Method Article

Строительство Defined человека Engineered сердечной ткани для изучения механизмов сердечной терапии клеток

DOI:

10.3791/53447

⸱

March 1st, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cardiovascular Research Center, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2The Mindich Child Health and Development Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Stem Cell & Regenerative Medicine Consortium, LKS Faculty of Medicine, University of Hong Kong

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой рукописи описывается создание определенных инженерных тканей сердца с использованием экспрессии поверхностных маркеров и сортировки клеток. Затем определенные ткани могут быть использованы в многотканевом биореакторе для исследования механизмов терапии сердечными клетками с целью создания функциональной, но контролируемой модельной системы человеческого сердца.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Инженерия сердечной ткани человека может фундаментально повлиять на терапевтические открытия за счет разработки новых видоспецифичных скрининговых систем, которые воспроизводят биоточность трехмерного нативного миокарда человека, в то же время обеспечивая контролируемый уровень биологической сложности и позволяя проводить неразрушающий продольный мониторинг сократительной функции тканей. Первоначально человеческие инженерные сердечные ткани (ЭСТ) были созданы с использованием всей клеточной популяции, полученной в результате направленной дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток человека, которые обычно давали менее 50% кардиомиоцитов. Однако для создания надежных прогностических моделей миокарда человека и выяснения механизмов гетероклеточного взаимодействия необходимо точно контролировать биологический состав в сконструированных тканях.

Чтобы устранить это ограничение, мы используем сортировку живых клеток для маркера сердечной поверхности SIRPα и маркера фибробластов CD90 для создания тканей, содержащих соотношение этих типов клеток 3:1 соответственно, которые затем смешиваются вместе и добавляются в матричный раствор на основе коллагена. Таким образом, полученные ГЭКТ полностью определяются как по составу клеточного, так и по внеклеточному матриксу.

Здесь мы описываем построение определенных hECTs в качестве модельной системы для понимания механизмов межклеточных взаимодействий в клеточной терапии, используя пример мезенхимальных стволовых клеток (hMSC), полученных из костного мозга человека, которые в настоящее время используются в клинических испытаниях на людях. Определенный состав тканей необходим для понимания того, как МСК могут взаимодействовать с эндогенными типами сердечных клеток для улучшения функции тканей. Также описана система биореактора, которая одновременно культивирует шесть ГЭКТ параллельно, что позволяет более эффективно использовать клетки после сортировки.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Инженерные ткани сердца значительно продвинулся вперед в последнее десятилетие, с несколькими группами , публикующих результаты полностью функциональных, избивая тканей , изготовленных из обеих мышиных кардиомиоцитов 1-6 и, совсем недавно, стволовых клеток , полученных из человеческих кардиомиоцитов 7-12. Тканевой инженерии поле сердца приводится в движение двумя первичными и , по существу независимых целей: 1) разработать экзогенные трансплантаты , которые могут быть пересажены в отсутствии сердца , чтобы улучшить функцию 4-6; и 2) разработать в моделях пробирке для изучения физиологии и болезни, или как инструменты скрининга для терапевтического развития 2,7.

Трехмерная (3-D) для культивирования клеток считается необходимым для разработки скрининговых инструментов нового поколения, так как 3-D матрица отражает более естественный сердечный микросреду, чем традиционная 2-D культуре клеток монослоя; на самом деле некоторые аспекты клеточной биологии существенно отличаются в 2-D по сравнению с 3-D культур 13,14 . Кроме того, сконструированные сердечной ткани изготовлены из полностью определенных компонентов: внеклеточного матрикса и клеточной популяции. Для традиционных сконструированных сердечной ткани человека, в то время как внеклеточный состав матрицы (обычно фибрин 9 или коллаген 7,8,10) строго контролируется, состав входной ячейки менее выражены, со всей смеси клеток из организма, направленной сердечной дифференциации либо эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) или 7,9 индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (IPSC 10,12) добавляется к тканям. В зависимости от конкретной клеточной линии и эффективности протокола дифференцировки , используемой, в результате процент кардиомиоцитов может находиться в диапазоне от менее 25% до более чем 90%, специфический для кардиомиоцитов фенотип (т.е. ventricular-, atrial-, или водитель ритма типа) может также варьироваться, даже не-кардиомиоциты фракция может быть весьма неоднородны 15,16 и изменять зрелость дифференцированного сердца мyocytes 17.

Последние тканевой инженерии работы сердца была предпринята попытка контролировать входную популяцию клеток, либо с сердечным репортер человеческих эмбриональных стволовых клеток линии 8 или маркеров клеточной поверхности 18 используется для изоляции сердца миоцитов компонент дифференциации. Хотя первоначально ткань состоит только из кардиомиоцитов, казалось бы идеальным, это на самом деле не так; hECTs , состоящие только из кардиомиоцитов не уплотнять в функциональные ткани, при этом некоторые группы найти соотношение 3: 1 кардиомиоцитов: фибробласты , продуцирующие самую высокую дергаться силу 8. Используя различные методы отбора клеток, в том числе поверхностных маркеров для сортировки живых клеток, то можно создать hECTs с определенными клеточными популяциями. В то время как маркеры несердечных стромальных клеток были доступны в течение некоторого времени, например, предположительной фибробластами маркера CD90 19,20, поверхностных маркеров кардиомиоцитов было труднееидентифицировать. SIRPα была среди первых сердечных поверхностных маркеров , идентифицированных для кардиомиоцитов человека 18 , и было показано, что высоко селективным для сердечной линии. В последнее время мы обнаружили , что двойные сортировки для SIRPα + и CD90 - клеток дает почти чистый кардиомиоциты, с CD90 + популяции , проявляющего фибробласта-фенотип (Josowitz, неопубликованные наблюдения). На основе этих собранных результатов, в настоящем документе мы описываем создание hECTs с использованием 3: 1 из комбинации SIRPα + / CD90 - кардиомиоциты и CD90 + фибробласты.

