Method Article

Трехмерных изображений и анализ митохондрии внутри человека Intraepidermal нервных волокон

DOI:

10.3791/53369

⸱

September 29th, 2017

 ,  ,  , 
1University of Michigan Medical School, 2Department of Neurology, University of Michigan, 3Department of Internal Medicine, University of Michigan

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол использует трехмерные (3D) методы визуализации и анализа для визуализации и количественно нерва конкретных митохондрий. Методы применяются в других ситуациях, где один флуоресцентные сигнал используется для того, чтобы изолировать подмножество данных из другой флуоресцентного сигнала.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Целью настоящего Протокола является изучение митохондрий в пределах intraepidermal нервных волокон. Таким образом 3D визуализации и анализа методов были разработаны для изолировать нерва конкретных митохондрии и оценивать болезнь индуцированные изменения митохондрий в дистального наконечника сензорных нервах. Протокол сочетает в себе флуоресценции иммуногистохимии, конфокальная микроскопия и методы анализа 3D изображение для визуализации и количественно нерва конкретных митохондрий. Подробные параметры определяются на протяжении процедуры для того, чтобы обеспечить конкретным примером того, как использовать эти методы для изоляции нервных специфичные митохондрий. Антитела были использованы для обозначения нерва и митохондриальной сигналов в рамках разделов ткани кожи пунш биопсий, который последовал непрямой иммунофлюоресценции для визуализации нервы и митохондрии с зеленым и красным флуоресцентного сигнала соответственно. Z-серии изображения были приобретены с помощью конфокальной микроскопии и программное обеспечение для 3D-анализа была использована для обработки и анализа сигналов. Это не обязательно следовать точные параметры, описанные в, но важно соответствовать те выбрали во всем окрашивание, сбора и анализа данных шаги. Сила настоящего Протокола является, что это применимо к самые разнообразные обстоятельства, где один флуоресцентные сигнал используется для того, чтобы изолировать других сигналов, которые в противном случае будет невозможно учиться самостоятельно.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Митохондрии служат жизненно важные клеточные функции, которые включают производство энергии клеток, буферизация кальция и регулирование некротические и apoptotic клеток смерти1,2,3. Нервная система имеет высокую скорость метаболизма, по сравнению с тела4 , предполагая, что нейроны генерировать высокий уровень клеточной энергии в виде аденозинтрифосфата (АТФ) через митохондриальное дыхание. Много доказательств документы, что нейронные функции зависят от АТФ5, особенно на синапсы6. Таким образом распределение митохондрий в пределах нейронов имеет важное значение.

За последние 10 лет много информации показал, торговлей и стыковка нейрональных митохондрий жестко регламентируется. Моторные белки участвуют в распространении митохондрий конкретных сотовых отделений во всем нейроном. Торговля митохондрий особенно важна, потому что нейроны проекта аксонов и дендритов вдали от Сома. Кинезин моторов белков главным образом прямые, антероградная (от soma) торговля митохондрий вдоль микротрубочек во время Динеин моторов белков прямой ретроградным (в сторону сома) моторики7,8,9 , 10. Существует клеточных сигналов такой митохондриальной мембранного потенциала и проводимости импульса, которые влияют на наличие и направление митохондриальной людьми11,12,13.

Помимо транспортировки митохондрий, существуют специализированные белки для локализации митохондрий для конкретных клеточных отсеков, которые предъявляют требования высокой энергии, таких как узлы по Ranvier и синапсы8,14, 17. В самом деле, большинство из митохондрий в пределах аксоны являются не подвижные9,13,18. Специализированные белки, как syntaphilin якорь митохондрий в микротрубочки вдоль аксоны в то время как другие белки митохондрий якорь в Цитоскелет актина19–21. Факторы роста и ионов, таких как кальций были зарегистрированы в поддержку прекращения движения митохондрий локализовать их в районы, где они являются необходимой21,22,23.

Взятые вместе, торговли людьми и закрепления митохондрий жизненно важное значение для надлежащего функционирования нейронов. В поддержку этого нарушения в митохондриальной людьми была связана с нескольких неврологических условий включая болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз, болезнь Шарко-Мари-зуб, болезнь Хантингтона, наследственные спастический парезами и атрофия зрительного нерва15,24,25,,2627. Недавние исследования были сосредоточены на митохондриальной дисфункции и патологии как потенциального механизма для диабетической невропатии, сенсорные потери, связанные с диабетом28,,2930,31 ,32,33. Гипотеза является, что диабет изменяет распределение митохондрий в пределах сенсорные прогнозы конца кожный нерв. Таким образом метод был разработан для визуализации и количественно митохондрий в пределах intraepidermal нервных волокон (IENFs), дистальная советы корень спинной ганглий сенсорные афферентов. Техника сочетает в себе флуоресценции иммуногистохимия конкретных митохондриальных и нервных волокон этикетки с приобретением confocal микроскопии z серии сигналов с мощным 3D изображений программное обеспечение для анализа для измерения распределения нерва конкретных Митохондрии от человека кожный пробивать биопсии для достижения этой цели.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

