Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Мышиные Кожные фибробластов Изоляция FACS

21.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53430

⸱

7 января 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine, Department of Surgery, Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Stanford University School of Medicine, 2Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Surgery, John A. Burns School of Medicine, University of Hawai'i

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Поведение фибробластов лежит в основе спектра клинических сущностей, но они остаются плохо охарактеризованными, в основном из-за присущей им гетерогенности. Традиционные исследования фибробластов основаны на манипуляциях in vitro, маскирующих поведение фибробластов in vivo. Мы описываем протокол на основе FACS для выделения фибробластов кожи мыши, который не требует культивирования клеток.

Аннотация

Фибробласты принцип тип клеток отвечает за секретирующие внеклеточный матрикс и являются важным компонентом многих органов и тканей. Фибробластов физиологии и патологии лежат спектр клинических лиц, в том фиброзов в различных органах, гипертрофических рубцов следующих ожогов, потери сердечной функции после ишемии, и формирование рака стромы. Тем не менее, фибробласты остаются плохо охарактеризованы тип клеток, в основном из-за присущей им неоднородности. Существующие методы выделения фибробластов требует времени в культуре клеток, что глубоко влияет клеток фенотип и поведение. Следовательно, многие исследования следственные фибробластов биологии полагаться на манипуляции в пробирке и не точно запечатлеть поведение фибробластов в естественных условиях. Чтобы преодолеть эту проблему, мы разработали протокол FACS основе для изоляции фибробластов из спинной кожи взрослых мышей, которые не требуют культуры клеток, тем самым preserviнг физиологическую транскрипции и протеомный профиль каждой ячейки. Наша стратегия позволяет исключения, не мезенхимальных линий через клонов отрицательной ворот (Лин -), а не позитивной стратегии выбора, чтобы избежать предварительного отбора или обогащения субпопуляции фибробластов выражения конкретных поверхностных маркеров и быть как можно более через это гетерогенная тип клеток.

Введение

Фибробласты часто определяется морфологически веретенообразных клеток, которые придерживаются пластиковых подложках. Фибробласты принцип тип клеток отвечает за синтез и реконструкции внеклеточного матрикса в эмбриональных и взрослых органов 1. Фибробласты, таким образом, решающее значение для развития млекопитающих и вносят существенный вклад в внеклеточной среде, которая влияет на поведение соседних типов клеток, присутствующих в каждой ткани и органа.

Фибробласты также основной тип клеток за разнообразный набор медицинских условий, которые вызывают огромный клинический бремя. Патологические активности фибробластов ухудшает нормальную функцию ткани и включает в себя тканей и органов фиброз (например, легких и печени), рубцевание следующую кожного заживления ран, атеросклероз, системный склероз, и формирование атероматозных бляшек после травмы сосудов 2-5. Заживление ран, в частности, как остро и хронически, включает Deposition рубцовой ткани, что ни походит ни функционирует подобно нормальной ткани, окружающей его, и приводит к значительной заболеваемости в самых разнообразных патологических состояниях. После травмы, происходит переход фибробластов в миофибробластами, который затем выделяют структурные компоненты ECM, оказывают воздействие на паракринные соседних типов клеток, и восстановить механическую стабильность путем осаждения рубцовой ткани 6.

В кожных тканей существует значительное изменение в качество заживления ран через время развития, а также между анатомических участков. В первых двух триместров жизни плод лечит без рубцов; Однако, начиная с третьего триместра на протяжении взрослой жизни и, люди исцелить со шрамом. Сайт-специфическая, в дополнение к возрасту конкретного различия в заживлении ран существует. Раны в ротовой полости переделывать с минимальным образованием рубцов 7,8, в то время как осаждение рубцовой ткани в кожных ран значительным 9. Споры сохраняется грoncerning относительное влияние окружающей среды по сравнению с внутренними свойствами местных фибробластов на исход заживления ран в отношении как возраст и место 10,11. Учитывая значительные различия в исцелении мыши устной против кожных дермы и ранее эмбриональных (E15) против позже эмбриональных (E18) дермы, вполне вероятно, что внутренние различия в популяциях фибробластов в определенном возрасте развития и среди различных анатомических существует ,

