Методическая статья

Физическая изоляция эндоспор из проб окружающей среды на целевой лизис вегетативных клеток

DOI:

10.3791/53411

⸱

21 января 2016 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Macquarie University, 2Vital-IT group, Swiss Institute of Bioinformatics, 3Laboratory of Microbiology, University of Neuchatel

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Был разработан метод выделения бактериальных эндоспор из сложных микробных сообществ для проведения специализированных культуральных или молекулярных исследований этой группы бактерий.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Образование эндоспор — это стратегия выживания, обнаруженная среди некоторых бактерий типа Firmicutes. Во время образования эндоспор эти бактерии переходят в морфофизиологическое состояние покоя, что повышает выживаемость в неблагоприятных условиях окружающей среды. Несмотря на то, что эндоспорообразующие Firmicutes являются одной из наиболее часто обогащаемых и изолированных бактериальных групп в исследованиях культивирования, они часто отсутствуют в исследованиях разнообразия, основанных на молекулярных методах. Устойчивость спорового ядра считается одним из факторов, ограничивающих восстановление ДНК из эндоспор. Мы разработали метод, который использует преимущества более высокой резистентности эндоспор для их отделения от других клеток в сложном микробном сообществе с использованием физических, ферментативных и химических методов лизиса. Полученный таким образом препарат, содержащий только эндоспоры, может быть использован для повторного культивирования или для выполнения последующего анализа, такого как специализированная экстракция ДНК, оптимизированная для эндоспор, и последующее секвенирование ДНК. Этот метод, примененный к образцам отложений, позволил обогатить эндоспоры и после секвенирования выявил большое разнообразие эндоспорообразователей в отложениях пресноводных озер. Мы ожидаем, что применение этого метода к другим образцам даст аналогичный результат.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цель этой работы заключается в обеспечении протокол для разделения бактериальных эндоспор из растительных бактериальных клеток в пробах окружающей среды. Формирование бактериальных эндоспор является стратегией выживания, как правило, вызваны голода, обнаружили в ряде бактериальных групп, принадлежащих к типу Firmicutes 1. Эндоспоровой формирования бактерии хорошо изучены, в основном, потому, что ряд штаммов патогенных микроорганизмов и являются, следовательно, медицинское значение (например, Bacillus сибирской язвы или Clostridium несговорчивый). Экологические штаммы эндоспоровой формирования бактерий были выделены из практически каждый окружающей среды (почвы, воды, донных отложений, воздуха, льда, человек кишки, животные кишки, и более) 1-3. Таким образом, Firmicutes являются вторым наиболее распространенным типа в коллекции культур 4.

Из-за их внешний выносливых коры и защитные основных белков, эндоспоры может выжить в экстремальных условиях окружающей среды, начиная FRом высыхание высокой радиации, экстремальных температур и вредных химических веществ 5. Этот замечательный сопротивление делает его задача, чтобы извлечь ДНК из эндоспор 6-8. Это, вероятно, объясняет, почему они были упущены в окружающей секвенирования исследований 9,10. Другие методы, такие как нацеливание эндоспор в пробах окружающей среды с флуоресцентными антителами 11, количественное определение дипиколиновая кислоты (DPA) в почве 12 и 13 осадка, проточной цитометрии 14 или пастеризации и последующего культивирования 15,16 были использованы для получения или количественного эндоспоры в пробы окружающей среды. В последние годы методы экстракции ДНК оптимизирована, а также конкретные молекулярные праймеров для гена-мишени последовательности эндоспоровой конкретных были разработаны 10,17-20. Это помогло выявить более биоразнообразия среди этой группы бактерий 21 и также привело к приложениям в промышленности и медицине для обнаружения эндоспор, Например, в сухое молоко 19.