биопсия кожи удар были получены от предметов, которые были набраны из сети большой первичной помощи на базе общин в университете штата Юта диабет-центр (Солт-Лейк-Сити, UT). Это исследование было утверждено институциональных Наблюдательный Совет университета Мичигана и соблюдает принципы Хельсинкской декларации. Написанных информированное согласие было получено от каждого предмета до тестирования.

1. флуоресценции иммуногистохимия

  1. подготовить удар биопсии для иммуногистохимии intraepidermal нервных волокон:
    1. выполнять 3 мм кожи биопсии, медицинский персонал и место биопсии целый в 1,5 Мл Zamboni ' s фиксирующие раствор (параформальдегида 2%, 0,3% насыщенных пикриновой кислоты в фосфатный буфер (PBS), рН 7,4) при 4 ° C на ночь.
    2. Промыть образцы с раствором 30% сахарозы в PBS на 4 ° C для 16-24 ч или до тех пор, пока образец погружается.
    3. Вставить образцы оптимального раскроя температуры смеси (OCT) с помощью cryomold. Место биопсии целый 3 мм с эпидермисом, вниз в форму и заполнить форму с примерно 2 мл октября замораживания плесень на измельченного сухого льда. Хранить при температуре-80 ° C до готовой к использованию.
    4. Вырезать 50 мкм толщиной сечения с помощью криостат и хранить в отдельных скважинах 96-луночных пластины с помощью 180 мкл антифриз хранения решения за хорошо (30% этиленгликоля, 30% глицерина в PBS). Следующие направления предназначены для 8 скважин 96 хорошо плиты. Пятно от каждого сайта биопсии разделы, которые являются 200-300 мкм друг от друга.

день 1:

  1. утолить неспецифичный Этикетировочный из рогового:
    1. Label 96-луночных пластину как показано на рис. 1.
    2. Пипетки 150 мкл запасов сигнала усилитель решение уменьшить неспецифического связывания вторичные антитела 34 , 35 в каждой скважине. Перевести разделы в решение усилитель сигнала с использованием пересевать цикла.
      Примечание: Будьте осторожны во время работы с ткани, чтобы избежать повреждения или разрывов разделов ткани. Держите в растворе усилитель сигнала для 30 минут при комнатной температуре на плоской рокер.
    3. Подготовка промывки скважин в строках 2 и 3 96-луночных пластины, добавив 150 мкл 1 x-фосфатный буфер (PBS) в каждой скважине.
    4. Тщательно передачи Секции в строке 2 и промыть в однократном ПБС втечение 10 мин при комнатной температуре.
    5. Промыть во второй раз в однократном ПБС втечение 10 мин при комнатной температуре (строка 3).
  2. Подготовить 5% бычьим сывороточным альбумином (БСА) преграждая разрешение:
    1. подготовить блокирования решения, содержащего 5% BSA 5% и 0,3% Тритон X 100 (TX-100) в 0,1 М PBS (см. таблицу 1), а разделы инкубации в решение усилитель сигнала. BSA не вдаваться в раствор легко. Вихревой решения до тех пор, пока полностью растворяется BSA.
    2. Подготовить блокировки скважины в строке 4 96-луночных пластины, добавив 150 мкл 5% BSA, преграждая разрешение в каждой скважине.
    3. Переноса разделов в индивидуальные добра 5% BSA, преграждая разрешение и инкубировать секций в 5% BSA, преграждая разрешение для 1-2 ч при комнатной температуре на плоской рокер и.
  3. Подготовить 1% BSA полоскания раствор и разбавления первичных антител:
    1. подготовить 1% полоскания решение, содержащее BSA 1% и 0,3% TX-100 в 0,1 М PBS (см. таблицу 2), а разделы являются инкубации в 5% BSA блокирования решения. BSA не вдаваться в раствор легко. Вихревой решения до тех пор, пока полностью растворяется BSA.
    2. Развести первичных антител в промывной раствор 1% BSA в то время как разделы инкубации в 5% BSA блокирования решения.
      1. 1 500 мкл раствора первичного антитела и добавить к каждому хорошо в строке 5.
      2. Развести первичного антитела: используйте ярлык нерв конкретных, кролика polyclonal против белка гена продукт 9.5 (PGP9.5) 1:1, 000. Использовать метку митохондрии конкретных, мышь моноклонального анти пируват дегидрогеназа E2/E3bp антитела (PDH) в 1: 100 в 1% BSA полоскания решения.
  4. Подготовка основного антитела:
    1. 150 Накапайте µL первичных антител в каждый хорошо в строке 5 пластину 96-луночных.
    2. С помощью инструмента цикла, передачи секции от блокирования решения (строка 4) в строке 5, содержащий основное антитело.
    3. Обертывание пластины плотно с парафина держать его от высыхания.
    4. Образцы на плоских рокер при комнатной температуре в течение 1 ч и затем Проинкубируйте образцы на 4 ° c на плоской рокер на ночь.