В 1986 году Гарольд Ф. Дворжак положено опухоли раны, которые не заживают 12. Dvorak к выводу, что опухоли ведут себя как раны в организме и вызывают их стромы путем активации заживления раны ответ хозяина. Многочисленные исследования, так как исследовали вклад фибробластов к прогрессированию рака 13-15, но как и в случае заживления раны, идентичности и эмбрионального происхождения фибробластов, которые способствуют стромы отсеке кожного CArcinomas не были должным образом определены. Ответ на этот вопрос носит медицинскую значимость данной недавние исследования, разоблачающие опухолеассоциированные фибробластов как потенциально эффективного мишени для противораковой терапии 16.

Выявление и перспективно изоляции фибробластов клоны наделены фиброгенной потенциала в естественных условиях является важным шагом на пути к эффективной манипуляции их ответ на повреждение в широком диапазоне острых и хронических болезненных состояний. В 1987 году Кормак продемонстрировал два субпопуляции фибробластов, один проживающий в папиллярного и один в ретикулярной дермы 17,18. Третий субпопуляции был найден, связанные с волосяных фолликулов в волосяной сосочек области фолликула 19,20. При культивировании, эти различия фибробластов подтипы проявляют в потенциал роста, морфологии и факторов роста / цитокинов анкеты 21-24.

На сегодняшний день, исследования по изучению фибробластов онterogeneity в значительной степени удалось адекватно характеризуют развития и функционального разнообразия среди фибробластов в естественных условиях. Это, в частности, является результатом зависимости от культивируемых популяций фибробластов и гомогенизации эффекта клеточной культуре или позитивной селекции на основе поверхностного рецептора себя не экспрессируется всеми фибробластов 25. Недавнее исследование, из нашей лаборатории показали глубокое поверхностный маркер и транскрипции сдвиг в культуре фибробластов против некультурных изолированных на FACS на основе методологии, представленной в изоляции этой рукописи 26.

Впоследствии, мы определили конкретный фибробластов происхождение в пределах мышиных спинных дермы и решил, что это линия, определяется эмбриональной экспрессии Engrailed-1, в первую очередь отвечает за отложение соединительной ткани в коже спинной. Линии функции при острых и хронических форм фиброза в том числе заживление ран, образование стромы рака, иизлучение фиброз 27. Характеристика различных фибробластов линий имеет критические последствия для лечения, направленных на модуляции фиброгенную поведение.

Вместо того чтобы использовать существующие протоколы, которые полагаются на манипуляции в пробирке для достижения изоляции клеток 28,29, протокол урожай (Рисунок 1) подробно здесь, поможет урожая информативные анализы фибробластов, которые более точно захватить фенотип и поведение в естественных условиях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол следует методике, утвержденной Административным панели Стэнфордского университета на лабораторных животных.

