Количественное толстой стволовых клеток мутации

Краткое содержание

Мы сообщаем о значительных улучшениях воспроизводимого измерения мутаций соматических стволовых клеток толстой кишки после воздействия на мышей потенциальных агентов, повреждающих ДНК.

Аннотация

Возможность измерения стволовых клеток мутации является мощным инструментом для количественной оценки в критическом клеточной популяции, если и в какой степени, химикат может вызывать мутации, которые потенциально могут привести к раку. Применение ферментативного количественного анализа для количественной оценки мутаций стволовых клеток в гене глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы Х-хромосомой уже сообщалось ранее. ¹ Этот метод требует подготовки замороженных срезов и инкубации секционного ткани с реакционной смеси, что приводит к синий цвет, если клетки продуцируют функциональный глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФД) фермент. Если нет, то появляются беловатые клетки. Мы модифицировали реакционной смеси с использованием оптимальных температуры резания Соединение (OCT) среды в месте поливинилового спирта. Это облегчает измерение рН, повышает растворимость компонентов Г6ФД окрашивания и ограничивает диффузию Г6ФД фермента. Чтобы продемонстрировать, что мутация произошла в стволовой клетки, вся склепа должны хватает Г6ФД ферментативныеМероприятия. Только если стволовая клетка питает фенотипическим мутации Г6ФД будет все потомство в крипты хватает Г6ФД ферментативную активность. Чтобы определить склепов с мутацией стволовых клеток, четыре последовательных смежных замороженные срезы (уровень) были вырезаны в 7 мкм толщиной. Этот подход сделать соседние сокращений обеспечивает конформацию, что склеп был полностью мутировал так же мутировавший склепа будет наблюдаться в соседних секций. Слайды с образцами тканей, которые были более, чем 50 мкм друг от друга были готовы оценить в общей сложности 10> ⁴ склепов на мышь. Частота мутации число наблюдаемых мутантных (белых) крипт ÷ на количество дикого типа (синий) крипт в группе лечения.

Введение

Рак толстой кишки, как полагают, подвержен воздействию окружающей среды агентов и пищевых компонентов, которые могут повредить ДНК и производить активации соматических мутаций в онкогены (например, SS-катенин) или инактивации мутации в генах супрессоров опухолей (например, APC). Предполагается, что эти критические мутации происходят в толстой стволовых клеток. Из-за уникального крипт архитектуры ободочной эпителия, можно измерить стволовых клеток мутации в толстой кишке после экспонирования животных к химикатам, связанных с толстой кишки канцерогенеза. Несколько Х-сцепленные ферменты могут служить в качестве индикаторов мутаций, которые происходят в стволовых клетках, так как мутации будут присутствовать во всех клетках крипты внутри.

Ранее процедура была опубликована демонстрируя, что химические вещества, которые вызывают опухоли толстой кишки у мышей также генерируется соматических мутаций стволовых клеток в толстой кишке с помощью анализа мутаций в Х-хромосомой глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (G6PD) генов. ^1-3Метод определяет количество случаев случайных соматических мутаций в толстой стволовых клеток без давления отбора. Процедура включает в себя производство незаписанных участков толстой кишки замороженных из обработанных и контрольных мышей и определение склепов, лишенных клеток, которые производят функциональную активность Г6ФД. Эти мутантные склепов, которые кажутся белыми, показывают, что мутация произошла в стволовой клетки, которые привели к потомству также укрывательство мутантный ген G6PD. В ферментативного количественного анализа, Г6ФД дефицитных мутантных крипты не может окислить глюкозо-6-фосфат, который необходим для снижения нитро синего тетразолия (NBT). Когда Г6ФД фермента функционально, НБТ в окрашивания смеси снижается до нерастворимого формазана и осадков, накапливая на месте фермента и "окрашивания" клеток синего. Клетки, которые Г6ФД мутанты остаются беловатые, в отличие от синих окрашенных диких склепов типа. Этот метод измеряет мутации, которые имеют «нулевого» фенотип. Потому что анзимов, такие как G6PD, могут диффундировать из клеток на участке нефиксированной ткани, если участки размещены в водном растворе, необходимо, чтобы стабилизировать фермент в срезах тканей для анализа. ⁴ Стабилизация фермента в ткань не должна мешать диффузии малых молекул реагентов, необходимых для реакции ферментативного Г6ФД.

