клеток и взаимодействия, мы ввели макрофаги, инфицированные M. туберкулез, которые выражают GFP(зеленый) вместе с свежеизолированных PKH26 меченных моноцитов (красный) в модели ткани (синий, DAPI окрашенных ядер). На 7 день после того М. туберкулез -infected клетки к модели ткани, конфокальной микроскопии показывает кластеризации красных моноцитов на сайте инфекции (зеленый) (рис 2), которая имитирует отличительной чертой поражения человека ТБ 9.

Серия представительных изображений для 3D визуализации М. туберкулез -infected модель ткани и количественная оценка клеточных кластеров показано на рисунке 3. 3D-визуализация дает пользователю гибкость, чтобы взаимодействовать, исследовать и количественно несколько особенностей в 3D изображении. Пространственное расположение зеленых бактерий и красных кластеров моноцитов видно из апикальной, вращательного и боковым видом, как показано на фигуре 3В, который показывает кластеризации моноцитов на участке М. туберкулез. Кластеры не-об-служил в неинфицированных тканей (рис 3а). Мы количественно размер и количество моноцитов кластеров клеток и обнаружили, что размер (объем) кластеров клеток усиливается (р <0,001), в то время как число индивидуальных моноцитов уменьшилось (р <0,01) в М. туберкулез инфицированных тканей по сравнению с моделями неинфицированных тканей (фиг.3С и 3D). Эти данные подтверждает нашу предыдущую нахождение начале формирования гранулемы в М. туберкулезная инфекция наблюдается в моделях легочной ткани, анализируемых в 2D срезов 9.

Наши данные показывают, что модель ткани обеспечивает естественную среду обитания 3D исследовать комплекс хозяина клеточную М. Сеть туберкулез связи. Мы также обнаружили, что 3D визуализация и количественный анализ являются лучшими инструментами для изучения особенностей в модели ткани (рисунок 3). Количественное определение кластера чеек (гранулемы, например) часто стретч HES до нескольких слоев клеток и может быть полностью захвачен 3D количественного анализа. Кроме того, визуализация точных пространственных и временных характеристик отдельных клеток или бактерий в модели позволяют жить-изображений, миграция и отслеживания исследования в назначенной лаборатории.

figure-results-1
Рисунок 2. моноцитов в модели ткани кластера вокруг опасной М. туберкулез. Представительства конфокальные изображения неинфицированных и М. туберкулез модель инфицированных тканей представлена. Панели из зеленого (М. с туберкулезом GFP), красные (PKH26 меченных моноцитов), синий (DAPI-окрашенные ядра) и объединенные каналы показывают набор моноцитов в инфицированной ткани по сравнению с неинфицированных тканей. Масштаб - 100 мкм.large.jpg "стиль =" Размер шрифта: 14px; высота строки: 28px; "цель =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 3. 3D визуализации и количественного анализа модели ткани содержат полезную информацию. Типичные изображения 3D визуализации всей модели ткани (А) незараженные ткани, (Б) инфицированных M. туберкулез, через оптический срезов с использованием Zeiss LSM700 конфокальной микроскопии и количественного анализа Imaris программного обеспечения для обработки изображений (версия 7.6.8). Эти изображения были получены при увеличении 20Х, 14 Z-стеки, охватывающих толщину тканей 19,5 мкм с 1,5 мкм интервала, позволяя визуализацию с апикальной, вращательного горизонтальной, вертикальной и вращательного сбоку (А и В). (С) условиемntitative анализ кластеров моноцитов клеток выявляют расширение (р <0,0001) размер кластеров начале гранулемы после М. туберкулезная инфекция по сравнению с отсутствием инфекции. (D) Количественное определение числа моноцитов показали снижение (р <0,01) в пораженной ткани по сравнению с неинфицированных тканей, вновь более кластеров в инфицированной ткани. Зеленый - М. туберкулез -GFP, красный - PKH26 меченные моноциты, синий - клеточные ядра, шкала -. 100 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Способность набирать и образовывать организованные клеточные кластеры в месте инфекции является отличительной чертой ТБ 11 человека. Эти динамические структуры, известные как туберкулезные гранулемы, в основном состоят из иммунных клеток (макрофагов, моноцитов, Т-клеток и В-клеток) и многоядерных гигантских клеток, окружающих M. tuberculosis. Долгое время считалось, что роль гранулемы заключается в том, чтобы отгородиться от инфекции, предотвращая местное распространение бактерий. Тем не менее, более поздние исследования показывают, что образование гранулемы имеет решающее значение для ранней выживаемости, роста и распространения бактерий 12. Стратегия новых исследований заключается в выявлении молекул или путей, которые могут быть эффективно нацелены на ингибирование клеточной миграции при образовании гранулемы и/или распространении туберкулеза.