1. Пищеварение мышиных дермы

  1. Эвтаназии мышей путем смещени шейных позвонков после анестезии путем внутрибрюшинной инъекции кетамина 100 мг / кг + ксилазина 20 мг / кг + Ацепромазин 3 мг / кг.
    Примечание: Различные возрастов и профессий могут быть использованы.
  2. Бритье и удалять волосы кожу спинной. Приблизительно 100000 клеток могут быть выделены из куска кожи спинного 60 мм х 100 мм.
  3. Погрузите мышь в 70% этанола и место на чистой, стерильной поверхности, чтобы высохнуть.
  4. Сразу урожай кожу спинной мыши с помощью стерильных ножниц рассекает. В самок мышей, в том числе избежать в ткани молочной железы.
  5. Запуск основания хвоста, использовать пинцет, чтобы палатку кожу и сделать поперечный разрез, прежде чем рассекает по сверх-фасциальных плоскости.
  6. Тщательно избежать любого в том числе подкожного жира при уборкекожа. Осмотрите собранный кожу для любого подкожного жира и тщательно очистить его с помощью тупого края скальпелем.
  7. Промыть кожу заготовленной в бетадином последующим 5x PBS моет на льду.
    Примечание: Важно, чтобы сохранить кожу как можно ближе к стерильным, как это возможно, чтобы избежать загрязнения.
  8. Фарш кожу с помощью лезвия и анатомические ножницы в стерильную чашку, пока образец не имеет однородной консистенции с 2-3 мм кусочки.
  9. Подготовка 50 мл конические пробирки, содержащие 20 мл коллагеназы IV при концентрации 1 мг / мл в DMEM. Разделить дермы в трубы на основе пяти мышей в трубке.
  10. Перемешивают энергично образцы, а инкубацию при 37 ° С в течение 1 ч в любом водяной бане или печи.
  11. Удалить образцы из инкубатора и проходят через 10 мл шприца без иглы 3-5x в стерильной крышкой.
  12. Поместите образцы обратно в инкубатор при 37 ° С и энергично встряхивают в течение еще 30 мин.
  13. В стерильных капот, Пипетки образцы вверх и вниз с помощью 3-5x 10 мл пипетки. Пипетировать образца через 100 мкм фильтр в новую 50 мл коническую пробирку.
  14. Проход 20 мл 10% FBS среде DMEM через тот же фильтр, чтобы максимизировать выход клеток и довести общий объем до 40 мл. Центрифуга при 300 г в течение 8 мин при 4 ° С.
  15. Удалить супернатант, используя стерильный стеклянную пипетку, принимая большую заботу, чтобы сначала удалить верхний слой жира до оставшихся супернатант.
    Примечание: Этот шаг имеет решающее значение для снижения загрязнения адипоцитов.
  16. Ресуспендируют гранул в 20 мл 10% FBS DMEM.
  17. Пропускают клеток / DMEM суспензии через фильтр 70 мкм.
  18. Промыть фильтр 10 мл 10% FBS среде DMEM и центрифуги отфильтрованный суспензии при 300 г в течение 8 мин при 4 ° С.
  19. Удалить супернатант, используя стерильный стеклянную пипетку, снова заботиться в первую очередь удалите оставшуюся жировой слой.
  20. Если существует значительный загрязнение эритроцитов (а осадок заметно красное), повторно приостанавливать гранулыв 20 мл буфера для лизиса АСК и инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре. В противном случае перейдите к шагу 24.
  21. Добавить равный объем (20 мл) FACS буфера (PBS, 10% FBS, 0,1% азида натрия), затем смешать и держать в стороне 5 мл аликвоту в качестве неокрашенных контроля. Центрифуга оставшуюся образца при 300 г в течение 8 мин при 4 ° С.
  22. Удалить супернатант и поставить шарик на льду. Клетки могут быть заморожены вниз на этом этапе, если FACS время не доступно.

2. Выделение фибробластов по FACS

  1. Сделайте 500 мкл антител линия инкубации смеси для каждого таблетки. Для этого сначала добавлением 475 мкл FACS буфера, содержащего ДНКазы (10 мкг / мл) в пробирку, а затем добавить флуорофора-сопряженных CD31 (1: 100), CD45 (1: 200), Tie-2 (1:50), трет -119 (1: 200), и EpCam (1: 100) антитела, чтобы достичь соответствующего разведения для каждого антитела.
  2. Повторное приостановить осадок в каждой 500 мкл инкубационного линия антител смеси и инкубируют эту подвеску на льду в течение 20 мин.
  3. Добавить 5мл FACS буфера, содержащего ДНКазы (10 мкг / мл) к образцу и осторожно перемешать. Центрифуга при 300 г в течение 8 мин при 4 ° С.
  4. Удалить супернатант и мыть осадок клеток 5 мл FACS с буфером, содержащим ДНКазы (10 мкг / мл) и центрифугируют при тех же условиях, что и в шаге 26.
  5. Ресуспендируют гранул в 500 мкл FACS буфера, содержащего ДНКазы (10 мкг / мл) и отложить в сторону 50 мкл аликвоты в качестве контроля жизнеспособности красителя.
  6. Добавить жизнеспособность красителя выбора для оставшейся выборки в концентрации, указанной для выбранного красителя.
  7. Выполните FACS анализ 31 и сортировки для жизнеспособности Dye- / CD31- / CD45- / Tie2- / Тер-119- / EpCAM- клеток (рис 2А). Сортировать прямо в FACS буфера.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Справедливость такого подхода (рис 1) была проверена в ряде способов, которые могут быть рассмотрены подробно в нашей недавней публикации 27. Они включают в себя иммуноцитохимии отсортированных клеток и общей камере и одной клеточной транскрипции анализа отсортированный клеток. Сортировка фибробласты напрямую, а не полагаться на культуру более точно отражает фенотип их в естественных условиях. Использование клонов негативный подход истощения (рис 2А), а не позитивный подход избегает выбо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Протокол, описанный в этой рукописи предлагает средства, чтобы изолировать от фибробластов FACS-сортировки на основе, по сравнению с существующими методами, которые либо выбрать для субпопуляции или требуют времени в культуре клеток, прежде чем последующих анализов. Время, необходимое от уборки кожи сортировке фибробластов составляет примерно 6 ч; Тем не менее, количество мышей использовали в урожай будет влиять эту оценку.