Протокол, представленные здесь, основаны на разнице в устойчивость к вредным физико-химических условий (например, температуры и моющих средств) бактериальных эндоспор относительно вегетативных клеток. Чтобы разрушить вегетативные клетки в образце, мы последовательно применяются тепла, лизоцим и низкие концентрации детергентов. Время и сила этих процедур были оптимизированы таким образом, чтобы не разрушить споры, но лизировать все вегетативные клетки. Некоторые клетки в пуле окружающей клеток более устойчивы, чем другие, так что для того, чтобы повысить вероятность разрушения всех вегетативных клеток, мы используем три различных видов лечения. Преимущество и новизна данного способа является то, что эндоспоры после обработки остаются нетронутыми и могут быть использованы для последующих анализов дальнейших. Они включают в себя добычу ДНК, количественное ПЦР (КПЦР) и ампликон или метагеномных последовательности (таргетинг специально группу эндоспор и таким образом уменьшая Diversity, в то время как увеличение охвата). Эндоспоры также могут быть использованы для последующего культивирования или количественного помощью флуоресцентной микроскопии, проточной цитометрии или обнаружение DPA. Важной особенностью данного метода является то, что при сравнении необработанного образца с обработанной пробы, можно сделать вывод, количество и разнообразие эндоспор в окружающей образца в дополнение к компоненту, соответствующую вегетативных клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка химических веществ и оборудования

  1. Сделать 500 мл 1% гексаметафосфат натрия (ШМП) (NaPO 3) н раствора и стерилизовать в автоклаве.
  2. Стерилизовать нитроцеллюлозы (NC) фильтры (размер пор 0,22 мкм, диаметр 47 мм) в автоклаве в закрытой стеклянной чашки Петри.
  3. Стерилизовать ЧПУ фильтры (размер пор 0,22 мкм, диаметр 25 мм) в автоклаве в закрытой стеклянной чашки Петри.
  4. Взвешивание и обратите внимание на вес пустого стерильных 50 мл пробирки (с крышкой) (по одной трубке в образце).
  5. Подготовьте Трис-ЭДТА-буферного (TE-буфера) 1x: сделать раствор 10 мМ Трис (трис (гидроксиметил)) и 1 мМ ЭДТА буфере. Доведения рН до 8 и стерилизовать автоклавированием.
  6. Подготовка раствора лизоцима (20 мг / мл) путем растворения 0,02 г лизоцима в 1 мл ТЕ-буфера. В идеале, сделать свежий каждый раз. Хранить при 4 ° С в течение не более чем 1 недели.
  7. Готовят физиологический раствор путем растворения 8 г / л хлорида натрия(NaCl), в дистиллированной воде. Стерилизовать автоклавированием.

2. Разделение биомассы из осадка

  1. Добавить 3 г образца осадка с предварительно взвешенный стерильной 50 мл трубки, используя этанол-пылал металлические ложки. Выполните это в чистом, УФ стерилизовать кабинета биобезопасности, чтобы избежать загрязнения.
  2. Добавить 15 мл 1% стерильной (автоклавного) SHMP раствора образца, используя стерильный окончил бюретки. Решение ШМП также могут быть отфильтрованы, чтобы избежать загрязнения.
  3. Однородный осадок и раствор SHMP с жидким диспергатор / гомогенизатор (например, Ultra-Turrax гомогенизатор). 70% этанола стерилизовать в автоклаве или дисперсии ротор перед использованием. Запустите гомогенизации в течение 1 мин при 17500 оборотах в минуту. Пусть образец остаток в течение 2 мин и повторить гомогенизации в течение 1 мин при той же скорости вращения ротора.
  4. Оставьте образец в течение 10 мин. На данном этапе, наиболее тяжелые частицы (минералы) будут располагаться. Клетки и любые органические компоненты образца однако жплохо остаются в растворе. Впоследствии, передать надосадочную решение (содержащие клеток биомассы) в чистую пробирку 50 мл, стараясь не потревожить осадок наносов.
  5. Для осадка осадку добавить снова 15 мл 1% стерильной (автоклавного) SHMP решения с использованием стерильной окончил бюретки. Затем повторите шаги 2.3 и 2.4. Это повторение обеспечивает разделение максимального количества клеток и органических частиц из минеральной части осадка. Супернатант этого второго разделения могут быть объединены с супернатантом из первого отделения.
    Примечание: Следующие шаги все сделано на супернатанта (содержащего биомассу клеток). Минеральный компонент (осадка гранул) может быть отброшен.
  6. Центрифуга образца при 20 мкг в течение 1 мин. Этот шаг повышает G-Force достаточно, чтобы решить небольшие минеральные частицы, пока материал биологическая клетка остается в растворе. После центрифугирования надосадочную передать решение (содержащие клеток биомассы) вчистый 50 мл трубки. Откажитесь от минеральной осадок.
  7. Определить конечный объем раствора, содержащего биомассу путем взвешивания образца. Определение веса избавляет от необходимости переноса образца в мерном цилиндре и снижает риск загрязнения.