Способность спроектировать полностью определенную сердечную ткань человека имеет важное значение не только для создания надежных инструментов скрининга, но и для разработки модельных систем для изучения возникающих сотовом и генные на основе сердечной терапии. В частности, многочисленные методы лечения клеточных по поводу сердечной недостаточности, с использованием типов клеток , включая мезенхимальных стволовых клеток (МСК) 21 , сердечные стволовые клетки 22 и костного мозга мононуклеары 23-25 ​​были протестированы в клинических испытаниях. В то время как многие из первоначальных результатов были многообещающими 21,23,25, первоначальная выгода часто уменьшается с течением времени 26-29. Аналогичная тенденция сообщается в мышиных инженерии сердечной ткани, которые показывают значительное функциональное преимущество за счет MSC добавок, но положительный результат не сохраняется при длительной культуре 1. В основе суб-оптимальную производительность наше ограниченное знание механизмов, регулирующих клеточной терапии. Более глубокое понимание того, как терапевтическое клетки оказывают свое благотворное влияние, а также возможные негативные последствия миоцитов-nonmyocyte взаимодействий, будет способствовать разработке усовершенствованных методов лечения, дающую клинически значимые и устойчивые преимущества, с минимальными побочными эффектами, для пациентов с сердечной недостаточностью.

Здесь мы опишем использование определенных hECTs для interrogпоел механизмы клеточной терапии. Композиция с контролируемым ткани имеет важное значение для выявления конкретных факторов, влияющих производительность кардиомиоцитов. Непосредственно дополняя hECTs с терапевтическим типа клеток , представляющих интерес (например, MSCs), может выявить влияние на работу сердца миоцитов, как мы показали в крысиных ЕКТС 1.

Следующий протокол многоэтапным начинается с направленной сердца дифференцировки стволовых клеток, с последующим изготовлением биореакторе с участием многих тканей, и заканчивая описанием конструкции ткани и функционального анализа. Наши эксперименты выполняются с использованием линии NIH утвержденных H7 человеческих эмбриональных стволовых клеток (чЭСК). Тем не менее, следующие протоколы также были протестированы с использованием дополнительной линии чЭСК и три индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) линии с аналогичными результатами. Мы обнаружили, что эффективность кардиомиоцитов дифференциации и успеха в производстве HECT может быть клеточная линия зависит, в частности, FOлинии г hiPSC, полученные из отдельных пациентов. Следуя этому протоколу, два 6-луночных планшетах высевают в общей сложности 1,68 млн ЭСК (140000 клеток на лунку), что дает примерно 2,5 млн миоциты после дифференциации в течение 20 дней и сортировки, достаточно, чтобы сделать шесть определенных тканей.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: Выполните все манипуляции клеток в асептических условиях с использованием шкаф биологической безопасности HEPA-фильтром класса II и стерилизовать все решения путем фильтрации их через фильтр 0,2 мкм. Выполнение строительно-монтажных тканей и тестирование функции в любом тех же асептических условиях или колпаком с ламинарным потоком.

1. Посев H7 ЭСК в рамках подготовки к кардиохирургии дифференциацию

  1. (День 1) Подготовка базальной мембраны Матрица
    1. Разморозить 150 мкл аликвоты чЭСК квалифицированных матрицы базальной мембраны на льду в течение ночи при температуре 4 ° С.
  2. (День 0-4) Покрытие из ЭСК на мелованной Плиты
    1. Развести талой матрицу в 12 мл ледяной DMEM / F12 и хорошо перемешать.
    2. Передача 1 мл раствора / F12-матрицы DMEM в каждую лунку 6-луночного культурального ткани обрабатывают блюдо. Каждый аликвоту матрицы может покрывать две 6-луночные планшеты.
    3. Инкубируйте пластины с нанесенным покрытием при комнатной температуре в течение по меньшей мере 1 ч.
      Примечание:наш опыт, блюда, покрытые запечатанные парафином можно хранить в матричном растворе при 4 ° С в течение до 10 дней перед использованием.
    4. Примерно 75% слияния, диссоциировать H7 ЭСК от 10 см чашку с использованием 6 мл реагента неферментативного диссоциации. Через 5 мин, осторожно скрести клетки с поверхности культуры с помощью одноразового использования клеточным скребком и передачи клеточной суспензии в стерильный 15 мл центрифужную пробирку.
    5. Удалить 0,5 мл диссоциации раствора с клетками из 15 мл трубки и передачи в новую стерильную 15 мл пробирку (оставляя 5,5 мл реагента диссоциации для дальнейшего диссоциировать ЭСК) для размножения клеток линии стволовых.
    6. Гранул 0,5 мл клеток при 300 мкг в течение 5 мин при температуре 20 ° С. Удалить супернатант и осторожно ресуспендируют в 8 мл плюрипотентных стволовых клеток среды , содержащей 1% пенициллина-стрептомицина , а затем перенести на новую, с покрытием, 10 см блюдо культуры ткани и поддержание 37 ° С и 5% CO 2 для поддержания линии стволовых клеток,
      Примечание: Держите плюрипотентных стволовых клеток СМИ на льду во время смены носителя.
    7. В то же время, добавьте 5,5 мкл 10 мМ ингибитора ROCK Y-27632 к оставшейся 5,5 мл диссоциации раствора и продолжают инкубировать при комнатной температуре в течение еще 5-10 мин. Аккуратно перемешайте клетки с 5 мл серологической пипеткой. Продолжали инкубировать до суспензии отдельных клеток не будет достигнуто, то в пробирке осадка клеток при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
    8. Ресуспендируют клеток в 5 мл среды плюрипотентных стволовых клеток и выполнять подсчет клеток с помощью гемоцитометра.
    9. Семенной каждую лунку блюдо 6-луночного при плотности 140000 клеток на лунку. Семенной две 6-луночные планшеты для создания в общей сложности шесть определенных тканей. Утилизацию оставшихся клеток после посева.
    10. Заполните хорошо 1 мл со средствами массовой плюрипотентных стволовых клеток и инкубировать при температуре 37 ° С, 5% СО 2. Двадцать четыре часа спустя, удалите носитель и добавьте 2 мл свежей плюрипотентных стволовых клеток средств массовой информации в каждую лунку (рис 1А ).
    11. Проверьте слияние пластин каждый день и начать дифференцировку как только клетки достигают примерно 75% слияния (рис 1B - D).