Несколько точек в протоколе требуют особого ухода. Первый ограничива...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана грантом NIH грант R01 GM087609 (до HPL), подарок от Ингрид Лай и Билл Шу в честь Энтони Шу (в HPL), NIH грант U01 HL099776 (к MTL), в Hagey лаборатории Детская регенеративной медицины и Дуб Фонд (для MTL, GCG и HPL). GGW поддержали Стэнфордской школы медицины, программы обучения Стэнфордского медицинского ученого, и NIGMS субсидия на обучение GM07365. Znm при поддержке Фонда пластической хирургии исследовательский грант Грант и Семейный фонд Hagey. MSH при поддержке Калифорнийского института регенеративной медицины (CIRM) Клиническая сотрудник учебного пособия TG2-01159, Американского общества челюстно-лицевых хирургов (ASMS) / челюстно-лицевых хирургов Foundation (MSF) исследований выдаче гранта, и трансплантации и тканевой инженерии стипендий премии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Хирургические щипцыKent ScientificINS650916
микроножницыKent ScientificINS600127
раствор для приготовления йода Povidone Iodine PrepDynarex1415
Nair (крем для депиляции)Church and Dwight Co.
Коллагеназа IVGibco17104-019
ЭластазаAbcamab95133
DMEMLife TechnologiesA14430-01
Фетальная сыворотка крупного рогатого скотаGibco16000-044
Аммоний-хлорид-калий (ACK) лизирующий буферGibcoA10492-01
40 μ m фильтрыFisher Scientific08-771-1
70 μ m фильтрыFisher Scientific08-771-2
100 μ m фильтрыFisher Scientific08-771-19
CD31BioLegend102421
CD45BioLegend103125
Tie2BioLegend124005
Ter-119BioLegend116233
EpCAM (CD326)eBioscience48-5791
DAPIInvitrogenD3571
йодид пропидида (окрашивание жизнеспособности PI)BioLegend421301
22600267058