день 2:

  1. промыть образцы:
    1. подготовить промывки скважин в строках 6, 7 и 8 96-луночных пластины, добавив 150 мкл 1% BSA полоскание решения в каждой скважине.
    2. Переноса разделов в первый промывной раствор 1% BSA (строка 6) и инкубировать 1 час при комнатной температуре. Повторить полоскание вдвое больше по инкубации секций в 1% BSA полоскания раствор в строках 7 и 8 за 1 ч при комнатной температуре.
  2. Разбавленных вторичных антител в 1% BSA полоскания решение:
    1. сделать 1500 мкл раствора вторичное антитело в то время как разделы инкубации в последней промывки 1% BSA полоскания раствор (строка 8).
    2. Развести вторичные антитела: для PGP9.5 (антитела анти кролик зеленый люминесцентной конъюгированных коза, 1: 1000), для PDH (красный люминесцентные конъюгированных коза анти мышь, 1:1, 000) в 1% BSA полоскания решения.
  3. Подготовить вторичные антитела:
    1. пипетки 150 мкл вторичных антител в строку 9 пластину 96-луночных.
    2. Аккуратно перенести разделы с 1% BSA полоскания раствор (строка 8) в вторичное антитело скважины (строка 9).
    3. Использование парафина, оберните пластины плотно, чтобы сохранить его от высыхания. Накрыть алюминиевой фольгой. Поместите образцы на плоских рокер при комнатной температуре в течение 1 ч и затем Проинкубируйте образцы на 4 ° c на плоской рокер на ночь.

день 3:

  1. Подготовка чистота ПБС, фильтрация через фильтр 0,22 мкм:
    1. 150 Накапайте µL из отфильтрованных ПБС в строку 10, 11 и 12.
    2. Передавать строку 10 образцов и промыть в ПБС за 1 ч при комнатной температуре. Крышка 96-луночных с алюминиевой фольгой и поместите на плоской рокер во время полоскания. Повтор фильтруют 1 x PBS промыть два больше раз за 1 ч при комнатной температуре в строках 11 и 12.
  2. Подготовить Микроскоп слайды для монтирования разделов ткани:
    1. место 50 мкл фильтруют на слайде ПБС.
    2. Передачи секции с ПБС (строка 12) в 50 мкл падение. Осторожно поместите раздел в выпадающем PBS разворачивается в ткани и аккуратно уплощение на стеклянное скольжение. Удалите избыток PBS с стеклянной пипетки, чтобы избежать разбавления реагентов монтажа. Не прикасайтесь к секции с стеклянная колба.
      3. Уход за
    3. пипетки 1 - 2 капли реагента монтажа, содержащие DAPI непосредственно поверх раздел на слайд микроскопа с помощью не беспокоить ориентации секции. Осторожно поместите coverslip стекло микроскопа 50 x 24 мм #1.5 секции.
    4. Очистить все пузырьки воздуха, которые образуются при размещении coverslip и вытрите избыток жидкости от края coverslip. Подготовить новый слайд и повторите монтажа prголовки для каждого раздела.
    5. Лечение сухого монтажа СМИ, поместив слайды в темная ночь при комнатной температуре. Перенести слайды до 4 ° C для краткосрочного (1-2 недели) или от-20 ° C для длительного хранения (больше чем 2 недели).
      Примечание: Негативный контроль опущены первичного антитела для PGP9.5 или PDH в шаге 1.4.2.2 и отображается не различимых маркировки нервов или митохондрий в эпидермисе. Положительные элементы управления были выполнены для PDH антитела, чтобы доказать это этикетки всех митохондрии (данные не показаны). Позитивные элементы были исполнены на искусственный мыши Спинной корень ганглия нейронов, которые были преобразованы с бакуловирусы в митохондрии этикетки с сигналом зеленого флуоресцентного белка (ГПУП) и затем фиксированной и витражи с PDH антитела и красная лампа дневного света Вторичное антитело. Все митохондрий, которые выражали ГФП были совместно Приклеенные этикетку с красной этикеткой для иммуногистохимии PDH (данные не показаны).