2. (День 4-24) Дифференциация эмбриональных стволовых клеток человека для кардиомиоцитов 30,31

  1. (День 4-7, Дифференциация день 0-3) Мезодерма Индукционная
    1. Подготовка RPMI дифференцировки I (таблица 1) путем объединения по 500 мл среды RPMI 1640 с 10 мл B27 добавки (без инсулина) и 5 мл пенициллина-стрептомицина маточного раствора (10 000 МЕ / мл пенициллина; 10000 мкг / мл стрептомицина). Аликвоты, на льду, в 50 мл пробирки и хранят при температуре 4 ° С.
    2. (4-й день, дифференцировка День 0) Подготовить среду для индукции мезодермы путем добавления 2,4 мкл небольшой ингибитора GSK3 молекулы CHIR99021 (10 мМ маточного, 6 мкМ конечной концентрации), в 12 мл RPMI дифференцировки I. Удалить плюрипотентных стволовых клеток носитель из каждой лункий заменить 2 мл мезодерма индукционной сред на лунку. Возвращение пластины в инкубатор.
      Примечание: Значительная гибель клеток , как правило , происходит при добавлении CHIR99021 (рис 1E). Монослой будет восстанавливаться, но важно, чтобы ополоснуть мертвые клетки прочь с DMEM / F12 полоскании.
    3. (5-й день, дифференцировка день 1) Подготовить свежие мезодерма среду для индукции, как описано выше. Удалите старые средства массовой информации из каждой лунки и промыть один раз с 1 мл DMEM / F12 на лунку. Добавляют 2 мл свежей мезодерма индукции СМИ в каждую лунку.
      Примечание: Промывка каждый день с первого дня 0-10 значительно увеличивает выход и чистоту кардиомиоцитов.
    4. (6-й день, дифференцировка 2-й день) Удалить сердечную среду для индукции и промыть один раз с 1 мл DMEM / F12 на лунку. Заменить полоскание 2 мл RPMI среде для дифференцировки I (не малые молекулы добавляли, но до сих пор с B27 (без инсулина) дополнения) и вернуться в инкубатор.
  2. (День 7-13, Дифференциация Daу 3-10) кардиальной мезодермы Индукционная
    1. (7-й день, 3-й день Дифференцировка) Подготовить кардиальной мезодермы среду для индукции путем добавления 6 мкл небольшой молекулы Wnt ингибитор IWR-1 (10 мМ маточных, 5 мкМ конечная) до 12 мл RPMI дифференцировки I.
    2. Извлеките носитель из каждой лунки, промойте один раз с 1 мл DMEM / F12 на лунку и заменить 2 мл сердечной мезодермы индукции сред на лунку.
    3. (8-й день, дифференцировка 4-й день) Подготовьте дополнительные 12 мл кардиальной мезодермы индукционных средах, как описано выше. Удалить СМИ добавляют за день до, промыть один раз с 1 мл DMEM / F12 на лунку и заменить 2 мл свежей сердечной мезодермы дифференцировки на лунку и вернуться в инкубатор.
    4. (День 9-10 Дифференциация День 5-6) На оба дня, удалите кардиальной мезодермы среду для индукции и промыть каждую лунку с 1 мл DMEM / F12.
    5. Добавляют 2 мл свежей RPMI среде для дифференцировки I (не малые молекулы не добавил, но до сих пор с B27 (без инсулина) дополнения)в каждую лунку и вернуть пластину в инкубаторе.
  3. (День 11-24, Дифференциация день 7-20) ЭСК происхождения Сердечный миоцитов Организация / Созревание
    1. Готовят среду RPMI дифференцировки II (таблица 1) путем объединения по 500 мл среды RPMI 1640 с 10 мл B27 дополнения (с инсулином) и 5 мл пенициллина-стрептомицина маточного раствора. Аликвоты, на льду, в 50 мл пробирки и хранят при температуре 4 ° С.
    2. (День 11, день 7 Дифференциация) Удалить RPMI дифференцировки (без инсулина) из каждой лунки и промыть 1 мл DMEM / F12. Заменить 2 мл новой средой RPMI дифференцировки II (с инсулином) в каждую лунку, и вернуться в инкубатор.
      Примечание: Самопроизвольное Избиение следует сначала наблюдается между дни 7 и 10. Если отбивки не наблюдается в течение этого времени, оно, как правило, указывает на плохую эффективность дифференциации. Протокол может быть продолжено до 15-го дня в попытке наблюдать избиение, но если не бьющееся не наблюдается на 15 день, лучше улискусство новой дифференциации.
    3. (День 12-24, Дифференциация день 8-20) Каждый день, удалить старые дифференцировки и заменить 2 мл свежей RPMI дифференцировки II на лунку , чтобы обеспечить созревание клеток и организацию бьющегося монослоя (рис 1F, видео Рисунок 1 ).
      Примечание: В зависимости от остаточной гибели клеток, это может быть необходимо, чтобы промыть 1 мл DMEM / F12 через дифференциацию 10-й день.