Ссылки

  1. Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblasts-a diverse population at the center of it all. International review of cell and molecular biology. 276, 161-214 (2009).
  2. Wynn, T. A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. The Journal of pathology. 214, 199-210 (2008).
  3. Powell, D. W., et al. Myofibroblasts. I. Paracrine cells important in health and disease. The American journal of physiology. 277, C1-C9 (1999).
  4. Wilson, M. S., Wynn, T. A. Pulmonary fibrosis: pathogenesis, etiology and regulation. Mucosal immunology. 2, 103-121 (2009).
  5. Hinz, B., et al. The myofibroblast: one function, multiple origins. The American journal of pathology. 170, 1807-1816 (2007).
  6. Li, B., Wang, J. H. Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing: force generation and measurement. J Tissue Viability. 20, 108-120 (2011).
  7. Wong, J. W., et al. Wound healing in oral mucosa results in reduced scar formation as compared with skin: evidence from the red Duroc pig model and humans. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 17, 717-729 (2009).
  8. Szpaderska, A. M., Zuckerman, J. D., DiPietro, L. A. Differential injury responses in oral mucosal and cutaneous wounds. Journal of dental research. 82, 621-626 (2003).
  9. Hantash, B. M., Zhao, L., Knowles, J. A., Lorenz, H. P. Adult and fetal wound healing. Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. 13, 51-61 (2008).
  10. Buchanan, E. P., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Fetal skin wound healing. Advances in clinical chemistry. 48, 137-161 (2009).
  11. Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
  12. Dvorak, H. F. Tumors: wounds that do not heal. Similarities between tumor stroma generation and wound healing. The New England journal of medicine. 315, 1650-1659 (1986).
  13. Dumont, N., et al. Breast fibroblasts modulate early dissemination, tumorigenesis, and metastasis through alteration of extracellular matrix characteristics. Neoplasia. 15, 249-262 (2013).
  14. Servais, C., Erez, N. From sentinel cells to inflammatory culprits: cancer-associated fibroblasts in tumour-related inflammation. The Journal of pathology. 229, 198-207 (2013).
  15. Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell cycle. 5, 1597-1601 (2006).
  16. Li, X., et al. Targeting the cancer-stroma interaction: a potential approach for pancreatic cancer treatment. Current pharmaceutical design. 18, 2404-2415 (2012).
  17. Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblast heterogeneity: more than skin deep. Journal of cell science. 117, 667-675 (2004).
  18. Cormack, D. H. Ham's Histology. , J.B. Lippincott Company. 450-474 (1987).
  19. Jahoda, C. A., Reynolds, A. J. Dermal-epidermal interactions. Adult follicle-derived cell populations and hair growth. Dermatologic clinics. 14, 573-583 (1996).
  20. Jahoda, C. A., Reynolds, A. J. Hair follicle dermal sheath cells: unsung participants in wound healing. Lancet. 358, 1445-1448 (2001).
  21. Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Construction of a bilayered dermal equivalent containing human papillary and reticular dermal fibroblasts: use of fluorescent vital dyes. Tissue engineering. 2, 39-49 (1996).
  22. Harper, R. A., Grove, G. Human skin fibroblasts derived from papillary and reticular dermis: differences in growth potential in vitro. Science. 204, 526-527 (1979).
  23. Schafer, I. A., Pandy, M., Ferguson, R., Davis, B. R. Comparative observation of fibroblasts derived from the papillary and reticular dermis of infants and adults: growth kinetics, packing density at confluence and surface morphology. Mechanisms of ageing and development. 31, 275-293 (1985).
  24. Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Site-matched papillary and reticular human dermal fibroblasts differ in their release of specific growth factors/cytokines and in their interaction with keratinocytes. Journal of cellular physiology. 200, 134-145 (2004).
  25. Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of visualized experiments : JoVE. , e4425(2013).
  26. Walmsley, G. G., et al. Live Fibroblast Harvest Reveals Surface Marker Shift in vitro. Tissue engineering. Part C, Methods. , (2014).
  27. Rinkevich, Y., Walmsley, G. G., Hu, M. S., Maan, Z. N., Newman, A. M., Drukker, M., Januszyk, M., Krampitz, G. W., Gurtner, G. C., Lorenz, H. P., Weissman, I. L., Longaker, M. T. Identification and Isolation of a Dermal Lineage with Intrinsic Fibrogenic Potential. Science. , (2015).
  28. Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. J Vis Exp. , (2010).
  29. Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature protocols. 3, 799-810 (2008).
  30. Klein, M., Fitzgerald, L. R. Enzymatic separation of intact epidermal sheets from mouse skin. The Journal of investigative dermatology. 39, 111-114 (1962).
  31. Biburger, M., Trenkwald, I., Nimmerjahn, F. yThree blocks are not enough - Blocking of the murine IgG receptor FcgammaRIV is crucial for proper characterization of cells by FACS analysis. European journal of immunology. , (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

FACSlineage
Мышиные Кожные фибробластов Изоляция FACS
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.