Мы сделали ряд существенных изменений в первоначальной процедуре. Среда для критической ферментативного окрашивания был изменен с поливинилового спирта с Оптимальное температуры резания соединения (OCT), что облегчает контроль рН и растворение компонентов, используемых в анализе. Окрашивание осуществляется с использованием 0,4 - 0,5 мл колодцев из стальными шайбами ​​так, чтобы каждый срез ткани животных получала такой объем реакционной смеси Г6ФД. Процедура была разработана, чтобы оценить количество крипт в виде изображения сечения, которая обеспечивает большой выборки толстой ткани безвручную рассчитывать> 10 ⁵ склепов для каждого толстой кишки. Анализ соседних участков ткани 7 мкм обеспечивает визуализацию мутантного склепе на более чем одного слайда, который снижает потенциальные артефакты окрашивания. Эти изменения делают процедуру более эффективным и воспроизводимым.

Используя этот пересмотренный протокол, мы количественно частоты мутаций в клетках ободочной стволовых после воздействия на мышей C57BL / 6, чтобы azoxymethane, известный канцероген толстой кишки у грызунов. ^5-7

Протокол

Экспериментальные методики и этичное обращение с животными был утвержден в университете Питтсбурга IACUC (протокол № 1104674).

1. Подготовка Г6ФД окрашивания смеси

ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что конечная концентрация каждого реагентов следующим образом 5 мМ глюкозо-6-фосфат (G6P); 2 мМ НАДФ, 5 мМ MgCl _2, 0,35 мМ 1-метокси-5-метил methylphenazinium сульфат (MMPMS) и 0,8 мМ NBT. ^1,8,9 Для каждого реагента начальная концентрация была получена в течение 40 мл конечного объема. Растворы свежеприготовленный и использовали каждый день.

1. Добавить 2 мл 200 мм рН 7,4 фосфатный буфер (PB) в 35 мл ОКТ среды в 50 мл пробирку и энергично встряхивают. Подтверждение индикаторной бумагой, что раствор подвергают ~ рН 7,4. Если не отменить решение.
2. Добавить 61 мг G6P растворяли в 0,94 мл 200 мМ PB, 61 мг НАДФ растворяют в 0,94 мл 200 мМ PB, и 41 мг _MgCl 2, растворенного в 0,96 мл 100 мМ PB. Подтвердить, что рН ~ 7,4 остроумиеч рН бумаги. Если не ~ 7,4, отменить решение.
3. Добавить 5 мг MMPMS растворенных в 0,25 мл 200 мМ PB (рН 7,4). Энергично встряхнуть полученной реакционной смеси для создания четкого темно-красный гомогената. Если раствор мутный, смесь должна быть отброшена. Трубка, содержащая реакционную смесь завернуть в фольгу, чтобы свести к минимуму воздействие света. Храните реакционной смеси при комнатной температуре, а последний компонент, НБТ, готовится.
4. Приготовьте отдельно раствор 5 мМ NBT добавлением 0,4 мл безводного диметилформамида (ДМФ) и 0,4 мл безводного этанола до 164 мг NBT в 2 мл пробирку с уплотнительным кольцом крышки. Закройте крышку неплотно (не плотно закрытой) и довести раствор до энергичного кипения на масляной бане до тех пор, пока NBT в растворе. ⁸
5. Разрешить растворенный NBT остыть до комнатной температуры, а затем добавить все решения OCT реакционной смеси и энергично встряхивают, чтобы получить прозрачный раствор. Соблюдайте изменение цвета раствора от начального оранжево-красного до темно-красного или PurpЦвет ле течением времени. Это нормально.
6. Поместите окончательного окрашивания Г6ФД смеси в 37 ° C теплом помещении в течение 1 часа перед использованием.