3. Сбор биомассы на мембранный фильтр

  1. Подготовьте блок фильтрации (47 мм диаметр) мембран и вакуумный насос. Стерилизацию блока фильтрации либо путем автоклавирования или (если стекла пирекс) путем распыления его с 70% -ным этанолом и пламенное его с горелкой Бунзена. Пусть ему остыть, прежде чем продолжить с протоколом.
  2. Добавить стерильной NC мембраны фильтрующей установки с использованием этанола-запылано стерилизованные щипцы.
  3. Добавьте половину надосадочной пробе (со стадии 2.6) на элементе мембранной фильтрации и собирают клетки на мембране с помощью вакуумного насоса.
  4. Когда жидкость полностью проходит через фильтр, выключите вакуумный насос и тщательно удалить мембрану с помощью Итанол пламени стерилизовать пинцетом. Поместите мембрану в стерильную чашку Петри.
    1. Разрежьте пополам мембраны с помощью этанола-пылал стерилизованные ножницы. Добавить каждую половину мембраны в отдельную пробирку 2 мл. Одна половина оболочки будет использоваться для извлечения и анализа всей бактериальной ДНК сообщества. Другая половина фильтра будут сохранены при -80 ° С и служит в качестве резервного.
  5. Поместите новый NC мембрану на фильтровальной установке и собирать биомассу из второй половины объема образца (со стадии 2.6) с использованием вакуумного насоса.
  6. Когда жидкость полностью проходит через фильтр, выключите вакуумный насос и тщательно удалить мембрану с помощью этанола-пылал стерилизованные щипцы. Поместите всю мембрану в отдельную пробирку 2 мл. Этот образец будет использоваться для лечения, чтобы отделить от эндоспоры вегетативных клеток. Образец можно хранить при -20 ° С до использования.

4. Лизис вегетативных клеток

  1. Выполнителечение, чтобы отделить эндоспоры из вегетативных клеток на биомассе собранной ранее на мембране НК (шаг 3.6).
    1. Если мембрана была заморожена, оставить его при комнатной температуре в течение 10 мин, чтобы оттаивания. Затем поместите мембрану в стерильную чашку Петри и разрезать его (примерно в 4 раза) на более мелкие куски при использовании этанола-запылано стерилизованные ножницы. Затем поместите все части мембранного фильтра в стерильную пробирку 2 мл.
  2. Добавить 900 мкл 1x TE (трис-ЭДТА) буфере (см 1.5) в пробирку, содержащую образец мембраны и тщательно перемешать вихря. На этом этапе, биомасса удаляется из мембраны в ТЭ-буферного раствора.
  3. Поместите пробирку в термостат при 65 ° С в течение 10 мин и 80 мин. После удаления трубки из инкубатора и дайте ему остыть в течение 15 мин.
  4. Добавить 100 мкл свежеприготовленного лизоцима (см 1.5), чтобы достичь конечной концентрации 2 мг / мл. Не добавить лизоцим, прежде чем образец остынет до 37 ° С, так как это может градРаде фермент.
  5. Инкубируйте образца при 37 ° С в течение 60 мин и 80 мин, оптимальные условия для лизоцима лизировать вегетативные клетки.
  6. После лизиса завершена, добавить 250 мкл 3 гидроксида натри (NaOH) и 250 мкл 6% додецилсульфата натрия (SDS) раствор к образцу. При добавлении этого, объем образца достигает 1,5 мл и есть конечная концентрация 0,5 N NaOH и конечная концентрация 1% SDS.
  7. Инкубируйте эту смесь при КТ в течение 60 мин и 80 мин. Добавление базы и моющие средства помогут в окончательном лизиса клеток. Концентрация этих моющих средств была оптимизирована, чтобы не повредить эндоспоры, а лизиса вегетативные клетки.
  8. Приготовьте стерильную фильтрацию, которая содержит мембраны диаметром 25 мм в автоклаве, или (если стекла пирекс) распыления 70% этанола и пламенное его с горелкой Бунзена. Пусть ему остыть.
  9. Поставьте NC мембрану 0,2 мкм (диаметр 25 мм) на устройстве с помощью фильтрации этанола пламя стерилизованные щипцы.
  10. Добавить образец с шага 4.7 на мембрану и фильтровать жидкость, используя вакуумный насос. Когда жидкость проходит через, выключите вакуумный насос. На этом этапе лизируют клетки растительный материал удаляется, так как он не удерживается на мембране. Только эндоспоры останется на мембране.
  11. Добавить 2 мл физиологического раствора стерильного, чтобы смыть остатки моющих средств и фильтрации жидкости с помощью вакуумного насоса.
  12. Когда жидкость полностью фильтруется, выключите вакуумный насос. Оставьте мембрану на фильтровальной установке.