2. Конфокальная томография

  1. выполняют конфокальная томография:
    1. собирать образы, используя лазерный Сканирующий конфокальный микроскоп с 40 X нефти погружение (1,25 числовой апертуры (н.а.)) цель на инвертированным микроскопом.
      1. На каждом фокальной плоскости последовательно приобрести флуоресцентные сигналы:
        ядер: возбуждения λ = 405 нм, спектральные выбросов фильтр λ = 420-480 Нм
        нервных волокон: возбуждения λ = 488 нм, спектральные выбросов фильтр λ = 505-560 Нм
        Mitoch ondria: возбуждения λ = 543 Нм, спектральные выбросов фильтр λ = 606-670 нм
    2. ввести следующие параметры сканирования в Микроскоп программное обеспечение: скорость сканирования 600 Гц с 2 усреднение и масштаб 2.2; 12-бит интенсивности резолюции (4096 серый уровни).
      1. Установить программное обеспечение микроскоп для оптимизированного латеральное разрешение (разрешение сканирования = 1024 x 1024) и осевой резолюции/оптический секционирование (конфокальный диафрагмы = 1 единица Эйри (АС) с z шаг размер 210 Нм).
        Примечание: В результате резолюции XYZ – 172.2 Нм x 172.2 Нм x 210 Нм с размером изображения мкм 176.1 x 176.1 мкм x 30-50 мкм.
    3. Активировать живой сканирования для нервных сигналов (зеленый флуоресцентным) и отрегулируйте z фокус управления, чтобы найти и задать верхний и Нижняя фокуса самолетов в Микроскоп программного обеспечения, которые охватывают нервных сигналов в разделе ткани. Общая z диапазон составляет обычно 30-50 мкм для секции ткани 50 мкм.
    4. Вращаться поля сканирования с помощью микроскопа программного обеспечения во время живой сканирования, так что эпидермисом располагается горизонтально или вертикально, на изображении.
    5. Проверять каждый сигнал отдельно и настроить детектор (фотоэлектронный умножитель трубки, PMT) напряжения и смещение для сведения к минимуму или удалить любой над и под насыщенных пикселей.
      Примечание: Время сканирования с вышеуказанными параметрами принимать примерно 20-40 минут в зависимости от количество фрагментов z.

3. 3D визуализации и анализа митохондрии внутри человека Intraepidermal нервных волокон