2. Животное Лечение и тканей Коллекция

1. Лечить 6-недельных C57BL / 6 самцов мышей с ДНК повреждающего агента, например, 10 мг / кг azoxymethane (ОСО) в объеме 200 мкл PBS путем инъекции IP. Лечить контрольных мышей с 200 мкл PBS по инъекцией.
2. В 90 дней, усыпить мышей СО ₂ удушья с последующим смещением шейных позвонков, утвержденного протоколом IACUC.
3. Хирургическим вскрыть брюшную полость от чуть выше ануса до основания грудины. Перемещение тонкий кишечник из полости тела, но не вырезать его. Акцизный нижнюю кишечник чуть ниже слепой кишки к прямой кишки. ¹⁰
4. Осторожно разрезать вдоль одной стороны толстой кишки с помощью микро-рассечение ножницами и удалить фекалии из открытой толстой кишки путем промывки чистой стерильной PBS. Рулет акцизд толстой кишки с просвета стороной наружу, и место в ткани формы. ¹⁰
5. Полностью погрузиться толстой кишки в октябре среднего и место пресс-формы в Дьюар с жидким _N 2. Удержание формы с тем, что пластмассовое основание просто в контакте с жидкой _N 2 до среда ОСТ замерзла.
6. Храните блок замороженной ткани при -80 до резки замороженных срезов. Не используйте закрепитель, который приведет к инактивации фермента G6PD.

3. Подготовка замороженных срезов

1. Сокращение замороженных срезов при толщине 7 мкм, использу криостат при -25 ° С. Вырезать 4 последовательных 7 мкм разделы и поместите два из них на одном слайде (рис 1). Подготовьте 2 горки, или четыре последовательных 7 мкм разделы, представляют собой один уровень толстой кишки (рис 1).
2. Повторите для следующего уровня с минимального расстояния> 50 мкм от последней части прevious уровень. Это расстояние обеспечивается, что склепы начисленных для каждого уровня не дублируют друг друга.
3. Часто протрите лезвие криостата со 100% этанола, чтобы удалить остаток, который накапливается OCT во время резки. Перед секционирования возобновляется, сухой лезвие протереть антистатической листа сушилки для рассеивания статического заряда накопленного. Храните слайды с замороженных срезов при -80 ^{о С.}

4. Окрашивание Замороженные срезы ткани

1. Выполните реакцию фермент гистохимии в 37 ° C теплом помещении с высокой влажностью.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Попытка ферментативную реакцию в инкубационном духовке или на слайд грелки привело к ухудшению и непоследовательной окрашивания Г6ФД.
2. Построить скважин для ткани окрашивания с использованием двух 1,5 см х стальными шайбами ​​0,15 см (внутренний диаметр х высота), которые соединяются вместе при помощи силиконовой смазкой (рис 1). Вырезать парафильмом, чтобы соответствовать базы скважины с центром вырезать и место хорошоd по сечению ткани на слайде.
   Примечание: парафильмом на нижней части стиральной машины создает уплотнение между стеклом и шайбой, который поддерживает вязкой окрашивания Г6ФД смесь на участке ткани. Эта конструкция дает хорошо с 0,4 - 0,5 мл объеме, так что каждый срез ткани в исследовании принимает тот же объем реакционной смеси Г6ФД окрашивания.
3. Выдержите замороженные слайды ткани на 37 ^{о С} в теплом помещении в течение 10 мин. При 37 ° С, добавить окрашивания Г6ФД реакционной смеси до каждого среза ткани скважины (2 секции на слайд) 45-50 мин. Удалить слайды из теплой комнате, и осторожно поднимите скважин из нержавеющей стали выключения слайдов.
4. Установка скользит по их длинной стороне, чтобы реакционная среда, чтобы высушить. Место слайдов в 100 мМ PB (рН 7,4) в течение 30-60 мин для удаления окрашивания Г6ФД реакционной смеси из ткани, не нарушая окрашивание тканей. Submerge слайды в дистиллированной воде в течение 5-10 мин, чтобы удалить соли PB
5. Уплотнение ткани дополненияING фтор-гель от капельницы на ткани и ждет ~ 30 мин для того, чтобы высохнуть. Избегайте пузырей, которые могут затруднить выявление мутантных склепов.
   Примечание: Если пузырьки образуют, процедура может быть повторена после удаления фтор-гель путем замачивания в дистиллированной воде. Не используйте крышку скользит, как они, как правило, воздушных пузырьков ловушки.