3. (24 день, 20 день Дифференцировка) Выделение кардиомиоцитов и фибробластоподобных клеток

  1. Разбить ячейки из монослоя
    1. Удалить дифференцировки и промыть один раз с 1 мл PBS.
    2. Диссоциировать монослоев с 1 мл ферментативного раствора диссоциации (0,04% трипсина / 0,03% ЭДТА) в каждую лунку.
    3. Перемещение пластины в инкубаторе в течение 10 мин. В то же время, добавить 12 мкл ингибитора ROCK к 6 мл трипсина нейтрализации раствора.
    4. GentlY добавляют 1 мл трипсина нейтрализации раствора, содержащего ингибитор ROCK в каждую лунку пластины для нейтрализации раствора трипсина.
    5. С помощью стерильной пипетки передачи, аккуратно перемешать каждую лунку распадаться кластеров клеток.
    6. Перенос всех 12 мл из 6-луночного планшета в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
      Примечание: Так как две 6-луночные планшеты используются в этом протоколе, будут необходимы две 15 мл пробирки.
    7. Передача 3 мл ФБС в одну лунку планшета, а затем последовательно передавать одни и те же 3 мл на каждой последующей скважины для сбора любых остаточных клеток на блюдо. Перенесите оставшиеся 3 мл из окончательного хорошо в том же 15 мл центрифужную пробирку, содержащую клетки.
    8. Гранула при 300 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
  2. Подготовка клетки для живого сортировки клеток FACS
    1. Подготовка буфера для окрашивания путем добавления 5 мл фетальной бычьей сыворотки в 45 мл PBS на льду 50 мкл ингибитора ROCK.
    2. Удалить супернатант из клеток PELпусть (в 3.1.8) и ресуспендируют в 1,2 мл буфера для окрашивания.
    3. Перенести 200 мкл клеточной суспензии на новый, предварительно охлажденный, 50 мл центрифужную пробирку на льду. Это будет отрицательный контроль окрашивания.
    4. Перенесите оставшийся 1 мл суспензии клеток к новой, предварительно охлажденный, 50 мл центрифужную пробирку на льду и добавляют по 2 мкл SIRPα-PE / Cy7 (1: 500 разведение) и 4 мкл CD90-FITC (1: 250 разведение) , Аккуратно перемешайте клеточную суспензию с пипеткой передачи и вернуться на лед.
    5. Инкубируют как отрицательный контроль и образец, на качалку шейкере, на льду, при температуре 4 ° С в течение 1 часа.
    6. Подготовьте для взятия проб труб путем добавления 3 мл RPMI сред (с инсулином) к двум 15 мл центрифужные пробирки. Добавьте 3 мкл ингибитора ROCK в каждую пробирку и хранить на льду.
    7. Гранул окрашенных клеток при 300 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С и дважды промыть, по меньшей мере 10 мл охлажденного на льду PBS на полоскание.
    8. Добавить 1 мкл DAPI (1 мкг / мл) в 5 мл окрашивающего буфера. нежноресуспендируют образца гранул с 1-3 мл DAPI содержащих окрашивающего буфера с использованием переноса пипеткой.
    9. Добавьте 500 мкл окрашивающего буфера (без добавления DAPI) с отрицательным контролем.
    10. Осторожно фильтровать как отрицательный контроль и образец через 40 мкм клеточный фильтр с, чтобы удалить сгустки клеток и передачи с полистиролом FACS труб на льду. Сразу принести образцы к клеточному сортировщика.
    11. Похожие на установленной живой клетке методы сортировки 18, используйте отрицательный контроль , чтобы установить ворота, выберите для живых клеток (DAPI отрицательный) и собрать как ФИТЦ + (т.е. CD90 + фибробласты) и PE / Cy7 + (т.е. SIRPα + кардиомиоциты ) независимо друг от друга популяций при 20 фунтов на квадратный дюйм (рисунок 2).
      Примечание: После установки ворот, отрицательный контроль может быть зафиксирована в 4% PFA для определения эффективности дифференциации путем окрашивания для сердечного тропонина-Т.
      Примечание: Некоторые исследователи предпочитают использоватьконтроль изотипа, а не неокрашенными управления, чтобы установить ворота, чтобы компенсировать для связывания неспецифического антитела. Контрольную так называемый флуоресценция минус один (FMO) другая возможность. Из-за четкой бимодальным распределением FITC, DAPI и сигналов РЕ-Cy7, мы закрытого типа от положительного населения, консервативно прицеливание далеко в положительные ворота, которые, возможно, исключает некоторые истинные позитивы, но помогает минимизировать любые ложных срабатываний.
  3. Cell реагрегация в рамках подготовки к тканевой инженерии
    1. После того, как клетки сорта, Шарик обе трубки сбора и ресуспендируют в 1 мл среды DMEM, содержащей 10% неонатальной бычья сыворотка, 1% пенициллина-стрептомицина и 0,2% амфотерицин В ( "НБС медиа").
    2. Рекомбинировать SIRPα + и CD90 + клеток в соотношении 3: 1 и пластинчатые объединенные клетки в культуре ткани , не обрабатывали чашку Петри при плотности 2 миллионов клеток на 60 см 2 (10 см чашку). Добавьте 10 мл NBS средств массовой информации и 101; л ингибитора ROCK Y-27632.
    3. Поместите суспензию клеток в культуре ткани инкубаторе в течение 48 часов, чтобы позволить клеток реагрегация небольшие кластеры.