  1. изолировать 3D эпидермиса:
    1. дублировать исходное изображение и используйте максимальной интенсивности проекция (расширенный режим фокуса) изображения, чтобы идентифицировать и изолировать эпидермис.
    2. Использовать региона интерес инструмент для отслеживания вдоль верхнего и нижнего краев эпидермиса для удаления нежелательных областях, как роговой слой и дермы, которые отсутствуют intraepidermal нервных волокон. Урожай на этот выбор.
  2. Использования деконволюция на нерв и митохондриальной флуоресцентные сигналы:
    Примечание: деконволюция помогает восстановить целостность флуоресцентные сигналов. Восстановление, используемые в настоящем Протоколе называется слепой Деконволюция, потому что он использует флуоресцентные сигналов в изображениях, чтобы определить, сколько сигналы распространения от их первоначального источника (точка распространения функция). Этот процесс улучшает сигнал резолюции путем перераспределения сигнал распространяться обратно в место его происхождения.
    1. Вычислить точку распространения функция (PSF) для зеленого флуоресцентного нерва сигнала (зеленый флуоресцентным) со следующими параметрами:
      1. присвоено значение вычисляемого ПСФ конфокальный. Установите Средний показатель преломления 1.515 и числовой апертуры 1,25. Установка Детектор обскуры 1 блок Эйри (а.е.). Установка лазера длина волны возбуждения 488 нм и выбросов волны до 515 нм.
    2. Вычислить ПСФ для красных флуоресцентных митохондриальной сигнала (красный флуоресцентным) со следующими параметрами:
      1. набор рассчитывается ПСФ конфокальный. Установите Средний показатель преломления 1.515 и числовой апертуры 1,25. Установите детектор обскуры 1 АС. Установка лазера длина волны возбуждения 543 Нм и выбросов волны до 617 Нм.
    3. Оптимизировать нерва и митохондрий флуоресцентные сигналов по Деконволюция, используя соответствующий PSFs перечисленных выше и итеративный восстановление функций установлен на 100% доверие и итераций предел 10 циклов.
  3. Создать нерв конкретной поверхности:
    1. использования " создать поверхность " инструмент, чтобы сделать твердой поверхности нервов от deconvolved Грин люминесцентные вторичных маркировки PGP9.5 определены нервов.
    2. Снять " гладкой " есть и использовать функцию абсолютной интенсивности можно задать порог для сигнала нерв, так как это значительно ярче, чем фон флуоресценции.
    3. Использовать функцию абсолютной интенсивности можно задать порог для сигнала нерв, так как это значительно ярче, чем фон флуоресценции. Установите пороговое значение достаточно низко, чтобы точно определить нервы.
    4. Фильтр из мелких, не нерв поверхности на основе размера.
      Примечание: При необходимости вручную изменить дополнительные номера нерв поверхности в пределах " редактирования " вкладку, удерживая клавишу CONTROL, чтобы выделить несколько объектов и затем удалить их с клавишей Delete.
  4. Изолировать нерва конкретных флуоресцентные митохондриальной сигнал:
    1. выберите вкладку Правка поверхности нерва для просмотра " свойства маски " особенность. Поверхности нерва, созданный в шагах 3.3 используется для изоляции митохондрии внутри этих нервов от митохондриальной сигналы, связанные с кератиноцитов.
    2. Как " все маски ' кнопка открывает " канал маски " окно, выберите deconvolved красный люминесцентные сигнал из выпадающего меню под " выбор канала " для митохондриального сигнала.
    3. Щелкните в поле, чтобы поставить галочку " дубликат канала перед нанесением маски " параметр.
    4. Нажмите на радио кнопку перед " постоянной внутри/вне " маска параметров и нажмите кнопку в окне возможность поставить галочку " задать voxel вне поверхности " вариант и введите 0.00 для значения. Нажмите ОК кнопку, чтобы создать новый канал, представляющий митохондриальной сигналов внутри поверхности нерва.
  5. Создать митохондрии конкретной поверхности:
    1. использования " создать поверхность " инструмент, чтобы сделать твердой поверхности митохондрий от созданного флуоресцентные канала нерв конкретных митохондриальной сигналов от шаги 3.4.
    2. Снять " гладкой " располагают и выберите " фон вычитания " функцию, чтобы установить порог. Эта функция использует локальный контраст вокруг митохондриальной сигнала для идентификации митохондрий из фона.
    3. Набор пороговое значение достаточно низко, чтобы точно определить митохондрий. В этом примере Нижний порог был установлен в 2000 на 16-бит (65536) масштаба.
    4. Фильтр митохондриальной поверхностей на основе размера. В этом примере для 1.0 вокселей был установлен предел voxel, который является самым низким ограничить возможности. При необходимости вручную редактировать из не митохондрии поверхности в пределах " редактирования " вкладку, удерживая клавишу CONTROL, чтобы выбрать несколько объектов и затем удалить их с клавишей Delete.
      Примечание: Иногда, программное обеспечение будет создавать поверхностей, которые не связаны с различимым флуоресцентные митохондриальной сигнал. В таких случаях, это возможно удалить их с " редактирования " таб
  6. Экспорт и вычисления значений морфометрического анализа:
    1. экспорта значений для нервных и митохондриальной поверхностей от " статистики " вкладка для дальнейшего анализа с программным обеспечением электронной таблицы.
    2. Экспортировать значения громкости для нервных и митохондриальной поверхностей.
    3. Количество отдельных нервных волокон, которые присутствуют в каждом изображении и запишите значение в электронной таблице.
    4. Для каждого изображения, рассчитать следующие потенциальные значения для анализа в электронной таблице:
      1. Сумма томов для всех поверхностей нерва.
      2. Фильтр, нерв конкретных митохондриальной поверхности ниже объема менее 0,02 мкм 3 и Бен размер поверхности. Например, использование контейнеров например 0,02 - 0,04, 0,04 - 0,08, 0,08 - 0.16, 0,16 - 0.32, 0,32 - 0,64, 0,64 - 1,28, 1.28-2.56, больше 2.56 мкм 3.
        Примечание: Нижний предел митохондриальной объем был установлен до 0,02 мкм 3 на основе ранее опубликованных томов mitonchodria 36 , , 37 38.
      3. Подсчитать количество нервных конкретных митохондриальной поверхностей внутри каждого бункера и общее количество поверхностей над бункеров (0,02 - больше, чем 2.56 мкм 3).
      4. Вычислить долю нерва конкретных митохондриальной поверхностей в каждой ячейке. Используйте счетчик на бин, деленное на общее количество митохондрий поверхностей.
      5. Сумма томов для всех поверхностей нерва конкретных митохондриальной.
      6. Расчета доли нерва с митохондриальных сигнала путем деления всего нерв поверхности объем по сумме всех митохондриальных поверхности томов.
      7. Рассчитать количество митохондрий на нерв объема путем деления всего нерв поверхности объем, количество всех митохондриальных поверхностей.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Визуализация и количественная оценка митохондрий в человека IENFs