Одним из предостережений в отношении новых исследований туберкулеза является отсутствие моделей, которые бы резюмировали человеческий туберкулез. Наиболее широко используемые экспериментальные животные не образуют истинную гранулему при инфекции M. tuberculosis и, следовательно, не являются подходящим выбором для изучения TB 13-16. Нечеловекообразные приматы имеют наиболее близкое сходство с человеческим TB 17, но не являются предпочтительным выбором из-за высоких эксплуатационных расходов и этических проблем. Туберкулез человека является сложным иммунологическим процессом и с трудом поддается моделированию in vitro. Клеточные культуры монослоев или кокультур лишены 3D-среды и реакции тканей. Поэтому мы разработали инновационную модель легочной ткани на основе первичных иммунных клеток человека и специфичных для легких человека клеточных линий 8,9. Модель отображает характерные особенности легочной ткани человека, в том числе эпителий с равномерно интегрированными макрофагами, формирование внеклеточного матрикса, стратифицированный эпителий и секрецию слизи 9.

3D-модель легочной ткани человека имеет ряд преимуществ по сравнению с одиночными или совместными культурами in vitro , засеянными на планшетах для тканевых культур или трансвелл-вкладышах. Во-первых, легочно-специфические клетки человека (фибробласты и эпителиальные клетки) обычно не включаются в одиночные или кокультуры in vitro . Во-вторых, иммунные клетки и легочно-специфические клетки встроены в трехмерный физиологический контекст (богатые коллагеном продукты внеклеточного матрикса). Реакция клеток на стимул/инфекцию и миграционное поведение клеток, например, образование гранулемы, значительно различаются между 2D и 3D средой. Кроме того, описанный метод позволяет осуществлять 3D-визуализацию и надежный 3D-количественный анализ, который предоставляет ключевую информацию о пространственном распределении и сложных клеточных взаимодействиях.

Экспериментальная инфекция в модельной ткани M. tuberculosis привела к кластеризации макрофагов в месте инфекции, напоминающей раннюю TB-гранулему (рис. 2 и 3). Недавно мы продемонстрировали, что мутантные штаммы с дефектной способностью секретировать фактор вирулентности ESAT-6 или Mycobacterium bovis BCG, у которых отсутствует ESAT-6, не индуцировали кластеризацию моноцитов (без ранней гранулемы), в отличие от вирулентного M. tuberculosis 9. Эти данные согласуются с наблюдениями, проведенными на эмбрионах рыбок данио, инфицированных Mycobacterium marinum, прозрачность которых позволяет получить элегантную визуализацию образования гранулемы в реальном времени. Поскольку не существует модели золотого стандарта для туберкулеза, мы воспользовались хирургически резецированными биопсиями тканей пациентов с туберкулезом для валидации метода 9. Наша модель ткани in vitro имеет несколько общих характеристик с биопсией легких и лимфатических узлов у пациентов с туберкулезом, включая агрегацию макрофагов в гранулеме, присутствие как внутриклеточных, так и внеклеточных бактерий 18 и индукцию некроза 11.