4. Человеческий Сердечный тканевая инженерия

  1. Изготовить биореакторе Multi-ткани
    Примечание: В дополнение к иллюстрации на рисунке 3A, CAD - файлы с подробными биореакторе проектирования схемы могут быть предоставлены по запросу от авторов.
    1. Обработка PDMS мастер-формы путем бурения шесть равномерно расположенных отверстий диаметром 0,5 мм в 9 х 33 х 3,25 мм параллелепипеда из политетрафторэтилена.
    2. С помощью концевой фрезы, машины кадр из полисульфона измерения 25 х 35 х 11 мм 3. Цель кадра держать посты PDMS (сконструированных из литого сделанного выше) в соответствие с лунках в опорной плите.
    3. С помощью 1-мм концевой фрезы, машинные 6 лунок (6 х 1 х 1 мм 3), 4 мм друг от друга в 20 х 40 х 5 мм 3 кусок черного политетрафторэтилена, чтобы сформировать опорную плиту.
    4. Смешайте эластомерной основы и отвердителя для полидиметилсилоксана (PDMS) в 10: 1 вес / вес отношение и добавить к пользовательской формы политетрафторэтилена (этап 4.1.1), чтобы создать два ряда из шести силовых зондирования постов и инкубировать в течение ночи и под вакууме при 80 ° С. После отверждения, аккуратно удалите PDMS из основной формы и тщательно пометить вершины каждого поста с черным перманентным маркером для повышения контраста и автоматического реального времени отслеживать отклонения пост.
      Примечание: Фторопласт является достаточно мягким и может быть легко повреждены. Будьте осторожны при чистке мастер формы до PDMS литья для обеспечения долговечности системы и последовательного PDMS почтовой геометрии. 0,5 мм провод может быть использован для очистки отверстия для должностей после каждого использования, но будьте осторожны, чтобы не поцарапать внутреннюю поверхность отверстия.
      Примечание: альтернатива дегазировать PDMS в вакууме в течение нескольких часов при комнатной температуре, а затем отверждения смеси при атмосферном давлении.Это может привести к уменьшению количества остаточных пузырьков газа, образующихся в PDMS в процессе отверждения.
    5. Стерилизовать всех компонентов в паровой автоклав.
      Примечание: мастер-формы PDMS (этап 4.1.1) и полисульфон кадра (этап 4.1.2) оба многоразового использования. В PDMS сообщения, созданные из литой (этап 4.1.4) также многоразового использования, но только в течение примерно 10 применений. Тем не менее, все больше PDMS должности могут быть созданы по мере необходимости с помощью мастер-формы.
  2. Сбор Reaggregated клеток сердца
    1. Удалите reaggregated клетки из инкубатора и передавать все 10 мл реагрегация сред в центрифужную пробирку на 50 мл.
    2. Промыть пластину с 3 мл PBS и переносят смыв в той же 50 мл центрифужную пробирку, содержащую реагрегация носитель.
    3. Добавьте 3 мл 0,04% трипсина / 0,03% ЭДТА до 10 см чашку и вернуться в инкубаторе в течение 5 мин.
    4. Через 5 минут, проверьте пластину с перевернутой сложного микроскопа при 10-кратным увеличением, чтобы обеспечить полное dissocia клетокния от блюда. Если какие-то остаточные кластеры все еще прикреплены, аккуратно перемешивать тарелку отделяться комки. Если кластеры остаются прикрепленными, вернитесь в инкубаторе в течение еще 2-3 мин. Не инкубировать дольше, чем десять минут или значительную гибель клеток может произойти.
    5. После того, как все клетки отделяют, добавляют 3 мл трипсина нейтрализации раствора. Аккуратно перемешайте нейтрализации раствора с раствором трипсина-клеток и переноса в 50 мл центрифужную пробирку, содержащую реагрегация носитель и промыть один раз PBS.
    6. Промыть всю тарелку с 5 мл PBS и переносят в той же 50 мл пробирку, содержащую клетки.
    7. Гранул клетки при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
    8. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 1 мл NBS сред, а затем перенести в 1,5 мл трубки микроцентрифужных.
    9. Гранул при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре и удалить супернатант. Сердечные клетки (CD90 + клетки стромы и SIRPα + myocytes) теперь готовы к строительству ткани.
  3. (Необязательно) Сбор Справочная интересующих клеток
    Примечание: В дополнение к определенных тканей , содержащих только SIRPα + кардиомиоцитов и CD90 + фибробластоподобные клетки, можно добавить дополнительные ячейки , представляющие интерес для опрашивать их воздействие на функции тканей. Например MSCs крысах было показано, усиливает функцию крыс инженерии сердечной ткани 1. Следующий необязательный этап описывает набор дополнительных ячеек для определенной системы.
    1. Соберите дополнительный тип клеток , представляющих интерес (например, мезенхимальных стволовых клеток) с использованием 0,25% трипсина / 0,1% ЭДТА.