Флуоресценции иммуногистохимия позволяет одновременное маркировки множества сигналов для визуализации нервы, митохондрии и ядер в пределах биопсии кожи человека. 96-луночных плита является удобным способом организовать шаги в процедуре иммуногистохимия. Рисунок 1 показывает, что эта конфигурация приходится до 8 секций...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол предназначен для изолировать, количественной оценки и анализа размера и распределения нерва конкретных митохондрий в IENFs в 3D от биопсии кожи человека. Есть несколько важных шагов в протоколе. Свободно плавающего флуоресценции иммуногистохимия предназначен для пятен и анализировать несколько сигналов в каждой пробе, обеспечивая более гибкой методологии для исследуют исследований44,45. Эта процедура позволяет для проникновения антител в ткани для т...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Отсутствие конфликта интересов объявить.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана национальными институтами здравоохранения грантов K08 NS061039-01A2, программа для неврологии исследований & открытия и A. Альфред Таубман медицинский научно-исследовательский институт в университете штата Мичиган. Эта работа использовала морфологии и ядро анализа изображения Мичиган диабет исследовательского центра, финансируемые национальными институтами здравоохранения грант 5P 90 DK-20572 от национального института диабета и пищеварения и болезни почек. Авторы хотели бы поблагодарить Дж. Робинсон Синглтон и а. Гордон Смит (Университет штата Юта) за их щедрое пожертвование образцов кожи человека.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2% Предложение фиксаторов для новичков Zamboni,Миддлтон, Висконсин1459A2% параформальдегид, 0,2% насыщенная пикриновая кислота в фосфатно-солевом буфере (PBS), pH 7,4
10x фосфатно-солевой буфер (PBS)Fisher Scientific, Питтсбург, ПенсильванияBP399-4Для создания 1x
PBS Image-iT FX Signal EnhancerThermoFisher Scientific, Уолтем, МассачусетсI36933усиливает сигналы красителя Alexa Fluor за счет снижения неспецифического связывания
Anti-Protein Gene Product 9.5 Антитело (Rabbit Polyclonal)Proteintech Group Inc. Rosemont, IL14730-1-APсокращенно PGP9.5, заменяет снятый с производства AbD Serotec (Cat. No 7863-0504) антитело
Антипируватдегидрогеназа E2/E3bp антитело (мышиное моноклональное)abcam, Кембридж, Массачусетсab110333сокращенно PDH
Козье антимышиное вторичное антитело Alexa Fluor 594 конъюгатThermoFisher Scientific, Уолтем, МассачусетсA-11034красное флуоресцентное конъюгированное вторичное антитело
Козье антикролик Вторичное антитело Alexa Fluor 488 конъюгатThermoFisher Scientific, Уолтем, МассачусетсA-11032зелено-флуоресцентное конъюгированное вторичное антитело
альбумин, из бычьей сывороткиSigma-Aldrich, Сент-Луис, МиссуриA7906-100сокращенно BSA
Triton X-100Sigma-Aldrich, Сент-Луис, МиссуриT9284сокращенно TX-100
0.22 &микро; m ФильтрEMD Millipore, Billerica
MA		MILLEX GP SLGP 033NS0.22 &; m Многопоровый фильтр
Parafilm MFisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания13-374-10Curwood Wisconsin LLC Парапленка M (PM-996)
Некалиброванная петляFisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания22-032092инокуляционная петля от Decon LeLoop (MP 199-25)
96-луночная пробирная пластинаCorning Incorporated, Corning, NY360396-луночная пластина с плоским дном
Prolong Gold антифейдный реагент с DAPIThermoFisher Scientific, Уолтем, МассачусетсP-36931DAPI окрашивание ядер
Покровное стекло микроскопа 50 x 24 ммFisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания12-544EПокровные стекла
Superfrost Plus Предметные стекла для микроскопаFisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания12-550-15Предметные стекла для микроскопа
Leica SP5 Лазерный сканирующий конфокальный микроскопLeica Microsystems, Буффало Grove, ILSP5Конфокальный микроскоп
Volocity x64 Программное обеспечение Perkin Elmer, Waltham, MAверсия 4.4.0Программное обеспечение Volocity используется для этапов 3.1 и 3.2 в протоколе обработки изображений
Imaris x64 3 Dimensional Analysis SoftwareBitplane, Concord, MAверсия 7.7.1Программное обеспечение Imaris используется для этапов с 3.3 по 3.5 в протоколе анализа изображений
ExcelMicrosoft, Redmond, WAверсия Office 2013Программное обеспечение для работы с электронными таблицами Excel используется для этапа 3.6 протокола для обобщения морфометрических характеристик
Оптимальная температура резки CompoundSakura Finetek США, Inc., Torrance, CA4583сокращенно
OCT Leica CryostatLeica Biosystems, Buffalo Grove, ILCM1850Cryostat для резки 50 & микро; m секции
CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0ThermoFisher Scientific, Waltham, MassachusettsC10600Используется в качестве позитивного контроля для маркировки митохондрий зеленым флуоресцентным сигналом
;