5. Лечение ДНКазы

Примечание: Выполнить обработку ДНКазы непосредственно на мембрану фильтра. Важно, что блок фильтрации не протекает, и вакуумный насос выключен.

  1. Добавить 450 мкл стерильной воды, 50 мкл реакционного буфера ДНКазы (1x) и 0,5 мкл ДНКазы фермента непосредственно на мембранный фильтр и оставьте на 15 мин. Если это возможно, сделать это пищеварение в комнате, которая немного войнаMer, чем средний РТ, поскольку фермент работает лучше при температуре 25 ° С и выше.
    Примечание: Ведение горелку в сторону блок фильтрации также увеличивает температуру и имеет дополнительное преимущество по поддержанию окружение стерильной, поэтому снижается риск загрязнения образцов.
  2. Когда ДНКазы пищеварения закончена, включается вакуумный насос, чтобы удалить фермент из образца.
  3. Смыть остаточного фермента путем добавления и фильтрации 1 мл физиологического раствора.
  4. Если жидкость полностью прошло, выключите вакуумный насос и снимите фильтр мембрану, содержащую эндоспоры помощью стерильного пинцета и поместить его в стерильную чашку Петри.
    Примечание: Образец разделенных эндоспор теперь готов к потоку анализа. Хранить при -20 ° C при использовании для выделения ДНК или, альтернативно, при 4 ° С, если используется для прорастания и культивирования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Результаты, представленные здесь, были опубликованы ранее 10,21. Пожалуйста, обратитесь к этим статьям для окружающей среды интерпретации и обсуждении данных.

Вся процедура приводится на рисунке 1 и соответствует три основных этапа: во-первых, разделение биомассы из осадка или любой другой окружающей матрицы; во-вторых, уничтожение растительных клеток; в-третьих, ниже по течению анализ отделенных эндоспор. Вниз по течению анализ может состоять, на...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сопротивление эндоспор до внешних агрессивных факторов (физико-химических, например, температуры или моющие средства) был использован для разработки метода для разделения бактериальных эндоспоры из растительных клеток в пробах окружающей среды. Это первый комплексный метод, чтобы изолировать от окружающей среды эндоспоры образцов в неразрушающего образом. Предыдущие методы количественного, обнаружить или проанализировать эндоспоры в образцах были основаны на измерении конкретных прокси для эндоспор, таких как к...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы признают, Швейцарский национальный научный фонд для грант № 31003A-132358/1, 31003A_152972 и № 151948, и Fundation Пьер Мерсье залить ла науки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Ватман нитроцеллюлозные мембранные фильтры, 0.2 μ м размер пор, диаметр 47 ммSigma-AldrichWHA7182004 Aldrich 
Трис(гидроксиметил)аминометанСигма-Олдрич252859 Сигма-ОлдричCAS 77-86-1
ЭДТАСигма-ОлдричE9884 Сигма-ОлдричCAS  60-00-4 
Лизоцим из белка куриного яйцаSigma-Aldrich62971 порошок Fluka, CAS  12650-88-3 
Гомогенизатор Ultra-Turrax T18 basicIKA3720000
Стеклянные фильтродержатели для 47  мм мембраны, стекло Pyrex EMDMilliporeXX10 047 00
Химический насос для работы вакуумный насосMilliporeWP6122050220 В/50
Гц Фильтрация отбора проб в коллекторе для 25  мм мембраныMillipore1225 Пробоотборный коллекторполипропилен
DnaseNew England BiolabsM0303SRnase free
NaOHSigma-AldrichS5881 Sigma-AldrichCAS  1310-73-2 
Додецилсульфат натрия (SDS)Sigma-AldrichL3771 Sigma 
Ватман нитроцеллюлозные мембранные фильтры, 0.2 μ м размер пор, диаметр 25 ммSigma-AldrichWHA7182002 Aldrich