    2. Гранул клетки при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре, затем ресуспендируют в 5 мл соответствующей среды для культивирования клеток для типа клеток, представляющих интерес. Например, для ПКЦ, использовать DMEM, дополненной 20% фетальной бычьей сыворотки, 1% пенициллина-стрептомицина и 0,2% амфотерицина-В культуре с-гезов.
    3. Выполнить подсчет клеток с помощью гемоцитометра, затем в пробирке осадка клеток снова при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
    4. Удалить супернатант, ресуспендируют в 1 мл среды для культивирования клеток и переноса в 1,5 мл трубки микроцентрифужных.
    5. Гранул клетки при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
    6. Удалить супернатант. Добавочные клетки теперь готовы к конструкции ткани.
      Примечание: если Добавочные клетки добавляют в концентрации 10% от общего числа клеток в ткани, то для определенных тканей, это потребует 50000 дополнительных клеток на ткани, а каждая ткань содержит 500000 кардиальные клетки (как клетки CD90 + стромальных и SIRPα + миоциты).
  4. Создание сконструированного сердечной ткани человека
    Примечание: Храните все решения на льду и клетки при комнатной температуре. Все тома, перечисленные ниже, в ткани. Как правило, около шести ткани могут быть построены из двух 6-хорошо мн.ч.Атес сердечных дифференцировок.
    1. Развести 60,0 мкл 5 мг / мл коллагена запаса до 3,125 мг / мл с 1,5 мкл 1 М NaOH, 9,6 мкл 10х PBS и 24,9 мкл стерильной сверхчистой деионизированной воды.
      Критический шаг: Избегайте введения пузырьков воздуха для каждого раствора в процессе приготовления, как пузырьки воздуха будут нарушать формирование правильной ткани.
    2. Добавить 12,0 мкл 10х обоих MEM и 0,2 N HEPES рН 9 к разбавленным коллагеновой смеси для создания коллагена смеси. Добавлять оба раствора вниз по стороне 15 мл центрифужную пробирку с тем, чтобы избежать введения пузырьков воздуха в коллагеновую смесь.
    3. Добавьте матрицу базальной мембраны до конечной концентрации 0,9 мг / мл до коллагеновой смешивать и хранить на льду, чтобы создать смесь окончательной ткани. Конечная концентрация коллагена должна быть 2 мг / мл.
    4. Добавить 500000 из reaggregated клеток в смесь ткани (миоцитов + концентрация фибробласты составляет 20 млн / мл) и заполнить до конечного объема 25 мкл наткани либо с бесклеточных средах NBS или 50000 клеток дополнительного типа клеток , представляющих интерес (например, hMSCs) и хорошо перемешать , чтобы сформировать даже клеточную суспензию.
      Примечание: Число дополненной клеток будет варьироваться от для различных областей применения. Здесь используется 10% добавок.
    5. С осторожностью, пипетки по 25 мкл суспензии клеток в каждую из шести лунок в биореакторе опорной плите, без введения пузырьков воздуха в скважину.
    6. Нажмите два ряда датчиков ПДМС силы на обе стороны от полисульфона рамы, образуя 6 пар противоположных постов, а затем инвертировать рамку на верхней части опорной плиты так, что одна пара сообщений поступает в каждую лунку, содержащую суспензию клеток.
      Примечание: полисульфон кадр включает вкладки, чтобы помочь в выравнивании PDMS.
    7. Осторожно поместите биореактор, опорную плиту вниз, в 60 мм блюдо, а затем поместить блюдо без его покрытия внутри 10 см блюдо, поместите 10 см крышку на верхней части, и переместить весь узел биореакторев культуральную инкубаторе ткани, ожидая двух часов для ткани в гель.
    8. Через 2 часа, удалить биореактор из инкубатора и добавить 14 мл NBS сред на всей сборки, достаточно, чтобы покрыть опорную плиту. Возвращение в инкубатор, а также изменить половина средств массовой информации каждый день.
    9. Сорок восемь часов спустя, осторожно снимите опорную плиту, осторожно перемещая каждую сторону опорной плиты от рамы на несколько миллиметров, в то время, смены носителя, а затем вернуть биореактор, ткани лицевой стороной вниз, в средствах массовой информации.
    10. Продолжить изменение половину средств массовой культуры NBS каждый день.
      Примечание: Спонтанные сокращени ткани можно наблюдать уже через 3 дня после того, как строительство ткани, создавая измеримые сокращающиеся силы уже в 5-й день до 7.