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nicholls, D. G., Budd, S. L. Mitochondria and neuronal survival. Physiol Rev. 80 (1), 315-360 (2000).
  2. Chan, D. C. Mitochondrial fusion and fission in mammals. Ann Rev Cell Dev Biol. 22, 79-99 (2006).
  3. Ni, H. M., Williams, J. A., Ding, W. X. Mitochondrial dynamics and mitochondrial quality control. Redox Biol. 4 (C), 6-13 (2015).
  4. Mink, J. W., Blumenschine, R. J., Adams, D. B. Ratio of central nervous system to body metabolism in vertebrates: its constancy and functional basis. Am J Physiol. 241 (3), R203-R212 (1981).
  5. Ames, A. 3rd CNS energy metabolism as related to function. Brain Res Brain Res Rev. 34 (1-2), 42-68 (2000).
  6. Harris, J. J., Jolivet, R., Attwell, D. Synaptic energy use and supply. Neuron. 75 (5), 762-777 (2012).
  7. Hollenbeck, P. J. The pattern and mechanism of mitochondrial transport in axons. Front Biosci. 1, d91-d102 (1996).
  8. Cai, Q., Sheng, Z. H. Mitochondrial transport and docking in axons. Exp Neurol. 218 (2), 257-267 (2009).
  9. Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (6), (2013).
  10. Saxton, W. M., Hollenbeck, P. J. The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci. 125 (Pt 9), 2095-2104 (2012).
  11. Sajic, M., et al. Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo. PLoS Biol. 11 (12), e1001754(2013).
  12. Ohno, N., et al. Myelination and axonal electrical activity modulate the distribution and motility of mitochondria at CNS nodes of ranvier. J Neurosci. 31 (20), 7249-7258 (2011).
  13. Miller, K. E., Sheetz, M. P. Axonal mitochondrial transport and potential are correlated. J Cell Sci. 117, 2791-2804 (2004).
  14. Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61 (4), 541-555 (2009).
  15. Sheng, Z. H., Cai, Q. Mitochondrial transport in neurons: impact on synaptic homeostasis and neurodegeneration. Nat Rev Neurosci. 13 (2), 77-93 (2012).
  16. Berthold, C. H., Fabricius, C., Rydmark, M., Andersen, B. Axoplasmic organelles at nodes of Ranvier. I. Occurrence and distribution in large myelinated spinal root axons of the adult cat. J Neurocytol. 22 (11), 925-940 (1993).
  17. Fabricius, C., Berthold, C. H., Rydmark, M. Axoplasmic organelles at nodes of Ranvier. II. Occurrence and distribution in large myelinated spinal cord axons of the adult cat. J Neurocytol. 22 (11), 941-954 (1993).
  18. Hollenbeck, P. J., Saxton, W. M. The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5411-5419 (2005).
  19. Ohno, N., et al. Mitochondrial immobilization mediated by syntaphilin facilitates survival of demyelinated axons. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (27), 9953-9958 (2014).
  20. Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
  21. Chada, S. R., Hollenbeck, P. J. Nerve growth factor signaling regulates motility and docking of axonal mitochondria. Curr Biol. 14, 1272-1276 (2004).
  22. Yi, M., Weaver, D., Hajnoczky, G. Control of mitochondrial motility and distribution by the calcium signal: a homeostatic circuit. J Cell Biol. 167 (4), 661-672 (2004).
  23. Saotome, M., et al. Bidirectional Ca2+-dependent control of mitochondrial dynamics by the Miro GTPase. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20728-20733 (2008).
  24. Schon, E. A., Przedborski, S. Mitochondria: the next (neurode)generation. Neuron. 70 (6), 1033-1053 (2011).
  25. Petrozzi, L., Ricci, G., Giglioli, N. J., Siciliano, G., Mancuso, M. Mitochondria and neurodegeneration. Biosci Rep. 27 (1-3), 87-104 (2007).
  26. Maresca, A., la Morgia, C., Caporali, L., Valentino, M. L., Carelli, V. The optic nerve: a "mito-window" on mitochondrial neurodegeneration. Mol Cell Neurosci. 55, 62-76 (2013).
  27. Su, B., et al. Abnormal mitochondrial dynamics and neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 135-142 (2010).