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nicholson, W. L. Roles of Bacillus endospores in the environment. Cell Mol Life Sci. 59 (3), 410-416 (2002).
  2. Lester, E. D., Satomi, M., Ponce, A. Microflora of extreme arid Atacama Desert soils. Soil Biol Biochem. 39 (2), 704-708 (2007).
  3. Wilson, M. S., Siering, P. L., White, C. L., Hauser, M. E., Bartles, A. N. Novel archaea and bacteria dominate stable microbial communities in North America's Largest Hot Spring. Microb Ecol. 56 (2), 292-305 (2008).
  4. Hugenholtz, P. Exploring prokaryotic diversity in the genomic era. Genome Biol. 3 (2), (2002).
  5. Onyenwoke, R. U., Brill, J. A., Farahi, K., Wiegel, J. Sporulation genes in members of the low G+C Gram-type-positive phylogenetic branch (Firmicutes). Arch Microbiol. 182 (2-3), 182-192 (2004).
  6. Delmont, T. O., et al. Accessing the soil metagenome for studies of microbial diversity. Appl Environ Microbiol. 77 (4), 1315-1324 (2011).
  7. Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. Bacterial spore formers: probiotics and emerging applications. , Horizon Bioscience. (2004).
  8. Kuske, C. R., et al. Small-Scale DNA Sample Preparation Method for Field PCR Detection of Microbial Cells and Spores in Soil. Appl Environ Microbiol. 64 (7), 2463-2472 (1998).
  9. von Mering, C., et al. Quantitative phylogenetic assessment of microbial communities in diverse environments. Science. 315 (8515), 1126-1130 (2007).
  10. Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. Stage 0 sporulation gene A as a molecular marker to study diversity of endospore-forming Firmicutes. Environ Microbiol Rep. 5 (6), 911-924 (2013).
  11. Siala, A., Hill, I. R., Gray, T. R. G. Populations of spore-forming bacteria in an acid forest soil, with special reference to Bacillus subtilis. J General Microbiol. 81 (1), 183-190 (1974).
  12. Brandes Ammann, A., Kolle, L., Brandl, H. Detection of bacterial endospores in soil by terbium fluorescence. Int J Microbiol. , 435281(2011).
  13. Fichtel, J., Koster, J., Rullkotter, J., Saas, H. High variations in endospore numbers within tidal flat sediments revealed by quantification of dipicolinic acid. Geomicrobiol J. 25 (7-8), (2008).
  14. Cronin, U. P., Wilkinson, M. G. The potential of flow cytometry in the study of Bacillus cereus. J Appl Microbiol. 108 (1), 1-16 (2010).
  15. de Rezende, J. R., et al. Dispersal of thermophilic Desulfotomaculum endospores into Baltic Sea sediments over thousands of years. ISME J. 7 (1), 72-84 (2013).
  16. Hubert, C., et al. Thermophilic anaerobes in Arctic marine sediments induced to mineralize complex organic matter at high temperature. Environ Microbiol. 12 (4), 1089-1104 (2010).
  17. Garbeva, P., van Veen, J. A., van Elsas, J. D. Predominant Bacillus spp. in agricultural soil under different management regimes detected via PCR-DGGE. Microb Ecol. 45 (3), 302-316 (2003).
  18. Brill, J. A., Wiegel, J. Differentiation between spore-forming and asporogenic bacteria using a PCR and southern hybridization based method. J Microbiol Methods. 31 (1-2), 29-36 (1997).
  19. Rueckert, A., Ronimus, R. S., Morgan, H. W. Development of a real-time PCR assay targeting the sporulation gene, spo0A., for the enumeration of thermophilic bacilli in milk powder. Food Microbiol. 23 (3), 220-230 (2006).
  20. Bueche, M., et al. Quantification of endospore-forming firmicutes by quantitative PCR with the functional gene spo0A. Appl Environ Microbiol. 79 (17), 5302-5312 (2013).
  21. Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. Endospore-enriched sequencing approach reveals unprecedented diversity of Firmicutes in sediments. Environ Microbiol Rep. 6 (6), 631-639 (2014).
  22. Nicholson, W. L., Law, J. F. Method for purification of bacterial endospores from soils: UV resistance of natural Sonoran desert soil populations of Bacillus spp. with reference to B. subtilis strain 168. J Microbiol Methods. 35 (1), 13-21 (1999).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

SDSFirmicutes

Похожие статьи