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для получения кардиомиоцитов, слегка модифицированной версией методов дифференциации Boheler и Lian используется 30,31. Крайне важно, что дифференциация начинается во время логарифмической фазы роста клеток, но и о том, что начиная население достаточно сливающийся, чтобы получить годную к употреблению количество клеток после сортировки (приблизительно 75% является оптимальным). Как правило, для H7 ЭСК, металлизации при плотности 140000 ЭСК на лунку блюдо 6-луночного незаменимыми 8 средств массовой информации ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Строительство определенных инженерных сердечных тканей человека (HECT) может обеспечить более последовательную и надежную модель человеческого сердца функции кардиомиоцитов. Чрезвычайно важно, все клеточные и внеклеточные компоненты системы, как известно, и ими можно манипулировать как желательно, таким образом, удаляя смешанное влияние других неизвестных типов клеток в результате процесса дифференцировки. Для того, чтобы сбалансировать быстрый рост клеток и высокий выход, то предпочтительно, чтобы дифференциация начина...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана NIH (1F30HL118923-01A1) к ТСК, NIH / NHLBI PEN контракта HHSN268201000045C к KDC, исследование гранта совета Гонконга ТРС T13-706 / 11 (KDC), NIH (R01) HL113499 к БДГ, американец Ассоциация сердца (12PRE12060254) к RJ, и научно-исследовательский совет Грант ОАРГ (TBRS, T13-706 / 11) RL Дополнительное финансирование было предоставлено ТСК по NIH DRB 5T32GM008553-18 и как стажировке на NIDCR-междисциплинарной подготовки кадров в области систем и связанных с развитием Биология и врожденным дефектам T32HD075735. Авторы также хотели бы с благодарностью признать Артура Autz в The Zahn центре города Колледж Нью-Йорка за помощь с обработкой биореактор и Mamdouh Eldaly об оказании технической помощи. Мы также благодарим доктора Кеннета Boheler за советом по сердечной дифференциации и доктор Джошуа Зайца за щедрое предоставление мезенхимальных стволовых клеток человека.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Cell Culture<strong>CompanyНомер в каталогеComments
Amphotericin BSigma-AldrichA2411Приготовьте запас 2,5 мг/мл в ДМСО и отфильтруйте-стерилизуйте
B27 с помощью InsulinLife Technologies17505055
B27 без инсулинаLife TechnologiesA1895601
CHIR99021Stemgent04-0004Create 6 μ M stock, затем aliquot и хранить при -20  °C.
Essential 8 MediaLife TechnologiesA1517001
H7 Эмбриональные стволовые клетки человекаWiCellWA07
hESC Qualified Matrix, Corning MatrigelCorning354277Размораживание на льду при температуре 4 ° град; C на ночь, затем аликвота 150 μ в отдельные пробирки и хранить при -20  °C.
IWR-1Sigma-AldrichI0161Создание 10 мМ запаса и аликвота. Хранить при -20 °deg;
C Неонатальная сыворотка теленкаLife Technologies16010159
Реагент для неферментативной диссоциации: Щадящий реагент для диссоциации клетокТехнологии стволовых клеток7174
Пенициллин-стрептомицинCorning30-002-CI
RPMI 1640Life Technologies11875-093Хранить в холодильнике
Y-27632 (ингибитор ROCK)Stemgent04-0012Ресуспендирование до концентрации 10 мМ в запасе, аликвота и хранение при -20  °C. Избегайте циклов замораживания, оттаивания.
Cell Sorting>CompanyНомер в каталогеКомментарии4
',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)Life TechnologiesD1306
CD90-FITCBioLegend328107
Реагент для ферментативной диссоциации: Cell Detach Kit I (0,04 % трипсина/ 0,03 % ЭДТА, раствор нейтрализации трипсина и буферный раствор соли Хэнкса)PromoCellC-41200
Фетальная бычья сывороткаAtlanta BiologicsS11250
SIRPα-PE/Cy7BioLegend323807
Tissue ConstructionCompanyНомер в каталогеКомментарии
0,25% Трипсин/0,1% ЭДТАFisher Scientific25-053-CIОпционально: Для сбора интересующих дополнительных клеток
10x MEMSigma-AldrichM0275-100ML
10x PBS PacketsSigma-AldrichP3813
Collagen, Bovine Type ILife TechnologiesA10644-01Keep on ice
DMEM/F12Life Technologies11330057
Дульбекко s Модифицированная среда Eagles (DMEM), с высоким содержанием глюкозыSigma-AldrichD5648
полидиметилсилоксан (PDMS)Dow CorningSylgard 184
HEPES натрияSigma-AldrichH3784
гидроксид натрияSigma-Aldrich221465
МатериалыCompanyКаталожный номер<strong>Комментарии
1,5 мл микроцентрифужные пробиркиFisher ScientificNC0536757
15 мл полипроиленовая центрифужная пробиркаCorning352096 5
мл полистирольная трубка с круглым дномCorning352235со встроенным 35 μ m клеточный фильтр
50 мл полипроиленовая центрифужная пробиркаCorning352070
6-луночный планшет с плоским дном обработанной культурой тканейCorning353046
Скребок для клеток, одноразовыйBiologix70-2180
ПолисульфонMcMaster-Carr
Политетрафторэтилен (тефлон)McMaster-Carr
EquipmentCompanyНомер в каталогеКомментарии
Препарирующий микроскопOlympusSZ-61или аналогичный, должен иметь крепление для высокоскоростной камеры для крепления
Электрическая система электростимуляцииAstro-Med, IncGrass S88X Stimulator
High Speed ФотоаппаратPixelinkPL-B741Uили аналогичный, но должен иметь частоту 100 кадров в секунду для точного сбора данных
температуры пластиныИспользуется для поддержания температуры среды во время сбора данных.
Custom MaterialsCompanyКаталожный номер>Комментарии
LabView Программадоступна по запросу авторов
Контроль пост-трекинга