5. Определение Г6ФД Mutant гробницы и частоты мутаций

1. Анализ слайды для Г6ФД мутантных криптах под световым микроскопом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Критерии, используемые для идентификации полностью мутантный крипту были: (я) весь склепа был лишен синего цвета; (II) наружный структура крипт была цела, (III) мутант крипты наблюдалось на смежных участках 7 мкм и, (IV) два наблюдателя были определить тот же крипту как мутанта. Мутанты, наблюдаемые на соседних 7 мкм разделов считаются как одного мутанта.
2. Изображение каждой Г6ФД мутант склепа в 40-кратном увеличении и каталогизировать изображения, используя 5,0-мегапиксельную камеру сПО для обработки изображений.
3. Количественно общее количество крипт, рассмотренных в мыши, выбрав репрезентативной секции для каждой мыши из уровня с наименьшим площадь поверхности и образу его на 10-кратным увеличением (рис 1c).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Уровень представляет собой четыре последовательных 7 мкм секций (рис 1D), которые из-за их близости часто показывают мутировал склепов на более чем одном разделе. Уровни разделены> 50 мкм для визуализации крипты из разных областей толстой кишки.
4. Открытие каждого файла изображения и визуально подсчитывают количество крипт на уровне путем анализа файлов (показано на рисунке коробки 1с). Изображения файлы различаются по числу крипт наблюдается от самого низкого, как 20> 300 склепов в одном файле.
5. Умножить общее число крипт от выбранного уровня (рис 1в) для каждой мыши на число уровней, проверенных на Г6ФД мутантных криптах для каждого толстой кишки. Например, общее количество из1250 крипты в выбранном уровне, умноженные на 8 уровней, проверенных на мутантных криптах равняется общее количество 10000 склепов. Оценка как минимум 10000 крипт ободочной кишки для каждого статистического анализа.
6. Смешайте количество мутантов наблюдалось во всех животных на общее количество крипт на экране, чтобы рассчитать MF для каждой обработки. Фоновый уровень стволовых клеток Ф. в необработанном мышей <0.1x10 ^-4 (Таблица 1), что близко к тому, что ранее сообщалось, в C57Bl / 6 мышей. ¹¹

Результаты

Возможность измерения толстой мутации стволовой клетки у животных предоставляет уникальный способ соотнести мутации в индукции рака. Обычно предполагается, что важным шагом в процессе канцерогенеза включает активирующие мутации в онкогены и / или инактивации мутации в генах супрессоров опухолей. Мы вводили мышам C57BL / 6 с 200 мкл PBS или 10 мг / кг АОМ в 200 мкл PBS. ОСО является известным канцерогеном толстой кишки. ^5-7 В 90 дней были проанализированы двоеточия для стволовых клеток мутации. Это время необх...

Обсуждение

Часто генотоксичных эффект соединения определяют по его способности изменять ДНК. Обычно это делается путем выделения ткани и измерения глобальный уровень аддуктов ДНК. Для острого среднего отита, это будет означать количественного ^O 6 -methylguanine аддукты в толстой кишке. Используя эту информацию, подход на повреждения в конкретных типах клеток, например, в ниши стволовых клеток, теряется. Кроме того, аддукт ДНК не такой же, как мутации, так как только небольшая часть аддуктов, в конечном счете преобразова...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
реагенты
нитрозин, тетразолий
НАДФ,
глюкозо-6-фосфат
1-метокси-5-метилфеназиний, метилсульфат
диметилформамидфосфат
буфер (рН 7,4
Оптимальная температура резки (OCT)
Аппаратура
световой микроскоп оснащена 5 Мп камерой
криостата
теплого помещения