  28. Vincent, A. M., et al. Mitochondrial biogenesis and fission in axons in cell culture and animal models of diabetic neuropathy. Acta Neuropathol. 120 (4), 477-489 (2010).
  29. Leinninger, G. M., et al. Mitochondria in DRG neurons undergo hyperglycemic mediated injury through Bim, Bax and the fission protein Drp1. Neurobiol Dis. 23, 11-22 (2006).
  30. Leinninger, G. M., Edwards, J. L., Lipshaw, M. J., Feldman, E. L. Mechanisms of disease: mitochondria as new therapeutic targets in diabetic neuropathy. Nat Clin Pract Neurol. 2, 620-628 (2006).
  31. Edwards, J. L., et al. Diabetes regulates mitochondrial biogenesis and fission in mouse neurons. Diabetologia. 53 (1), 160-169 (2010).
  32. Fernyhough, P., Roy Chowdhury, S. K., Schmidt, R. E. Mitochondrial stress and the pathogenesis of diabetic neuropathy. Expert Rev Endocrinol Metab. 5 (1), 39-49 (2010).
  33. Schmidt, R. E., Green, K. G., Snipes, L. L., Feng, D. Neuritic dystrophy and neuronopathy in Akita (Ins2(Akita)) diabetic mouse sympathetic ganglia. Exp Neurol. 216 (1), 207-218 (2009).
  34. Penna, G., et al. Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation. J Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).
  35. Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. J Histochem Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
  36. Glas, U., Bahr, G. F. Quantitative study of mitochondria in rat liver. Dry mass, wet mass, volume, and concentration of solids. J Cell Biol. 29 (3), 507-523 (1966).
  37. Bertoni-Freddari, C., et al. Morphological plasticity of synaptic mitochondria during aging. Brain Research. 628 (1-2), 193-200 (1993).
  38. Kaasik, A., Safiulina, D., Zharkovsky, A., Veksler, V. Regulation of mitochondrial matrix volume. Am J Physiol. 292 (1), C157-C163 (2007).
  39. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nat Meth. 4 (7), 559-561 (2007).
  40. Park, J. Y., et al. Mitochondrial swelling and microtubule depolymerization are associated with energy depletion in axon degeneration. Neuroscience. 238, 258-269 (2013).
  41. Court, F. A., Coleman, M. P. Mitochondria as a central sensor for axonal degenerative stimuli. Trends Neurosci. 35 (6), 364-372 (2012).
  42. Baloh, R. H. Mitochondrial dynamics and peripheral neuropathy. Neuroscientist. 14 (1), 12-18 (2008).
  43. Chowdhury, S. K., Smith, D. R., Fernyhough, P. The role of aberrant mitochondrial bioenergetics in diabetic neuropathy. Neurobiol Dis. 51, 56-65 (2013).
  44. Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G., Johnson, T. Quantitation of epidermal nerves in diabetic neuropathy. Neurology. 47, 1042-1048 (1996).
  45. Lauria, G., et al. EFNS guidelines on the use of skin biopsy in the diagnosis of peripheral neuropathy. Eur J Neurol. 12 (10), 747-758 (2005).
  46. Lauria, G., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. Eur J Neurol. 17 (7), e944-e909 (2010).
  47. Umapathi, T., Tan, W. L., Tan, N. C. K., Chan, Y. H. Determinants of epidermal nerve fiber density in normal individuals. Muscle Nerve. 33 (6), 742-746 (2006).
  48. Lauria, G., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J Neurol Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
  49. Lauria, G., et al. Intraepidermal nerve fiber density at the distal leg: a worldwide normative reference study. J Peripher Nerv Syst. 15 (3), 202-207 (2010).
  50. Hamid, H. S., et al. Hyperglycemia- and neuropathy-induced changes in mitochondria within sensory nerves. Ann Clin Transl Neurol. 1 (10), 799-812 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondria ImagingNerve FibersConfocal Microscopy3D Image AnalysisFluorescence ImmunohistochemistryEpidermal MitochondriaNerve specific MitochondriaZ series AcquisitionSurface MaskingMitochondrial Quantification

Related Articles