Поведение фибробластов лежит в основе спектра клинических сущностей, но они остаются плохо охарактеризованными, в основном из-за присущей им гетерогенности. Традиционные исследования фибробластов основаны на манипуляциях in vitro, маскирующих поведение фибробластов in vivo. Мы описываем протокол на основе FACS для выделения фибробластов кожи мыши, который не требует культивирования клеток.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Мышиные Кожные фибробластов Изоляция FACS
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Фибробласты принцип тип клеток отвечает за секретирующие внеклеточный матрикс и являются важным компонентом многих органов и тканей. Фибробластов физиологии и патологии лежат спектр клинических лиц, в том фиброзов в различных органах, гипертрофических рубцов следующих ожогов, потери сердечной функции после ишемии, и формирование рака стромы. Тем не менее, фибробласты остаются плохо охарактеризованы тип клеток, в основном из-за присущей им неоднородности. Существующие методы выделения фибробластов требует времени в культуре клеток, что глубоко влияет клеток фенотип и поведение. Следовательно, многие исследования следственные фибробластов биологии полагаться на манипуляции в пробирке и не точно запечатлеть поведение фибробластов в естественных условиях. Чтобы преодолеть эту проблему, мы разработали протокол FACS основе для изоляции фибробластов из спинной кожи взрослых мышей, которые не требуют культуры клеток, тем самым preserviнг физиологическую транскрипции и протеомный профиль каждой ячейки. Наша стратегия позволяет исключения, не мезенхимальных линий через клонов отрицательной ворот (Лин -), а не позитивной стратегии выбора, чтобы избежать предварительного отбора или обогащения субпопуляции фибробластов выражения конкретных поверхностных маркеров и быть как можно более через это гетерогенная тип клеток.
Введение
Фибробласты часто определяется морфологически веретенообразных клеток, которые придерживаются пластиковых подложках. Фибробласты принцип тип клеток отвечает за синтез и реконструкции внеклеточного матрикса в эмбриональных и взрослых органов 1. Фибробласты, таким образом, решающее значение для развития млекопитающих и вносят существенный вклад в внеклеточной среде, которая влияет на поведение соседних типов клеток, присутствующих в каждой ткани и органа.
Фибробласты также основной тип клеток за разнообразный набор медицинских условий, которые вызывают огромный клинический бремя. Патологические активности фибробластов ухудшает но....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Этот протокол следует методике, утвержденной Административным панели Стэнфордского университета на лабораторных животных.
1. Пищеварение мышиных дермы
- Эвтаназии мышей путем смещени шейных позвонков после анестезии путем внутрибрюшинной инъекции кетамина 100 мг / кг + ксилазина 20 мг / кг + Ацепромазин 3 мг / кг.
Примечание: Различные возрастов и профессий могут быть использованы. - Бритье и удалять волосы кожу спинной. Приблизительно 100000 клеток могут быть выделены из куска кожи спинного 60 мм х 100 мм.
- Погрузите мышь в 70% этанола и место на чистой, стерильной поверхности, чтобы высохнуть.
- ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Справедливость такого подхода (рис 1) была проверена в ряде способов, которые могут быть рассмотрены подробно в нашей недавней публикации 27. Они включают в себя иммуноцитохимии отсортированных клеток и общей камере и одной клеточной транскрипции анализа отсортированный клеток. Сортировка фибробласты напрямую, а не полагаться на культуру более точно отражает фенотип их в естественных условиях. Использование клонов негативный подход истощения (рис 2А), а не позитивный подход избегает выбо.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Протокол, описанный в этой рукописи предлагает средства, чтобы изолировать от фибробластов FACS-сортировки на основе, по сравнению с существующими методами, которые либо выбрать для субпопуляции или требуют времени в культуре клеток, прежде чем последующих анализов. Время, необходимое от уборки кожи сортировке фибробластов составляет примерно 6 ч; Тем не менее, количество мышей использовали в урожай будет влиять эту оценку.
Несколько точек в протоколе требуют особого ухода. Первый ограничива.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была частично поддержана грантом NIH грант R01 GM087609 (до HPL), подарок от Ингрид Лай и Билл Шу в честь Энтони Шу (в HPL), NIH грант U01 HL099776 (к MTL), в Hagey лаборатории Детская регенеративной медицины и Дуб Фонд (для MTL, GCG и HPL). GGW поддержали Стэнфордской школы медицины, программы обучения Стэнфордского медицинского ученого, и NIGMS субсидия на обучение GM07365. Znm при поддержке Фонда пластической хирургии исследовательский грант Грант и Семейный фонд Hagey. MSH при поддержке Калифорнийского института регенеративной медицины (CIRM) Клиническая сотрудник учебного пособия TG2-01159, Американского общества челюстно-лицевых хирургов (ASMS) / челюстно-лицевых хирурго....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Хирургические щипцы | Kent Scientific | INS650916 | |
| микроножницы | Kent Scientific | INS600127 | |
| раствор для приготовления йода Povidone Iodine Prep | Dynarex | 1415 | |
| Nair (крем для депиляции) | Church and Dwight Co. | ||
| Коллагеназа IV | Gibco | 17104-019 | |
| Эластаза | Abcam | ab95133 | |
| DMEM | Life Technologies | A14430-01 | |
| Фетальная сыворотка крупного рогатого скота | Gibco | 16000-044 | |
| Аммоний-хлорид-калий (ACK) лизирующий буфер | Gibco | A10492-01 | |
| 40 μ m фильтры | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 70 μ m фильтры | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| 100 μ m фильтры | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CD31 | BioLegend | 102421 | |
| CD45 | BioLegend | 103125 | |
| Tie2 | BioLegend | 124005 | |
| Ter-119 | BioLegend | 116233 | |
| EpCAM (CD326) | eBioscience | 48-5791 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| йодид пропидида (окрашивание жизнеспособности PI) | BioLegend | 421301 |
Ссылки
- Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblasts-a diverse population at the center of it all. International review of cell and molecular biology. 276, 161-214 (2009).
- Wynn, T. A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. The Journal of pathology.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