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Serrao, G. W., et al. Myocyte-depleted engineered cardiac tissues support therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Part A. 18 (13-14), 1322-1333 (2012).
  2. Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circ. Res. 107 (1), 35-44 (2010).
  3. Fink, C., Ergün, S., Kralisch, D., Remmers, U., Weil, J., Eschenhagen, T. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB J. 14 (5), 669-679 (2000).
  4. Yildirim, Y., et al. Development of a biological ventricular assist device: preliminary data from a small animal model. Circulation. 116, Suppl 11. 16-23 (2007).
  5. Sekine, H., et al. Cardiac Cell Sheet Transplantation Improves Damaged Heart Function via Superior Cell Survival in Comparison with Dissociated Cell Injection. Tissue Eng. Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).
  6. Lesman, A., et al. Transplantation of a tissue-engineered human vascularized cardiac muscle. Tissue Eng. Part A. 16 (1), 115-125 (2010).
  7. Turnbull, I. C., et al. Advancing functional engineered cardiac tissues toward a preclinical model of human myocardium. FASEB J. 28 (2), 644-654 (2014).
  8. Thavandiran, N., Dubois, N., et al. Design and formulation of functional pluripotent stem cell-derived cardiac microtissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (49), 4698-4707 (2013).
  9. Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PloS One. 6 (10), e26397(2011).
  10. Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ. Res. 109 (1), 47-59 (2011).
  11. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
  12. Ma, Z., et al. Three-dimensional filamentous human diseased cardiac tissue model. Biomaterials. 35 (5), 1367-1377 (2014).
  13. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J. Cell Sci. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  14. Pontes Soares, C., Midlej, V., de Oliveira, M. E. W., Benchimol, M., Costa, M. L., Mermelstein, C. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PloS One. 7 (5), e38147(2012).
  15. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
  16. Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. A., Elefanty, A. G., Kamp, T. J. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ. Res. 111 (3), 344-358 (2012).
  17. Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells Dev. 19 (6), 783-795 (2010).
  18. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnol. 29 (11), 1011-1018 (2011).
  19. Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. J. Mol. Cell. Cardiol. 42 (5), 991-1000 (2007).
  20. Gago-Lopez, N., et al. THY-1 receptor expression differentiates cardiosphere-derived cells with divergent cardiogenic differentiation potential. Stem Cell Reports. 2 (5), 576-591 (2014).
  21. Hare, J. M., Traverse, J. H., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J. Am. Coll. Cardiol. 54 (24), 2277-2286 (2009).
  22. Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
  23. Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomised controlled clinical trial. Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).
  24. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial--a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart. J. 152 (3), 434-441 (2006).
  25. Jeevanantham, V., Butler, M., Saad, A., Abdel-Latif, A., Zuba-Surma, E. K., Dawn, B. Adult bone marrow cell therapy improves survival and induces long-term improvement in cardiac parameters: a systematic review and meta-analysis. Circulation. 126 (5), 551-568 (2012).
  26. Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: 5-year follow-up from the randomized-controlled BOOST trial. Eur. Heart J. 30 (24), 2978-2984 (2009).
  27. Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: eighteen months' follow-up data from the randomized, controlled BOOST (BOne marrOw transfer to enhance ST-elevation infarct regeneration) trial. Circulation. 113 (10), 1287-1294 (2006).
  28. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).
  29. Simari, R. D., et al. Bone marrow mononuclear cell therapy for acute myocardial infarction: a perspective from the cardiovascular cell therapy research network. Circ. Res. 114 (10), 1564-1568 (2014).
  30. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. J. Vis. Exp. (91), e52010(2014).
  31. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (27), 1848-1857 (2012).
  32. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PloS One. 6 (4), e18293(2011).
  33. Kean, T. J., Lin, P., Caplan, A. I., Dennis, J. E. MSCs: Delivery Routes and Engraftment, Cell-Targeting Strategies, and Immune Modulation. Stem Cells Int. , 732742(2013).
  34. Trachtenberg, B., et al. Rationale and design of the Transendocardial Injection of Autologous Human Cells (bone marrow or mesenchymal) in Chronic Ischemic Left Ventricular Dysfunction and Heart Failure Secondary to Myocardial Infarction (TAC-HFT) trial: A randomized, double-blind, placebo-controlled study of safety and efficacy. Am. Heart J. 161 (3), 487-493 (2011).
  35. Williams, A. R., et al. Intramyocardial stem cell injection in patients with ischemic cardiomyopathy: functional recovery and reverse remodeling. Circ. Res. 108 (7), 792-796 (2011).
  36. Razeghi, P., Young, M. E., Alcorn, J. L., Moravec, C. S., Frazier, O. H., Taegtmeyer, H. Metabolic gene expression in fetal and failing human heart. Circulation. 104 (24), 2923-2931 (2001).
  37. Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis. Heart Fail. Rev. 12 (3-4), 331-343 (2007).
  38. Taegtmeyer, H., Sen, S., Vela, D. Return to the fetal gene program: a suggested metabolic link to gene expression in the heart. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1188, 191-198 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Engineered Cardiac TissueLive Cell SortingSIRP Alpha MarkerCD90 Fibroblast MarkerCollagen Based MatrixBioreactor SystemMesenchymal Stem CellsContractile Force MeasurementTissue CompactionFACS Collection

Related Articles