Несмотря на то, что описанная модель имеет физиологическое значение для ТБ человека и имеет ряд преимуществ перед другими моделями in vitro , она имеет некоторые ограничения. Например, из более чем 20 коллагеновых белков, идентифицированных у человека, только тип I включен в модель, чтобы имитировать внеклеточный матрикс. Тем не менее, коллаген I типа представляет собой сложную смесь продуктов внеклеточного матрикса и является самым распространенным коллагеном в организме человека. Кроме того, мы продемонстрировали присутствие коллагена IV и нескольких белков внеклеточного матрикса, таких как тропоэластин, виментин и ламинин, которые продуцируются эпителиальными клетками и фибробластами в модели ткани, что указывает на синтез нового коллагена 8. В настоящее время модель легочной ткани содержит только моноциты и макрофаги, помимо легочно-специфических клеток. В нем отсутствуют нейтрофилы и лимфоциты, которые, как известно, также присутствуют в гранулеме. Примечательно, что эта модель не ограничивается введением дополнительных иммунных клеток и представляет интерес для изучения того, как они способствуют сложным клеточным взаимодействиям при туберкулезе человека. Имплантация первичных альвеолярных макрофагов, кожно-специфических клеток и клеток карциномы легких уже была опробована на модели. Поскольку нашей целью было использовать модель, очень похожую на человеческий туберкулез, попытки введения мышиных клеток не предпринимались.

Таким образом, модель легочной ткани имеет значение как для фундаментальных механистических, так и для прикладных исследований. Потенциальные приложения модели легких включают изучение врожденного иммунитета, изучение механистических аспектов защитных механизмов организма хозяина, таких как фагосомное созревание, аутофагия, производство цитокинов, хемокинов и антимикробных пептидов, а также функциональная характеристика отдельных типов клеток. Поразительно, что тканевая модель in vitro позволяет манипулировать одним или несколькими типами клеток и обеспечивает соответствующую тканевую микросреду не только для исследований туберкулеза, но и для различных инфекционных и неинфекционных заболеваний, поражающих легкие.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы выражают признательность основному центру микроскопии на факультете медицинских наук Университета Линчёпинга за предоставление доступа к передовым системам визуализации; Карл-Эрик Магнуссон (почетный ученый) на факультете клинической и экспериментальной медицины Университета Линчёпинга за предоставление доступа к программному обеспечению для обработки 3D/4D изображений Imaris (Bitplane, Швейцария); и С. Брайан за помощь в создании мультфильма о модели легких. Эта работа была поддержана за счет средств Шведского исследовательского совета (Альтернативы исследованиям на животных, 2012-1951) и Шведского исследовательского совета (2012-3349) M.L. и Шведского фонда стратегических исследований для получения грантов от Каролинского института, Шведского исследовательского совета, Шведского агентства международного сотрудничества в целях развития (Sida) и Шведского агентства по гражданским непредвиденным обстоятельствам (MSB), а также Шведского фонда сердца и легких (HLF). М.С. получала гранты от Каролинского института и Стокгольмского окружного совета.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Клеточная культура вставляетBD Falcon353092
6-луночные культуральные планшетыBD Falcon353046
клетки MRC-5, фибробластыATCC#CCL-171
16HBE, эпителиальные клеткиПодарок от доктора Дитера Грюнерта, Онкологический центр Маунт-Сион, Калифорнийский университет, Сан-Франциско, США 
5 x Дульбекко s модифицированный Eagle' Средний (5 x DMEM)Gibco12800-082Изготовлен из порошка, но добавляет в 5 раз меньше воды. Отрегулируйте pH до 7,3 и отфильтруйте его с помощью 0,2 & микро; м.
Дульбекко s модифицированный Eagle' s среда с глюкозой (DMEM) 1xGibco41965-039
Минимальная незаменимая среда (MEM) 1x с Earle' s солиSigmaM4655
Раствор заменимых аминокислот, 100xLife Technologies11140-035
L-глютамин 200 мМ (100x)Gibco25030-024
Пируват натрияLife Technologies11360-039
NaHCO3 (71,2 мг/мл)Приготовлено в домашних
условиях Термоинактивированная фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS)Gibco10270-106Тепло инактивировано на 30 мин, 56 °° C
Гентамицин (50 мг/мл)Gibco15750-060
Хепес буферный раствор 1MGibco15630-056
Пенициллин стрептомицин (Pen Strep)Gibco15140-122
LymphoprepAxis-Shield7801
Ultrapure 0,5 м ЭДТАGibco15575
Бычий коллаген PA обработанный (500 мл)Organogenesis200-055
Чистый очищенный раствор бычьего коллагена (100 мл)Усовершенствованная биоматрица5005-B
Белок внеклеточного матрикса, фибронектин (1 мг)BD354008
Первичные моноциты/макрофагиВыделены из цельной крови человека или охристой оболочки.
PKH26 Красный флуоресцентный клеточный линкерSigmaMINI26
Mycobacterium tuberculosis H37Rv, экспрессирующий зеленый флуоресцентный белокM. tuberculosis H37Rv дикого типа, трансформировали с помощью плазмиды pFPV2, конститутивно экспрессирующей GFP.
Миддлбрук 7H9 средний Difco271310
BBL Middlebrook ADC обогащениеBBL211887
твин-80
глицерин
канамицина B сульфат (20 &; г/мл)SigmaB5264
Prolong Gold анти=-выцветающий реагент с DAPIInvitrogenP36935
Трипсин-ЭДТА
Бычья сыворотка альбумин
Параформальдегид
DAPI
LSM700 Конфокальный микроскопZeiss
Программное обеспечение для обработки 3D/4D изображений iMaris Scientific, версия 7.6.8Bitplane AG
легких легких человека

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sakamoto, K. The pathology of Mycobacterium tuberculosis infection. Veterinary pathology. 49, 423-439 (2012).
  2. Saunders, B. M., Britton, W. J. Life and death in the granuloma: immunopathology of tuberculosis. Immunol Cell Biol. 85, 103-111 (2007).
  3. Kaufmann, S. H. New issues in tuberculosis. Ann Rheum Dis. Ann Rheum Dis. 63, Suppl 2. ii50-ii56 (2004).
  4. Morrison, J., Pai, M., Hopewell, P. C. Tuberculosis and latent tuberculosis infection in close contacts of people with pulmonary tuberculosis in low-income and middle-income countries: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infect Dis. 8, 359-368 (2008).
  5. Barry 3rd, C. E., et al. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies. Nat Rev Microbiol. 7, 845-855 (2009).
  6. Puissegur, M. P., et al. An in vitro dual model of mycobacterial granulomas to investigate the molecular interactions between mycobacteria and human host cells. Cell Microbiol. 6, 423-433 (2004).
  7. Kapoor, N., et al. Human Granuloma In Vitro Model, for TB Dormancy and Resuscitation. PLoS One. 8, e53657(2013).
  8. Nguyen Hoang,, T, A., et al. Dendritic cell functional properties in a three-dimensional tissue model of human lung mucosa. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, L226-L237 (2012).
  9. Parasa, V. R., et al. Modeling Mycobacterium tuberculosis early granuloma formation in experimental human lung tissue. Dis Model Mech. 7, 281-288 (2014).
  10. Cozens, A. L., et al. CFTR expression and chloride secretion in polarized immortal human bronchial epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 10, 38-47 (1994).
  11. Brighenti, S., Andersson, J. Local immune responses in human tuberculosis: learning from the site of infection. J Infect Dis. 205, Suppl 2. S316-S324 (2012).
  12. Davis, J. M., Ramakrishnan, L. The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection. Cell. 136, 37-49 (2009).
  13. Gupta, U. D., Katoch, V. M. Animal models of tuberculosis. Tuberculosis (Edinb). 85, 277-293 (2005).
  14. Kashino, S. S., Napolitano, D. R., Skobe, Z., Campos-Neto, A. Guinea pig model of Mycobacterium tuberculosis latent/dormant infection. Microbes Infect. 10, 1469-1476 (2008).
  15. Singhal, A., et al. Experimental tuberculosis in the Wistar rat: a model for protective immunity and control of infection. PLoS One. 6, e18632(2011).
  16. Subbian, S., et al. Phosphodiesterase-4 inhibition alters gene expression and improves isoniazid-mediated clearance of Mycobacterium tuberculosis in rabbit lungs. PLoS Pathog. 7, e1002262(2011).
  17. Lin, P. L., et al. Tumor necrosis factor neutralization results in disseminated disease in acute and latent Mycobacterium tuberculosis infection with normal granuloma structure in a cynomolgus macaque model. Arthritis Rheum. 62, 340-350 (2010).
  18. Rahman, S., et al. Compartmentalization of immune responses in human tuberculosis: few CD8+ effector T cells but elevated levels of FoxP3+ regulatory t cells in the granulomatous lesions. Am J Pathol. 174, 2211-2224 (2009).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

3D

Похожие статьи